חולדה גדילה לוח צמיחת דגם אפיון מנגנוני תיקון ולהעריך צמיחה צלחת רגנרציה אסטרטגיות

Summary

צלחת הצמיחה היא אזור סחוס בעצמות ארוכות של ילדים, שם מתרחשת צמיחה אורכית. כאשר נפגעים, רקמה גרמית יכולה ליצור ולפגוע בצמיחה. אנו מתארים מודל חולדה של פציעה צלחת הצמיחה המוביל לרקמות תיקון גרמי, המאפשר מחקר של מנגנוני תיקון וצמיחה גדילה אסטרטגיות התחדשות.

Abstract

שליש מכל השברים בילדים כרוכים בצלחת הצמיחה ויכולים לגרום לצמיחת עצם. צלחת הצמיחה (או physis) היא רקמת הסחוס למצוא בסוף כל העצמות הארוכות בילדים כי הוא אחראי על צמיחה העצם האורך. לאחר פגום, רקמת סחוס בתוך צלחת הצמיחה יכול לעבור ousification מוקדמת ולהוביל לרקמת תיקון גרמית לא רצויות, אשר יוצר "גרמי בר". במקרים מסוימים, זה גרמי בר יכול לגרום לעיוותים הצמיחה העצמית, כגון עיוות זוויתי, או שזה יכול לעצור לחלוטין את צמיחת העצם האורך. אין כיום טיפול קליני שיכול לתקן לחלוטין את צלחת הצמיחה הפגועה. שימוש במודל חיה של פציעה צלחת הצמיחה כדי להבין טוב יותר את המנגנונים ביסודו של היווצרות בר גרמי כדי לזהות דרכים לעכב אותו היא הזדמנות מצוינת לפתח טיפולים טובים יותר עבור פציעות צלחת הצמיחה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשבש את צלחת הצמיחה טיבאלי פרוקסימלי עכברוש באמצעות פגם חור המקדח. זה smaLl מודל בעלי חיים אמין מייצר בר גרמי יכול לגרום לעיוותים הצמיחה דומה לאלה לראות ילדים. מודל זה מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים של היווצרות בר גרמי ומשמש כאמצעי לבחון אפשרויות טיפול פוטנציאליים עבור פציעות צלחת הצמיחה.

Introduction

פציעות גדילה בצמיחה הינן 30% מכלל השברים בילדים, ועלולות לגרום לפגיעה בצמיחת העצם. בנוסף לשברים, פציעות של צלחת גדילה עלולות להיגרם על ידי אטיולוגיות אחרות, כולל אוסטאומליטיס ² , גידולי עצם ראשוניים ³ , קרינה וכימותרפיה ⁴ , ופגיעה באיטרוגניק ⁵ . צלחת הצמיחה (או physis) היא אזור הסחוס בסוף העצמות הארוכות של ילדים, כי הוא אחראי על הצמיחה העצמית האורך. זה כוננים התארכות העצם דרך ousification endochondral; Chondrocytes עוברים התפשטות היפרטרופיה והם משודרגים אז על ידי osteoblasts נכנסות ליצירת עצם trabecular ⁶ . צלחת הצמיחה היא גם שטח חלש של השלד המתפתח, מה שהופך אותו נוטה לפציעה. הדאגה העיקרית עם שברים צלחת הצמיחה או פציעות היא כי רקמה הסחוס פגום בתוך צלחת הצמיחה יכול bE החליף עם רקמת תיקון גרמי לא רצויות, הידוע גם בשם "בר גרמי". בהתאם לגודלו ומיקומו בתוך צלחת הצמיחה, הבר הגרמי יכול להוביל לעיוותים זוויתיים או למעצר גדילה מלא, משוררת הרסנית לילדים צעירים שטרם הגיעו לגובהם המלא.

