쥐 경골 성장 플레이트 손상 모델 수리 메커니즘을 특성화하고 성장 플레이트 평가 재생 플레이트 전략

요약

성장판은 종아리 성장이 일어나는 어린이의 긴 뼈에서 연골 부분입니다. 부상을 입으면 뼈 조직이 형성되어 성장을 저해 할 수 있습니다. 우리는 뼈 복구 조직으로 이어지는 성장 플레이트 손상의 쥐 모델을 설명하고, 복구 메커니즘 및 성장 플레이트 재생 전략에 대한 연구를 허용합니다.

초록

모든 소아 골절 중 3 분의 1은 성장판을 포함하며 뼈 성장 장애를 초래할 수 있습니다. 성장판 (또는 피스)은 세로 뼈의 성장을 담당하는 모든 긴 뼈의 끝에서 발견되는 연골 조직입니다. 일단 손상되면, 성장판 내의 연골 조직이 조기 골화를 일으켜 "뼈 바 (bony bar)"를 형성하는 불필요한 골 수복 조직으로 이어질 수 있습니다. 어떤 경우에는이 뼈 바가 각형 변형과 같은 뼈 성장 변형을 일으킬 수 있으며, 또는 세로 뼈 성장을 완전히 멈출 수 있습니다. 현재 부상당한 성장판을 완전히 치료할 수있는 임상 적 치료는 없습니다. 뼈 형성의 기초가되는 메커니즘을 더 잘 이해하고이를 억제 할 수있는 방법을 확인하기 위해 성장 플레이트 손상의 동물 모델을 사용하면 성장 플레이트 손상에 대한 더 나은 치료법을 개발할 수있는 좋은 기회입니다. 이 프로토콜은 드릴 홀 결함을 사용하여 쥐 근위 경골 성장 플레이트를 방해하는 방법을 설명합니다. 이 SMA11 동물 모델은 뼈 막대를 안정적으로 생산하고 어린이에게서 보이는 것과 유사한 성장 기형을 초래할 수 있습니다. 이 모델은 뼈 형성의 분자 메커니즘에 대한 조사를 허용하고 성장판 손상에 대한 잠재적 치료 옵션을 테스트하는 수단으로 사용됩니다.

서문

성장 판 손상은 모든 소아 골절의 30 %를 차지하며 뼈 성장 장애를 초래할 수 있습니다 ¹ . 골절 외에도 성장 골판지 부상은 골수염 ² , 원발성 골 종양 ³ , 방사선 및 화학 요법 ⁴ , 의원 성 손상 ⁵ 와 같은 다른 원인으로 인해 발생할 수 있습니다. 성장판 (또는 피스)은 길이가 긴 뼈의 성장을 담당하는 긴 뼈의 끝에있는 연골 부위입니다. 그것은 endochondral 골화를 통해 뼈 신장을 몰고; 연골 세포는 증식과 비대증을 일으키고 들어오는 골아 세포에 의해 개조되어 섬유 골 ⁶ 을 형성합니다. 성장판은 발달중인 골격의 약한 부위이기 때문에 부상을 입을 수 있습니다. 성장판 골절 또는 손상에 대한 주요 관심사는 성장판 내의 손상된 연골 조직이 be는 "뼈 바 (bony bar)"라고도하는 원치 않는 뼈 복구 조직으로 대체되었습니다. 성장판의 크기와 위치에 따라 뼈 바는 각형 기형이나 완전한 성장 체포로 이어질 수 있습니다. 이는 아직 전체 신장에 도달하지 못한 어린 아동을위한 치명적인 후유증입니다.

