Un modelo de lesión en placa de crecimiento tibial de rata para caracterizar mecanismos de reparación y evaluar estrategias de regeneración de placas de crecimiento

Resumen

La placa de crecimiento es una región cartilaginosa en los huesos largos de los niños donde se produce un crecimiento longitudinal. Cuando se lesiona, el tejido óseo puede formar y afectar el crecimiento. Describimos un modelo de rata de lesión en la placa de crecimiento que conduce al tejido óseo de reparación, permitiendo el estudio de mecanismos de reparación y estrategias de regeneración de placas de crecimiento.

Resumen

Un tercio de todas las fracturas pediátricas implican la placa de crecimiento y pueden resultar en un deterioro del crecimiento óseo. La placa de crecimiento (o physis) es el tejido del cartílago que se encuentra al final de todos los huesos largos en los niños que es responsable del crecimiento óseo longitudinal. Una vez dañado, el tejido del cartílago dentro de la placa de crecimiento puede someterse a una osificación prematura y conducir a un tejido óseo no deseado de reparación, que forma una "barra ósea". En algunos casos, esta barra ósea puede dar lugar a deformidades del crecimiento óseo, tales como deformidades angulares, o puede detener completamente el crecimiento óseo longitudinal. Actualmente no hay tratamiento clínico que pueda reparar completamente una placa de crecimiento lesionada. El uso de un modelo animal de lesión en la placa de crecimiento para comprender mejor los mecanismos subyacentes a la formación de la barra ósea e identificar maneras de inhibirla es una gran oportunidad para desarrollar mejores tratamientos para lesiones en la placa de crecimiento. Este protocolo describe cómo interrumpir la placa de crecimiento tibial proximal de la rata usando un defecto de perforación. Esta smaEl modelo animal produce confiablemente una barra ósea y puede dar lugar a deformidades de crecimiento similares a las observadas en los niños. Este modelo permite investigar los mecanismos moleculares de la formación de barras óseas y sirve como un medio para probar posibles opciones de tratamiento para lesiones en la placa de crecimiento.

Introducción

Las lesiones en la placa de crecimiento representan el 30% de todas las fracturas pediátricas y pueden resultar en un deterioro del crecimiento óseo ¹ . Además de las fracturas, las lesiones en la placa de crecimiento pueden ser causadas por otras etiologías, incluyendo osteomielitis ² , tumores óseos primarios ³ , radiación y quimioterapia ⁴ , y daño iatrogénico ⁵ . La placa de crecimiento (o physis) es una región del cartílago al final de los huesos largos de los niños que es responsable del crecimiento longitudinal del hueso. Impulsa el alargamiento óseo a través de la osificación endocondral; Los condrocitos sufren proliferación e hipertrofia y luego son remodelados por osteoblastos entrantes para formar hueso trabecular ⁶ . La placa de crecimiento es también una zona débil del esqueleto en desarrollo, por lo que es propenso a las lesiones. La principal preocupación con las fracturas o lesiones de placas de crecimiento es que el tejido cartilaginoso dañado dentro de la placa de crecimiento puedeE reemplazado con tejido de reparación ósea no deseado, también conocido como "barra ósea". Dependiendo de su tamaño y ubicación dentro de la placa de crecimiento, la barra ósea puede conducir a deformidades angulares o detención completa del crecimiento, una secuela devastadora para los niños pequeños que aún no han alcanzado su altura completa ⁷ .

Actualmente no hay tratamiento que pueda reparar completamente una placa de crecimiento dañada. Una vez que se forma la barra ósea, el clínico debe decidir si debe o no quitarla quirúrgicamente ⁸ . Los pacientes con al menos 2 años o 2 cm de crecimiento esquelético restante y con una barra ósea que abarca menos del 50% del área de la placa de crecimiento suelen ser candidatos para la resección de la barra ósea ⁸ . La extirpación quirúrgica de la barra ósea a menudo es seguida por la interposición de un injerto de grasa autóloga para prevenir la reforma del tejido óseo y para permitir que la placa de crecimiento no dañada circundante restablezca el crecimiento. Sin embargo, estasEmatic ya menudo fracasan, lo que lleva a la recurrencia de la barra ósea y el efecto negativo continuo sobre el crecimiento ⁹ . Existe una necesidad crítica de desarrollar tratamientos eficaces que no sólo eviten la formación de barras óseas, sino que también regeneren el cartílago de la placa de crecimiento, restaurando así la elongación ósea normal.