אין כרגע טיפול שיכול לתקן לחלוטין את צלחת הצמיחה הפגועה. ברגע שהטופס הגרמי יוצר, על הקלינאי להחליט האם להסיר אותו באופן כירורגי ⁸ . חולים עם לפחות 2 שנים או 2 ס"מ של צמיחה השלד שנותר עם בר גרמי כי משתרע פחות מ 50% של אזור צלחת הצמיחה הם בדרך כלל מועמדים כריתה גרמית ⁸ . ניתוח כירורגי של הבר הגרמי הוא לעתים קרובות ואחריו interposition של שתל אוטולוגי שומן כדי למנוע רפורמציה של הרקמה הגרמית כדי לאפשר את צלחת הצמיחה uninjured שמסביב כדי להחזיר את הצמיחה. עם זאת, טכניקות אלה הם problEmatic ולעתים קרובות נכשל, המוביל הישנות בר גרמי והמשך השפעה שלילית על הצמיחה ⁹ . יש צורך קריטי לפתח טיפולים יעילים, כי לא רק למנוע היווצרות בר גרמי, אלא גם לחדש את הסחוס צלחת הצמיחה, ובכך להחזיר את התארכות העצם הנורמלית.

המנגנונים המולקולריים שבבסיס היווצרות הבר הגרמי עדיין לא הוסברו במלואם. הבנה טובה יותר של מנגנונים ביולוגיים אלה עלולה להוביל להתערבויות טיפוליות יעילות יותר עבור ילדים הסובלים מפציעה בצמיחה. מאז לומד מנגנונים אלה בבני אדם קשה, מודלים בעלי חיים שימשו, במיוחד את המודל חולדה של פציעה צלחת ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} . השיטה המוצגת כאןנייר מתאר כיצד פגם חור לקדוח בצלחת הצמיחה חולדה tibial מוביל לרקמות תיקון צפוי לשחזור שמתחיל ousification מוקדם כמו 7 ימים לאחר הפציעה ואת טופס בר בוגרת מלאה עם שיפוץ ב 28 ימים לאחר הפציעה ¹⁰ . זה מספק חיה קטנה במודל vivo שבו ללמוד את המנגנונים הביולוגיים של היווצרות בר גרמי, כמו גם להעריך טיפולים חדשניים שיכולים למנוע את הבר הגרמי ו / או לחדש את הסחוס הצלחת הצלחת. לדוגמה, מודל זה יכול לשמש כדי לבדוק biomaterials chondrogenic שיכולים לצמוח מחדש סחוס הצלחת הצמח ולהציע טיפול בעל ערך עבור ילדים הסובלים פציעות צלחת הצמיחה. הטכניקות המובאות במאמר זה יתארו את השיטות הכירורגיות המשמשות לייצור הפציעה של צלחת הצמח ואת המשלוח הבא של biomaterials לאתר הפציעה. נדון גם בשיטות להערכת היווצרות בר גרמית ולתיקון רקמות.

Protocol

כל בעלי החיים נהלים חייב להיות מאושר על ידי המוסד המקומי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (IACUC). פרוטוקול בעלי חיים עבור ההליך הבא אושרה על ידי אוניברסיטת קולורדו דנבר IACUC.

1. להשיג חולדות

הערה: אם אין צורך בבעלי חיים מהונדסים גנטית, יש צורך בעכברושים של Sprague-Dawley, בני שישה שבועות, בזמן ניתוח. זנים אחרים עשויים לשמש; עם זאת, רוב המחקרים שפורסמו בוצעו על חולדות Sprague-Dawley.