현재 부상당한 성장판을 완전히 치료할 수있는 치료법은 없습니다. 일단 뼈 바가 형성되면 임상의는 수술 적 제거 여부를 결정해야합니다 ⁸ . 최소 2 년 또는 2 cm의 골격 성장이 남아 있고 성장판 면적의 50 % 미만에 걸쳐있는 뼈 막대가있는 환자는 일반적으로 골극 절제술 ^8의 후보가됩니다. 뼈 바의 외과 적 제거는 종종 뼈 조직의 개질을 방지하고 주위의 손상되지 않은 성장판이 성장을 회복 할 수 있도록자가 지방 이식편을 삽입함으로써 이어진다. 그러나 이러한 기술은 probl입니다.정서적이며 종종 실패하여 뼈 재발 및 성장에 계속 부정적인 영향을 미친다. 뼈 형성을 막을뿐만 아니라 성장판 연골을 재생하여 정상적인 뼈 신도를 회복시키는 효과적인 치료 방법을 개발해야하는 비판적 필요성이 있습니다.

뼈 형성의 기초가되는 분자 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 이러한 생물학적 기작을 더 잘 이해하면 성장판 손상으로 고통받는 어린이에게보다 효과적인 치료 적 개입이 될 수 있습니다. 인간에서 이러한 기작을 연구하는 것이 어렵 기 때문에 동물 모델, 특히 성장 판 손상 ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} 의 쥐 모델이 사용되었습니다. 이 방법은종이는 쥐 경골 성장판의 드릴 홀 결함이 손상 후 7 일째에 골화를 시작하고 상해 후 28 일에 개조 된 완전히 성숙 된 뼈 바를 형성하는 예측 가능하고 재현 가능한 복구 조직을 유도하는 방법을 설명합니다 ¹⁰ . 이것은 뼈 형성을 방지하고 성장 판 연골을 재생할 수있는 새로운 치료법을 평가할뿐만 아니라 뼈 형성의 생물학적 기작을 연구하는 작은 동물 생체 모델을 제공합니다. 예를 들어이 모델은 성장판 연골을 재생할 수 있고 성장판 손상으로 고통받는 어린이에게 소중한 치료를 제공 할 수있는 연골 생체 재료를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문에서 제시된 기술은 성장판 손상을 일으키기 위해 사용 된 외과 적 방법과 부상 부위에 생체 물질의 후속적인 전달을 기술 할 것이다. 또한 뼈 바 형성 및 조직 복구를 평가하는 방법에 대해서도 논의 할 것입니다.

프로토콜

모든 동물의 절차는 지역 동물 애호 관리위원회 (IACUC)의 승인을 받아야합니다. 다음 절차에 대한 동물 프로토콜은 University of Colorado Denver IACUC의 승인을 받았습니다.

1. 쥐 얻기

참고 : 유전자 조작 동물을 원하지 않는 한, 6 주 된 골격 미성숙 Sprague-Dawley 쥐가 수술시 필요할 수 있습니다. 다른 균주도 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 그러나 발표 된 연구의 대부분은 Sprague-Dawley 쥐에서 수행되었습니다.