Los mecanismos moleculares subyacentes a la formación de barras óseas aún no se han dilucidado completamente. Una mayor comprensión de estos mecanismos biológicos podría conducir a intervenciones terapéuticas más eficaces para los niños que sufren lesiones en la placa de crecimiento. Dado que el estudio de estos mecanismos en los seres humanos es difícil, se han utilizado modelos animales, especialmente el modelo de rata de lesión en la placa de crecimiento ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} . El método presentado en esteDescribe cómo un defecto de perforación en la placa de crecimiento tibial de la rata conduce a tejido de reparación predecible y reproducible que comienza la osificación tan temprano como 7 días después de la lesión y forma una barra ósea completamente madura con remodelación a los 28 días después de la lesión ¹⁰ . Esto proporciona un modelo animal in vivo en el cual estudiar los mecanismos biológicos de la formación de barras óseas, así como evaluar nuevas terapias que podrían prevenir la barra ósea y / o regenerar el cartílago de la placa de crecimiento. Por ejemplo, este modelo puede usarse para probar biomateriales condrogénicos que pueden regenerar el cartílago de la placa de crecimiento y ofrecer un tratamiento valioso para los niños que sufren lesiones en la placa de crecimiento. Las técnicas presentadas en este artículo describirán los métodos quirúrgicos utilizados para producir la lesión de la placa de crecimiento y la posterior entrega de biomateriales al sitio de la lesión. También discutiremos métodos para evaluar la formación de barras óseas y reparar el tejido.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales deben ser aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional Animal (IACUC). El protocolo animal para el siguiente procedimiento fue aprobado por la Universidad de Colorado Denver IACUC.

1. Obtener Ratas

NOTA: A menos que se deseen animales modificados genéticamente, se necesitan ratas Sprague-Dawley esqueléticamente inmaduras de 6 semanas de edad en el momento de la cirugía. Otras cepas podrían utilizarse potencialmente; Sin embargo, la mayoría de los estudios publicados se han realizado en ratas Sprague-Dawley.

2. Preparación de Suministros Quirúrgicos

1. Autoclave paquetes de suministro quirúrgico que incluyen uno de cada uno de los siguientes: # 3 asa de bisturí, titular de la aguja, fórceps Adson, tijeras y el iris.
2. Autoclave los portabrocas sin llave. Los mandriles de taladro pueden esterilizarse con perlas entre cirugías de animales cuando operan en múltiples animales.
   NOTA: Las reglas locales de IACUC relativas al uso deSe deben respetar las herramientas médicas de varios animales. Por ejemplo, la Universidad de Colorado Denver IACUC permite un conjunto de herramientas quirúrgicas para ser utilizado en hasta 5 animales antes de su descontinuación. Además, las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas térmicamente utilizando un esterilizador de talones entre animales. Se deben usar otros paquetes quirúrgicos estériles para cualquier animal adicional.
3. Pines Steinmann de 5 cm de autoclave, uno para cada animal.
   NOTA: Para reducir el riesgo de infección, los pines Steinmann no deben usarse para múltiples animales.
4. Autoclave Brocas dentales de 1,8 mm, una para cada animal.
   NOTA: Para reducir el riesgo de infección, las fresas dentales no deben usarse para múltiples animales.
5. Autoclave un aplicador de clip de herida, si corresponde. Alternativamente, se pueden usar suturas enterradas para cerrar la capa cutánea. Consulte el paso 7.3.
6. Si es posible, esterilice un taladro rotatorio mediante irradiación o esterilización con gas.
7. Recoge los siguientes suministros adicionales: afeitadora eléctrica,Sialas estériles de 10 ml, agujas estériles de calibre 23, compresas de alcohol isopropílico, isoflurano, pinzas, analgésicos posquirúrgicos ( por ejemplo, AINEs y buprenorfina), sutura de ácido poliglicólico 3-0, gas estéril, yoduro de povidona, Guantes quirúrgicos estériles, cuchillas de bisturí estériles # 15, pinzas de herida estériles, máquina de anestesia, esterilizador de cuentas, almohadilla de calentamiento y almohadillas absorbentes.