2. הכנת אספקה ​​כירורגי

1. אוטוקלאב אספקת חבילות ניתוח הכוללים אחד מכל אחד: # 3 אזמל ידית, מחזיק מחט, מלקחיים אדסון, ומספריים איריס.
2. החיטוי chucks המקלדת keyless. צ 'אקים מקדחה עשוי להיות חרוז מעוקר בין ניתוחים בבעלי חיים בעת ההפעלה על בעלי חיים מרובים.
   הערה: הכללים המקומיים IACUC הנוגעים לשימוש של ניתוח סטריליכלים דתיים על בעלי חיים מרובים חייב להיות דבק. לדוגמה, אוניברסיטת קולורדו דנבר IACUC מאפשר לכלי אחד כירורגי להגדיר לשמש עד 5 בעלי חיים לפני ההפסקה שלהם. יתר על כן, כלי ניתוח חייב להיות מעוקרים בחום באמצעות מעקר חרוז בין בעלי חיים. חבילות ניתוח נוספות סטריליות יש להשתמש עבור כל בעלי חיים נוספים.
3. החיטוי 5 ס"מ סטיינמן סיכות, אחד לכל חיה.
   הערה: כדי להפחית את הסיכון לזיהום, אסור להשתמש בסיכות של שטיינמן לבעלי חיים מרובים.
4. החיטוי 1.8 מ"מ burs שיניים, אחד לכל חיה.
   הערה: על מנת להקטין את הסיכון לזיהום, אין להשתמש בבורות השיניים לבעלי חיים מרובים.
5. החיטוי הפצע קליפ הפצע, אם רלוונטי. לחלופין, התפרים קבור ניתן להשתמש כדי לסגור את השכבה עורית. ראה שלב 7.3.
6. אם אפשר, לעקר תרגיל סיבוב באמצעות קרינה או עיקור גז.
7. אסוף את הציוד הנוסף הבא: מכונת גילוח חשמלית, סטיםריל 3-0 חומצות polyglycolic חומצה, גזה סטרילית, פובידון יוד, מלוחים סטריליים, סטרילי 10 מ"ל מזרקים, סטרילי 23 מד מחטים, ספוגי אלכוהול isopropyl, isoflurane, calipers, לאחר כירורגית משככי כאבים ( למשל, NSAIDs ו buprenorphine) וילונות כירורגי סטרילית, כפפות כירורגי סטרילית, סטרילי # 15 להבים אזמל, קליפים פצע סטרילית, מכונת הרדמה, מעקר חרוז, כרית התחממות, underpads סופג.

3. הרדמה והכנת בעלי חיים

1. להרדים את החיה על ידי הצגתו בתא אינדוקציה 1- 2-L קבלת 1 ליטר / זרימת חמצן מינימלי עם 5% isoflurane ממערכת vaporizing עם מערכת scavenging פסיבית.
   הערה: חשיפה 5% isoflurane צריך להרדים חולדות בן שישה שבועות בתוך 5 דקות.
2. להעביר את החיה לאתר כירורגית ולשמור על החיה תחת הרדמה עם isoflurane 2 - 3% באמצעות חרוט האף עבור שאר ההליך. מניחים את חזית החיה על כרית ההתחממות ואת לספוגחלונות.
   הערה: החיה לא צריך להיות קבוע לשולחן כירורגית. החזקת הרגל כמפורט בשלבים הבאים היא שיטה מספקת של ייצוב.
   הערה: כל ההליכים הבאים הם להיעשות עם החיה תחת הרדמה. 2 - 3% isoflurane צריך להיות מספיק כדי לשמור על הרדמה חולדות בגיל זה. זה יכול להיות מאושר על ידי בדיקת רפלקס נסיגה דו ביפדית.
3. ניהול משככי כאבים תוך ניתוחיים בהתאם למדיניות שאושרה מוסדית ( למשל בופרנורפין ב 0.05 מ"ג / ק"ג ו carprofen ב 5 מ"ג / ק"ג).

הכנת הטיביה לכירורגיה

1. לגלח את כל הרגל האחורי (ים) מן malleolus המדיאלי לאגן עם מכונת גילוח חשמלית.
2. למדוד ולהקליט את אורך tibial מן הרמה tibial הקדמי אל הצד התחתון של malleolus המדיאלי באמצעות מחוגה. לחלופין, למדוד את אורך tibial כולו באמצעות רנטגן או microCT ¹¹ Sup> ^{, 12 , 14} . לחלופין, למדוד ממדי הצלחת הצמיחה לפני הניתוח באמצעות רנטגן או microCT.
3. נקו את האתר כירורגית על ידי ניגוב כל הרגל (ים), הבטן, ואת אברי המין עם ספוגי אלכוהול ולאחר מכן עם גזה povidone- יוד ספוג.
   הערה: כדי למזער את הסיכון לזיהום, כל ההליכים הבאים, עד שהבעל יוסר מהרדמה (שלב 7.4), חייבים להיעשות בתנאים סטריליים. כל החומרים כירורגית יש לגשת באמצעות טכניקה סטרילית. השימוש של עוזר כירורגי מומלץ מאוד לשמור על סטריליות לאורך כל הניתוח.
4. לובש כפפות כירורגי סטרילית, במקום וילון כירורגי סטרילי fenestrated על החיה, עוזב את הרגל (ים) חשוף דרך הנתיחה המרכזית.