2. 수술 용품 준비

1. # 3 메스 핸들, 바늘 홀더, Adson 포셉, 홍채 가위 각각을 포함하는 오토 클레이브 수술 공급 팩.
2. 열쇠가없는 드릴 척을 오토 클레이브합니다. 드릴 척은 여러 동물을 대상으로 동물 실험을하는 동안 비드가 멸균 될 수 있습니다.
   참고 : 무균 수술의 사용에 관한 지역 IACUC 규칙여러 동물의 도구는 반드시 준수해야합니다. 예를 들어, University of Colorado Denver IACUC는 단종되기 전 최대 5 마리의 동물에게 한 가지 수술 도구 세트를 사용할 수있게합니다. 또한, 수술 도구는 동물 사이의 비드 소독기를 사용하여 가열 멸균되어야합니다. 추가로 무균 외과 용 팩을 사용해야합니다.
3. 오토 클레이브 5cm 슈타인 핀 (Steinmann pin), 각 동물 당 하나.
   참고 : 감염의 위험을 줄이려면 Steinmann 핀을 여러 동물에 사용해서는 안됩니다.
4. 오토 클레이브 1.8 mm 치과 용 바지 (각 동물마다 하나씩).
   참고 : 감염의 위험을 줄이기 위해 여러 동물에 치과 용 바지를 사용하지 않아야합니다.
5. 해당되는 경우 상처 클립 애플리케이터를 고압 멸균하십시오. 또는 매설 된 봉합사를 사용하여 피부 층을 닫을 수 있습니다. 7.3 단계를 참조하십시오.
6. 가능한 경우, 조사 또는 가스 멸균을 사용하여 회전식 드릴을 멸균하십시오.
7. 다음과 같은 추가 소모품을 수집하십시오 : 전기 면도기, ste리플 3-0 폴리 글리콜 산 봉합사, 멸균 거즈, 포비돈 요오드, 멸균 식염수, 멸균 10 mL 주사기, 멸균 23 게이지 바늘, 이소 프로필 알콜 면봉, 이소 플루 란, 캘리퍼스, 수술 후 진통제 ( 예 : NSAID 및 부 프레 노르 핀) 멸균 수술 장갑, 멸균 # 15 메스 블레이드, 멸균 상처 클립, 마취 기계, 비드 멸균기, 보온 패드 및 흡수성 언더 패드를 포함하는 약제 학적 조성물.

3. 마취 및 동물의 준비

1. 수동 소기 시스템을 갖춘 증발 시스템에서 5 % isoflurane과 함께 1L / min 산소 흐름을받는 1L에서 2L 유도 챔버에 동물을 주입하여 마취하십시오.
   참고 : 5 % 이소 플루 란에 5 분 이내에 6 주된 쥐를 마취해야 노출됩니다.
2. 동물을 수술 사이트로 이동하고 나머지 절차 동안 코 콘을 사용하여 2 ~ 3 % isoflurane으로 마취하에 동물을 유지하십시오. 온난화 패드와 흡수체에 동물을 위로 놓습니다.언더파드.
   참고 : 동물을 수술대에 고정 할 필요는 없습니다. 아래의 단계에서 지정된대로 다리를 고정하는 것이 안정화의 충분한 방법입니다.
   참고 : 모든 후속 절차는 마취하에 동물과 함께 수행되어야합니다. 이 연령대의 쥐에게 2 ~ 3 % isoflurane이 마취를 유지하기에 충분해야합니다. 이것은 양 발적 철수 반사를 테스트하여 확인할 수 있습니다.
3. 기관에서 승인 한 정책 ( 예 : 0.05 mg / kg의 부 프레 노르 핀 및 5 mg / kg의 카 프로판)에 따라 수술 중 진통제를 투여합니다.

수술을위한 경골의 준비

1. 전기 면도기로 내 malleolus에서 골반까지 전체 뒷다리를 면도하십시오.
2. 캘리퍼스를 사용하여 전 경골 고원에서 내측 전두엽의 하측까지의 경골 길이를 측정하고 기록하십시오. 또는 X 선 또는 microCT ^11을 사용하여 전체 경골 길이를 측정하십시오. ^{12 , 14} . X 선 또는 microCT를 사용하여 수술 전에 성장 판 치수를 측정 할 수도 있습니다 (선택 사항).
3. 술기, 복부 및 생식기를 알코올 면봉으로 닦은 다음 povidone-iodine-soaked gauze로 닦아 수술 부위를 닦으십시오.
   참고 : 감염의 위험을 최소화하기 위해 동물을 마취에서 제거하기 전까지 모든 후속 절차 (7.4 단계)는 무균 상태에서 수행해야합니다. 모든 수술 재료는 무균 기술을 사용하여 접근해야합니다. 수술 도중에 불임을 유지하려면 수술 보조원의 사용을 적극 권장합니다.
4. 멸균 수술 장갑을 끼고, 창살 중앙 틈을 통해 다리가 노출 된 상태에서 동물 위에 창살이없는 무균 수술 용 드레이프를 놓습니다.