3. Anestesia y preparación de animales

1. Anestesiar al animal introduciéndolo en una cámara de inducción de 1 a 2 litros recibiendo flujo de oxígeno de 1 l / min con isoflurano al 5% a partir de un sistema de vaporización con un sistema de barrido pasivo.
   NOTA: La exposición al isoflurano al 5% debe anestesiar a las ratas de 6 semanas de edad dentro de los 5 minutos.
2. Mueva al animal al sitio quirúrgico y mantenga al animal bajo anestesia con isoflurano al 2 - 3% usando un cono de nariz para el resto del procedimiento. Coloque el animal en decúbito supino sobre una almohadilla de calentamiento y absorbaEnt.
   NOTA: El animal no necesita ser fijado a la mesa quirúrgica. La sujeción de la pata como se especifica en los pasos siguientes es un método suficiente de estabilización.
   NOTA: Todos los procedimientos subsiguientes deben realizarse con el animal bajo anestesia. 2 - 3% de isoflurano debe ser suficiente para mantener la anestesia en ratas a esta edad. Esto puede confirmarse mediante la prueba del reflejo del retiro bípedo.
3. Administrar analgésicos intraoperatorios de acuerdo con las políticas aprobadas institucionalmente ( por ejemplo, buprenorfina a 0,05 mg / kg y carprofeno a 5 mg / kg).

4. Preparación de la tibia para la cirugía

1. Afeitar toda la pata trasera desde el maléolo medial hasta la pelvis con una afeitadora eléctrica.
2. Medir y registrar la longitud tibial desde la meseta tibial anterior hasta el lado inferior del maléolo medial usando calibradores. Alternativamente, mida toda la longitud de la tibia usando rayos X o microCT ¹¹ Sup> ^{, 12 , 14} . Opcionalmente, medir las dimensiones de la placa de crecimiento antes de la cirugía usando rayos X o microCT.
3. Limpie el sitio quirúrgico limpiando toda la pierna (s), el abdomen y los genitales con hisopos de alcohol y luego con gasa empapada de yoduro de povidona.
   NOTA: Para minimizar el riesgo de infección, todos los procedimientos subsiguientes, hasta que el animal se retire de la anestesia (paso 7.4), deben realizarse en condiciones estériles. Se debe acceder a todos los materiales quirúrgicos usando una técnica estéril. El uso de un asistente quirúrgico es altamente recomendado para mantener la esterilidad durante la cirugía.
4. Usando guantes quirúrgicos estériles, coloque una cortina quirúrgica estéril fenestrated sobre el animal, dejando la pierna (s) expuesta a través de la fenestración central.

5. Procedimiento quirúrgico para acceder a la placa de crecimiento

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
Figura 1: Visión general del procedimiento quirúrgico.
A) Ubicación de varios marcadores anatómicos utilizados para crear una lesión exitosa en la placa de crecimiento. La cápsula de rodilla está inmediatamente posterior a la rótula (blanca), separando la tibia del fémur. La placa de crecimiento tibial (rojo oscuro) se puede ver inferior a la rótula y eludir la tibia. La placa de crecimiento proximal es un plano mayoritariamente plano, excepto el cuarto anterior que forma un plano diagonal. La intersección de estos dos planos forma el ángulo de la placa de crecimiento, que se utiliza para la angulación apropiada del taladro. La inserción semitendinosa es donde se inserta el músculo cuádriceps en la tibia posterior. B) Incisión a través de la cara anterior-medial de los tejidos blandos tibiales para acceder al hueso cortical. C) Ubicación de la ventana cortical utilizando la alineación con la inserción semitendinosa distal como punto de referencia. D) EvaluaciónLa profundidad de la lesión alineando el bisel en la fresa dental con la ventana cortical.