5. הליך כירורגי כדי לגשת לצמיחה לוח

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
איור 1: סקירה כללית של הנוהל הכירורגי.
א) מיקום של כמה סמנים אנטומיים המשמשים ליצירת פגיעה מוצלחת בצלחת הצמיחה. הקפסולה בברך היא מיד אחורית לברך (לבן), המפריד בין השוקה לבין עצם הירך. צלחת הצמיחה השנתית (אדום כהה) נראית פחות נחותה לברך את הברך ולעקוף את השוקה. צלחת הצמיחה הפרוקסימלית היא מטוס שטוח בעיקר, למעט הרובע הקדמי היוצר מטוס אלכסוני. הצומת של שני מטוסים אלה יוצר את זווית צלחת הצמיחה, אשר משמש עבור זווית התרגיל המתאים. ההכנסה semitendinosus הוא שם שריר הארבעי מוסיף את השוקה האחורית. ב) חתך דרך ההיבט הקדמי-המדיאלי של רקמות רכות טיביאליות כדי לגשת עצם קליפת המוח. C) המיקום של החלון קליפת המוח באמצעות יישור עם הכניסה semitendinosus דיסטלי כנקודת התייחסות. ד) הערכהאת עומק הפגיעה על ידי יישור את שפוע על בור שיניים עם חלון קליפת המוח.

1. לעשות חתך ~ 1 ס"מ דרך העור לאורך ההיבט המדיאלי הקדמי של tibia הפרוקסימלי באמצעות ידית אזמל # 3 ו להב 15 #, החל בקצה הדיסטלי של קונדייל הירך המדיאלי ( איור 1 א ).
   1. משוך את העור חזק כנגד העצם הבסיסית והחזק את הרגל בחוזקה תוך ביצוע החתך.
      הערה: זה ישמור על חתך העור במיקום הרצוי יסייע ביצירת חתך נקי. אל תלחץ חזק מדי עם מנתח כדי למנוע ניקוב הקפסולה הברך, אשר יוביל דימום פזרני יעשה את הצעדים הנותרים קשה.
2. שים לב של סמנים אנטומיים חשובים, כולל: 1) צלחת הצמיחה, 2) זווית צלחת הצמיחה, 3) את הקפסולה הברך, ו 4) ההכנסה semitendinosus ( איור 1 א ).
3. בעזרת איזמל, לעשות חתך ~ 0.5 ס"מ דרך thE fascia ורקמות רכות על ההיבט המדיאלי הקדמי של tibia הפרוקסימלי, מצלחת הצמיחה לתחתית החתך בעור ( איור 1 ב ).
4. בעדינות לנתח או לגרד משם fascia ו רקמות רכות מן השוקה באמצעות אזמל ( איור 1 ב ).
   הערה: חשוב להסיר או לגרד כמו רקמות רכות מן tibia ככל האפשר, כדי לא להפריע הצעדים הקידוח.
5. לקדוח חלון קליפת המוח באמצעות עצם קליפת המוח הטיביאלית בדיאפיזה עם סיכת שטיינמן מחוברת לכלי סיבוב ב -10,000 סל"ד (מהירות נמוכה של הכלי הסיבובי המצוין בסעיף החומרים). צור את החלון קליפת המוח כך שהוא יישור עם הכניסה semitendinosus דיסטלי ( איור 1C ).
   1. להחזיק את התרגיל בניצב לדיאפיזה הטיבאלית ולתחקר באיטיות, נזהר לא לקדוח דרך הצד השני של הדיאפיזה; את החלון קליפת המוח צריך להיות רק ~ 2 מ"מ לעומק ויהיה כאשר לאההתנגדות מורגשת.
   2. כנ"ל, להחזיק את הרגל בחוזקה ביד השנייה.
      הערה: ניתן להשתמש בבורר שיניים בשלב זה. עם זאת, אם נעשה שימוש בבור דנטלי, יש להחזיק את הרגל בחוזקה רבה כדי ליצור חלון קליפת המוח נקי ולהבטיח שהבור ייאסף ויחתוך את העצם במקום הרצוי. מומלץ לשלב זה סטיינמן, בהתחשב ביכולת החיתוך הגבוהה ביותר שלו.
6. טבול את חלון קליפת המוח עם גזה, כמו דימום קל צפוי.