5. 성장판에 접근하기위한 수술 절차

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그림 1 : 외과 수술 개요.
A) 성공적인 성장판 손상을 일으키는 데 사용되는 몇 가지 해부학 적 마커의 위치. 무릎 캡슐은 대퇴골에서 경골을 분리하는 무릎 관절부 (흰색)의 바로 뒤쪽에 있습니다. 경골 판 (짙은 붉은 색)은 무릎 관절보다 열등하여 경골을 우회 할 수 있습니다. 근위 성장판은 대각선 평면을 형성하는 전방 1/4을 제외하고는 대부분 평평한 평면입니다. 이 두 평면의 교차점은 적절한 드릴 가공에 사용되는 성장판 각도를 형성합니다. 반 골반 삽입은 대퇴사 두근이 후 경골에 삽입되는 곳입니다. B) 대뇌 피질의 뼈에 접근하기위한 경골 연조직의 전 안부 측면을 통한 절개. C) 원위 반결위 삽입술을 기준점으로 정렬을 사용하여 피질 창 위치. D) 평가치과 버에 베벨을 대뇌 피질 창과 정렬하여 상해의 깊이.

1. # 3 메스 핸들과 # 15 블레이드를 사용하여 근위 경골의 내측 - 앞면을 따라 피부를 통해 ~ 1cm 절개를하고 대퇴 내과 내과의 말단부에서 시작하십시오 ( 그림 1A ).
   1. 피부를 아래 뼈에 단단히 당기고 절개를하는 동안 다리를 단단히 유지합니다.
      참고 : 이렇게하면 피부 절개가 원하는 위치에 유지되어 깨끗한 절개를 만들 수 있습니다. 무릎 캡슐에 구멍이 뚫리지 않도록 메스를 너무 세게 누르지 마십시오. 그러면 많은 양의 출혈이 생기고 나머지 단계를 어렵게 만듭니다.
2. 1) 성장판, 2) 성장판 각도, 3) 무릎 관절낭, 4) 반 골반 삽입 ( 그림 1A ) 등 중요한 해부학 적 마커를 기록하십시오.
3. 메스를 사용하여 ~ 0.5cm 절개를 통해e 근막 및 연조직을 성장 절판에서부터 피부 절개의 바닥까지 ( 그림 1B ) 근위 경골의 내측 - 앞면에 배치합니다.
4. 메스를 사용하여 경골의 근막과 연조직을 부드럽게 해부하거나 긁어냅니다 ( 그림 1B ).
   참고 : 드릴링 단계를 방해하지 않도록 가능한 한 경골에서 연조직을 제거하거나 긁는 것이 중요합니다.
5. 10,000RPM (재료 섹션에 명시된 회전 공구의 저속)에서 회전 공구에 부착 된 Steinmann 핀을 사용하여 골밀도에서 경골 피질골을 통해 대뇌 피질의 창을 뚫습니다. 원위 반 중추 삽입술과 정렬되도록 대뇌 피질 창을 만듭니다 ( 그림 1C ).
   1. 경골 골간에 직각으로 드릴을 잡고 천천히 천천히 골반의 다른 쪽을 관통하지 않도록 조심하십시오. 대뇌 피질의 창은 깊이가 ~ 2 mm에 불과하며 필요 없을 때 만들어집니다.저항이 느껴진다.
   2. 위와 같이 다른 손으로 단단히 다리를 잡으십시오.
      참고 :이 단계에서는 치과 용 바를 사용할 수 있습니다. 그러나 치과 용 버를 사용하는 경우, 다리는 깨끗한 피질 창을 만들고 버가 원하는 위치에서 뼈를 잡고 잘리는 지 확인하기 위해 단단히 고정시켜야합니다. Steinmann 핀은 탁월한 절단 능력으로이 단계에서 권장됩니다.
6. 가벼운 출혈이 예상되므로 거즈로 대뇌 피질 창을가립니다.