1. Hacer una incisión de ~ 1 cm a través de la piel a lo largo de la cara medial anterior de la tibia proximal usando un mango de escalpelo # 3 y una cuchilla # 15, comenzando en el extremo distal del cóndilo femoral mediano ( Figura 1A ).
   1. Tire de la piel contra el hueso subyacente y mantenga la pierna firmemente mientras realiza la incisión.
      NOTA: Esto mantendrá la incisión de la piel en el lugar deseado y ayudará en la creación de una incisión limpia. No presione demasiado firmemente con el bisturí para evitar perforar la cápsula de la rodilla, lo que resultaría en sangrado profuso y dificultará los pasos restantes.
2. Tomar nota de los marcadores anatómicos importantes, incluyendo: 1) la placa de crecimiento, 2) el ángulo de la placa de crecimiento, 3) la cápsula de rodilla, y 4) la inserción semitendinosa ( Figura 1A ).
3. Utilizando el bisturí, realice una incisión de ~ 0,5 cmE fascia y tejidos blandos en la cara medial anterior de la tibia proximal, desde la placa de crecimiento hasta la parte inferior de la incisión cutánea ( Figura 1B ).
4. Disecar o raspar suavemente la fascia y los tejidos blandos de la tibia usando el bisturí ( Figura 1B ).
   NOTA: Es importante quitar o raspar tanto tejido blando de la tibia como sea posible para no interferir con los pasos de perforación.
5. Taladrar una ventana cortical a través del hueso cortical tibial en la diáfisis con un pasador Steinmann unido a una herramienta giratoria a 10.000 RPM (baja velocidad de la herramienta rotatoria especificada en la sección de materiales). Crear la ventana cortical de tal manera que se alinea con la inserción semitendinosa distal ( Figura 1C ).
   1. Mantenga el taladro perpendicular a la diáfisis tibial y taladre lentamente, teniendo cuidado de no perforar a través del otro lado de la diáfisis; La ventana cortical tiene que ser sólo ~ 2 mm de profundidad y se hará cuando noSe siente resistencia.
   2. Como anteriormente, mantenga la pierna firmemente con la otra mano.
      NOTA: Se puede usar una fresa dental para este paso. Sin embargo, si se utiliza una fresa dental, la pierna debe ser mantenida muy firmemente para hacer una ventana cortical limpia y para asegurarse de que la broza agarra y corta el hueso en el lugar deseado. Se recomienda un pasador Steinmann para este paso, dada su capacidad de corte mucho superior.
6. Dab la ventana cortical con gasa, como el sangrado ligero se espera.

6. Creación de la lesión en la placa de crecimiento

1. Cree una lesión en el taladro a través de la placa de crecimiento central usando una fresa dental de 1,8 mm unida a una herramienta giratoria.
   NOTA: La profundidad, el ángulo y la dirección apropiados son críticos para interrumpir la placa de crecimiento central ( Figura 1C y D ). A continuación se indican las instrucciones para obtener la profundidad, ángulo y dirección apropiados.
   1. Para medir la profundidad apropiada usando la fresa dental, begiN alineando el extremo de la fresa dental con la tibia proximal, donde el semitendinosus cruza la cápsula de rodilla ( Figura 1C ).
   2. Con el extremo de la fresa dental en la cápsula de rodilla, siga el eje de la fresa a lo largo del semitendinoso y tome nota de donde la fresa se alinea con la ventana cortical. Esta es la profundidad apropiada para que la fresa altere completamente la placa de crecimiento sin alterar la superficie articular ( Figura 1C ).
      NOTA: La fresa dental se usa para medir la profundidad apropiada. La fresa puede marcarse con un marcador permanente en el lugar donde se alinea con la ventana cortical para hacer referencia a la profundidad durante la perforación. Sin embargo, si los marcadores anatómicos y el protocolo anterior están estrechamente referenciados, el primer bisel en las fresas dentales especificadas aquí (FG6) se alineará apropiadamente con la ventana cortical (como se ve en la Figura 1C ).
   3. Para lograr el ángulo de perforación adecuado, sujete la herramienta giratoria en un ángulo de menos tHan 30 ° con respecto a la diáfisis tibial.
      NOTA: Esta es una aproximación visual.
   4. Para alcanzar la dirección apropiada del taladro, apunte hacia el ángulo de la placa de crecimiento ( Figura 1C ). Dibuje una línea visual a lo largo de la fresa dental hasta el ángulo de la placa de crecimiento para ayudar a crear un defecto central.
   5. Encienda la herramienta giratoria a 10.000 RPM (velocidad baja de la herramienta giratoria especificada en la sección de materiales) antes de entrar en la ventana cortical.
   6. Con la herramienta giratoria en un ángulo y dirección apropiados, entre en la ventana cortical y empuje la herramienta giratoria hasta que el marcador de la fresa se alinee con la ventana cortical. Una vez que se ha alcanzado la profundidad adecuada, retire la herramienta giratoria.
      NOTA: Realice la interrupción de la placa de crecimiento en un movimiento rápido, usando un tiempo mínimo con la fresa en la placa de crecimiento para crear una lesión limpia. Esto es importante para el análisis de datos.
2. Dab la ventana cortical con gasa para ~ 30 s, como se espera sangrado.
3. Asegure la profundidad apropiada de la lesión midiendo nuevamente la longitud de la fresa (paso 6.1.2).
   1. Inserte la fresa en el taladro (con la herramienta rotativa apagada) y alinee la fresa marcada con la ventana cortical ( Figura 1D ).
4. Si la profundidad es inadecuada, gire la herramienta giratoria y presione la profundidad deseada.
   NOTA: Aunque una segunda ronda de perforación no es ideal, la interrupción total de la placa de crecimiento es primordial para el desarrollo de la barra ósea.
5. Enjuague la pista de perforación con ~ 3 ml de solución salina estéril usando una jeringa de 10 ml y una aguja de calibre 23.
6. Seque la herida con gasa.