6. יצירת צלחת פליטה הצמיחה

1. יצירת פציעה חור המקדח דרך צלחת הצמיחה המרכזית באמצעות 1.8 מ"מ שיניים שיניים מחוברת כלי סיבוב.
   הערה: עומק, זווית נכונה, כיוון הם קריטיים לשבש את צלחת הצמיחה המרכזית ( איור 1C ו- D ). הוראות להשגת עומק, זווית וכיוון מתאימים להלן.
   1. כדי למדוד את העומק המתאים באמצעות בור שיניים, בקתהN על ידי יישור הקצה של בור שיניים עם tibia הפרוקסימלי, שבו semitendinosus חוצה את הקפסולה הברך ( איור 1 ג ).
   2. עם קצה של קבור שיניים בקפסולת הברך, בצע את פיר פיר לאורך semitendinosus ולשים לב איפה בור יישור עם חלון קליפת המוח. זהו עומק המתאים עבור Bur כדי לשבש באופן מלא את צלחת הצמיחה מבלי לשבש את משטח המפרק ( איור 1 ג ).
      הערה: בור שיניים משמש למדידת העומק המתאים. הקוטר עשוי להיות מסומן עם סמן קבוע במקום שבו הוא יישור עם חלון קליפת המוח להפנות את עומק במהלך הקידוח. עם זאת, אם סמנים אנטומיים פרוטוקול לעיל הם הפניה מקרוב, שפוע הראשון על burs שיניים המפורטים כאן (FG6) יהיה ליישר כראוי עם חלון קליפת המוח (כפי שניתן לראות בתרשים 1C ).
   3. כדי להשיג את זווית המקדח המתאים, החזק את הכלי סיבוב בזווית של פחות tהאן 30 מעלות ביחס לדיאפיזה הטיבית.
      הערה: זהו קירוב חזותי.
   4. כדי להשיג את כיוון התרגיל המתאים, המטרה של זווית צלחת הצמיחה ( איור 1C ). צייר קו ויזואלי לאורך בור שיניים כדי זווית צלחת הצמיחה לסייע ביצירת פגם מרכזי.
   5. הפעל את הכלי הסיבובי ל -10,000 סל"ד (מהירות נמוכה של הכלי הסיבובי המצוין בסעיף החומרים) לפני הכניסה לחלון קליפת המוח.
   6. בעזרת הכלי הסיבובי בזווית ובכיוון המתאימים, היכנסו לחלון הקורטיקלי ודחפו את הכלי הסיבובי עד שיישור הסמן יתייצב עם החלון הקורטיקלי. לאחר העומק הנכון מושגת, להסיר את הכלי סיבוב.
      הערה: בצע את שיבוש צלחת הצמיחה בתנועה אחת מהירה, תוך שימוש מינימלי עם הזמן את הצלחת לצלחת על מנת ליצור פגיעה נקי. זה חשוב לניתוח נתונים.
2. טבול את החלון קליפת המוח עם גזה עבור ~ 30 s, כמו דימום צפוי.
3. ודא לעומק המתאים של הפציעה על ידי מדידה נוספת של אורך הבור (שלב 6.1.2).
   1. הכנס את הקופה לתוך המסלול המקדח (עם הכלי סיבובית) וליישר את המסומן מסומן עם חלון קליפת המוח ( איור 1D ).
4. אם העומק אינו מספיק, סובבו את הכלי הסיבובי ולחצו על העומק הרצוי.
   הערה: למרות סבב השני של הקידוח אינו אידיאלי, משבש באופן מלא את צלחת הצמיחה הוא החשוב ביותר לפיתוח של הבר הגרמי.
5. שוטפים את המסלול תרגיל עם ~ 3 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית באמצעות מזרק 10 מ"ל מחט 23-מד.
6. יבש את הפצע עם גזה.