6. 성장판 손상 생성

1. 회전 공구에 부착 된 1.8mm 치과 용 바를 사용하여 중앙 성장판을 통해 드릴 홀 손상을 만듭니다.
   참고 : 올바른 깊이, 각도 및 방향은 중앙 성장판을 방해하는 데 중요합니다 ( 그림 1C 및 D ). 적절한 깊이, 각도 및 방향을 얻는 방법은 다음과 같습니다.
   1. 치과 용 버를 사용하여 적절한 깊이를 측정하려면 begin 치아의 끝을 경골 근위부와 정렬시킴으로써, 반 경첩이 무릎 관절을 가로 지르는 ( 그림 1C ) 경우.
   2. 무릎 캅셀에 치과 용 바가 끝나면 반 이음 장치를 따라 버 샤프트를 따라 가며 바가 대뇌 피질 창과 정렬되는 위치를 적어 두십시오. 이것은 관절면을 손상시키지 않으면 서 버가 성장판을 완전히 파괴 할 수있는 적절한 깊이입니다 ( 그림 1C ).
      참고 : 치과 용 바는 적절한 깊이를 측정하는 데 사용됩니다. bur는 드릴링 중에 깊이를 참조하기 위해 대뇌 피질 창과 정렬되는 위치에 영구 마커로 표시 될 수 있습니다. 그러나 해부학 적 마커와 위의 프로토콜을 면밀히 참조하면 여기에 지정된 치아 burs의 첫 번째 경사 (FG6)가 대뇌 피질창과 적절하게 정렬됩니다 ( 그림 1C 참조 ).
   3. 적절한 드릴 각도를 얻으려면 회전 공구를 t 각도보다 작게 잡습니다han 30 °로 경골 간을 기준으로합니다.
      참고 :이 시각적 인 근사치입니다.
   4. 적절한 드릴 방향을 얻으려면 성장판 각도를 조준하십시오 ( 그림 1C ). 중심 결함을 만드는 데 도움이되는 성장판 각도에 대한 치과 용 바를 따라 시각적 인 선을 그립니다.
   5. 대뇌 피질 창에 들어가기 전에 회전 공구를 10,000RPM (재료 섹션에 명시된 회전 공구의 저속)으로 켜십시오.
   6. 적절한 각도와 방향으로 회전 도구를 사용하여 대뇌 피질 창을 입력하고 bur 마커가 피질 창과 정렬 될 때까지 회전 도구를 누릅니다. 적절한 깊이에 도달하면 회전 공구를 제거하십시오.
      참고 : 깨끗한 부상을주기 위해 생장 플레이트에 버를 사용하여 최소한의 시간을 사용하여 빠른 동작으로 성장 플레이트를 중단하십시오. 이것은 데이터 분석에 중요합니다.
2. 출혈이 예상되는 것처럼 대뇌 피질 창을 ~ 30 초 동안 거즈로 덥습니다.
3. 버 길이를 다시 측정하여 적절한 깊이의 손상을 확인하십시오 (6.1.2 단계).
   1. bur를 드릴 트랙에 넣고 (회전 도구를 끈 상태에서) 표시된 bur와 대뇌 피질 창을 정렬합니다 ( 그림 1D ).
4. 깊이가 불충분하면 회전 공구를 켜고 원하는 깊이로 밉니다.
   참고 : 드릴링의 두 번째 라운드가 이상적이지는 않지만, 성장판을 완전히 방해하는 것은 뼈 바의 개발에 가장 중요합니다.
5. 10mL 주사기와 23 게이지 바늘을 사용하여 ~ 3mL의 멸균 식염수로 드릴 트랙을 헹굽니다.
6. 거즈로 상처를 말리십시오.