7. Procedimientos posteriores a la lesión

1. Si se evalúa un tratamiento de placa de crecimiento a base de biomaterial, inyectar el biomaterial a través de la pista de perforación en el sitio de la lesión utilizando una aguja de tamaño adecuado (calibre de 18 a 26, dependiendo de la viscosidad del biomaterial).
   NOTA: El volumen de la lesión en la placa de crecimiento es ~ 3 & #181; L, y el volumen de la pista de perforación es ~ 20 μL. El volumen máximo de material que se puede inyectar en la lesión de la placa de crecimiento y la pista de perforación está entre 20 y 25 μL.
2. Cierre la herida suturando la fascia con suturas de ácido poliglicólico 3-0. Aplique cera ósea sobre la ventana cortical para aislar el hueso subyacente (opcional).
3. Cierre la incisión de la piel con suturas enterradas o clips de herida.
   NOTA: Los clips de la herida se recomiendan, ya que el animal arañará el sitio de lesión y puede abrir la herida.
4. Retire el animal de la anestesia con isoflurano, colóquelo sobre una manta de calentamiento y vigírelo hasta que esté despierto.
5. Para reducir el riesgo de infección, coloque el animal en una nueva jaula que contenga ropa de cama seca en autoclave.
6. Permitir que el animal soportar el peso post-operatorio.
7. Vigilar el animal cada 12 h durante 72 h después de la cirugía para comprobar si hay signos de infección, asegurarse de que los clips de la herida permanecen en su lugar y administrar postoperativ(Por ejemplo, buprenorfina a 0,05 mg / kg cada 12 h durante 36 h y carprofeno a 5 mg / kg cada 24 h durante 72 h).
8. Retire los clips de la herida 10 - 14 días después de la cirugía bajo anestesia.

Resultados

El éxito de la lesión en la placa de crecimiento utilizando este método implica la interrupción del centro de la placa de crecimiento tibial sin alterar la superficie del cartílago articular. Se ha informado que el tejido de reparación ósea comienza aproximadamente a los 7 días después de la lesión y se desarrolla completamente 28 días después de la lesión ¹³ , tal como se visualiza mediante micro tomografía computarizada (micro TC) ( Figura ...

Discusión

Un modelo de animal de lesión de placa de crecimiento se suma mucho a nuestra comprensión de los mecanismos biológicos de esta lesión, lo que potencialmente conduce a intervenciones terapéuticas más eficaces para los niños que sufren de lesiones en la placa de crecimiento. Para crear con éxito una barra ósea y estudiar su formación in vivo utilizando el modelo presentado en este trabajo, es crítico interrumpir la placa de crecimiento mediante la perforación a una profundidad suficiente, sin interrum...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scalpel handle	McKesson	MCK42332500
Needle holder	Stoelting	RS-7824
Adson tissue forceps	Sklar	50-3048
Iris Scissors	Sklar	47-1246
Rotary Tool	Dremel	7700	Variable speed rotary tool
Keyless Rotary Tool Chuck	Dremel	4486
Dental Burs	Dental Burs USA	FG6	Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins	Simpex Medical	T-078
Hair clippers	Wahl	5537N
3-0 PGA surutes	Oasis	MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2"	Covidien	441211
Povidone Iodine	McKesson	922-00801
Sterile saline	Vetone	510224
10 mL luer lock syringe	Becton Dickinson	309604
23 gauge needle	Becton Dickinson	305145
Isopropyl alcohol pads	Dynarex	1113
Isoflurane	IsoFlo	30125-2
Caliper	Mitutoyo	500-196-30
Carprofen	Rimadyl	27180
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals Inc	NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape	McKesson	25-517
Surgical Gloves	Uline	S-20204
#15 Scalpel Blade	Aven	44044
9 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-09
Reflex clip applier	World Precision Instruments	500345
Absorbant underpads	McKesson	MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer	VetEquip	911103
Germinator 500	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Warm water recirculator	Kent Scientific	TP-700
Absorbent Underpads	Medline Industries	MSC281230