7. הליכים שלאחר פגיעה

1. אם מעריכים טיפול ביומטרי המבוסס על גידול ביולוגי, הזרקו את החומר הביולוגי דרך מסלול הקידוח לאתר הפציעה באמצעות מחט בגודל מתאים (18 עד 26-מד, בהתאם לצמיגות הביולוגית).
   הערה: נפח הפגיעה צלחת הצמיחה הוא ~ 3 & #181; L, ואת נפח המסלול תרגיל הוא ~ 20 μL. נפח מרבי של חומר זה יכול להיות מוזרק לתוך הפצע צלחת פגיעה במסלול תרגיל הוא בין 20 ל 25 μL.
2. סגור את הפצע על ידי suturing fascia עם 3-0 polyglycolic חומצות תפרים. החל שעווה העצם על החלון קליפת המוח כדי לבודד את העצם הבסיסית (אופציונלי).
3. סגור את חתך העור עם התפרים קבור או קליפים הפצע.
   הערה: קליפים הפצע מומלץ, כמו החיה יהיה שריטה באתר הפציעה ועלול לפתוח את הפצע.
4. הסר את החיה מן הרדמה isoflurane, למקם אותו על שמיכה ההתחממות, ולפקח על זה עד שהוא ער.
5. כדי להפחית את הסיכון של זיהום, במקום החיה בכלוב חדש המכיל מצעים יבש, autoclaved.
6. אפשר החיה לשאת משקל שלאחר הניתוח.
7. לפקח על החיה כל 12 שעות עבור 72 שעות לאחר הניתוח כדי לבדוק סימנים של זיהום, כדי להבטיח את הפצע קליפים להישאר במקום, ולנהל postoperativ( למשל בופרנורפין ב 0.05 מ"ג / ק"ג כל 12 שעות במשך 36 שעות ו carprofen ב 5 מ"ג / ק"ג כל 24 שעות 72 שעות).
8. הסר את קליפ הפצע 10 - 14 ימים לאחר הניתוח בהרדמה.

תוצאות

פציעה מוצלחת צלחת הצמיחה באמצעות שיטה זו כרוכה הפרעה במרכז צלחת הצמיחה הטיבאלית מבלי לשבש את משטח הסחוס המפרקי. רקמת תיקון גרמית דווחה להתחיל בערך 7 ימים לאחר הפציעה ואת מתפתח באופן מלא על ידי 28 ימים לאחר פציעה ¹³ , כפי דמיינו טומוגרפיה מ?...

Discussion

פציעה הצמח פציעה הצמח גדל מאוד להבנתנו את המנגנונים הביולוגיים של פגיעה זו, ובכך פוטנציאל להוביל התערבויות טיפוליות יעיל יותר לילדים הסובלים מפציעה צלחת הצמיחה. כדי ליצור בהצלחה גרום גרמי כדי ללמוד את היווצרות in vivo באמצעות המודל המוצג בעבודה זו, חשוב כדי לשבש א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scalpel handle	McKesson	MCK42332500
Needle holder	Stoelting	RS-7824
Adson tissue forceps	Sklar	50-3048
Iris Scissors	Sklar	47-1246
Rotary Tool	Dremel	7700	Variable speed rotary tool
Keyless Rotary Tool Chuck	Dremel	4486
Dental Burs	Dental Burs USA	FG6	Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins	Simpex Medical	T-078
Hair clippers	Wahl	5537N
3-0 PGA surutes	Oasis	MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2"	Covidien	441211
Povidone Iodine	McKesson	922-00801
Sterile saline	Vetone	510224
10 mL luer lock syringe	Becton Dickinson	309604
23 gauge needle	Becton Dickinson	305145
Isopropyl alcohol pads	Dynarex	1113
Isoflurane	IsoFlo	30125-2
Caliper	Mitutoyo	500-196-30
Carprofen	Rimadyl	27180
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals Inc	NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape	McKesson	25-517
Surgical Gloves	Uline	S-20204
#15 Scalpel Blade	Aven	44044
9 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-09
Reflex clip applier	World Precision Instruments	500345
Absorbant underpads	McKesson	MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer	VetEquip	911103
Germinator 500	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Warm water recirculator	Kent Scientific	TP-700
Absorbent Underpads	Medline Industries	MSC281230