7. 상해 후 절차

1. 생체 재료 기반 성장판 치료를 평가하는 경우, 적절한 크기의 바늘 (생체 재료 점도에 따라 18-26 게이지)을 사용하여 드릴 트랙을 통해 생체 재료를 손상 부위에 주사합니다.
   참고 : 성장 판 부상의 볼륨 ~ 3 & #181, L이고 드릴 트랙의 부피는 ~ 20 μL입니다. 성장판 손상 및 드릴 트랙에 주입 할 수있는 최대 물 체적은 20 ~ 25 μL입니다.
2. 3-0 폴리 글리콜 산 봉합선으로 근막을 봉합하여 상처를 닫습니다. 피질 창 위에 뼈 왁스를 적용하여 밑에있는 뼈를 분리합니다 (선택 사항).
3. 묻힌 봉합 또는 상처 클립으로 피부 절개를 닫습니다.
   참고 : 부상 부위에서 동물이 긁히고 상처가 생길 수 있으므로 상처 클립을 사용하는 것이 좋습니다.
4. isoflurane 마취에서 동물을 제거하고, 온난 담요에 놓고 깨어날 때까지 모니터하십시오.
5. 감염의 위험을 줄이려면 건조한 오토 클레이브 침구가 들어있는 새 케이지에 동물을 놓으십시오.
6. 수술 후 동물의 체중 감량을 허용하십시오.
7. 수술 후 72 시간 동안 매 12 시간마다 동물을 관찰하여 감염된 흔적이 없는지 확인하고 상처가 남아 있는지 확인하고 수술 후 관리하십시오( 예 : buprenorphine 0.05 mg / kg, 12 시간마다 36 시간, carprofen 5 mg / kg, 24 시간마다 72 시간).
8. 마취하에 수술 10 ~ 14 일 후 상처 클립을 제거하십시오.

결과

이 방법을 사용한 성공적인 성장판 손상은 관절 연골 표면을 손상시키지 않으면 서 경골 성장판의 중심을 붕괴시키는 것을 포함합니다. 뼈의 수복 조직은 부상 후 약 7 일에 시작된 것으로보고되었으며 마이크로 CT (micro computed tomography)로 시각화 한 것처럼 부상 후 28 일까지 완전히 발전합니다 ( 그림 2 ). 이 시점은 이전에 발표 된 데이터를 기반으로 뼈 형성?...

토론

성장판 손상 동물 모델은이 부상의 생물학적 기작에 대한 우리의 이해를 크게 증가시켜 잠재적으로 성장판 손상으로 고통받는 어린이에게보다 효과적인 치료 적 개입을 유도합니다. 성공적으로 뼈 바를 만들고이 작업에서 제시된 모델을 사용하여 생체 내에서 그 형성을 연구하기 위해서는 관절 연골을 파괴하지 않고 충분한 깊이로 천공하여 성장판을 파괴하는 것이 중요합니다. 동물 간?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scalpel handle	McKesson	MCK42332500
Needle holder	Stoelting	RS-7824
Adson tissue forceps	Sklar	50-3048
Iris Scissors	Sklar	47-1246
Rotary Tool	Dremel	7700	Variable speed rotary tool
Keyless Rotary Tool Chuck	Dremel	4486
Dental Burs	Dental Burs USA	FG6	Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins	Simpex Medical	T-078
Hair clippers	Wahl	5537N
3-0 PGA surutes	Oasis	MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2"	Covidien	441211
Povidone Iodine	McKesson	922-00801
Sterile saline	Vetone	510224
10 mL luer lock syringe	Becton Dickinson	309604
23 gauge needle	Becton Dickinson	305145
Isopropyl alcohol pads	Dynarex	1113
Isoflurane	IsoFlo	30125-2
Caliper	Mitutoyo	500-196-30
Carprofen	Rimadyl	27180
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals Inc	NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape	McKesson	25-517
Surgical Gloves	Uline	S-20204
#15 Scalpel Blade	Aven	44044
9 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-09
Reflex clip applier	World Precision Instruments	500345
Absorbant underpads	McKesson	MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer	VetEquip	911103
Germinator 500	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Warm water recirculator	Kent Scientific	TP-700
Absorbent Underpads	Medline Industries	MSC281230