Un modello di lesione della tibia di crescita del ratto per caratterizzare i meccanismi di riparazione e valutare le strategie di rigenerazione delle piastre di crescita

Riepilogo

La piastra di crescita è una regione cartilaginea nelle ossa lunghe dei bambini dove si verifica una crescita longitudinale. Quando feriti, il tessuto osseo può formare e pregiudicare la crescita. Descriviamo un modello di ratto di lesione della piastra di crescita che porta a tessuti di riparazione ossea, permettendo lo studio di meccanismi di riparazione e strategie di rigenerazione delle piastre di crescita.

Abstract

Un terzo di tutte le fratture pediatriche coinvolge la piastra di crescita e può causare una diminuzione della crescita ossea. La piastra di crescita (o physis) è il tessuto di cartilagine trovato alla fine di tutte le ossa lunghe nei bambini che è responsabile della crescita longitudinale dell'osso. Una volta danneggiata, i tessuti di cartilagine all'interno della piastra di crescita possono subire ossaficio precoce e portare ad un tessuto di riparazione ossea indesiderato, che forma un "baretto osseo". In alcuni casi, questa barra ossea può provocare deformità di crescita dell'osso, come le deformità angolari, o può fermare completamente la crescita longitudinale dell'osso. Attualmente non esiste un trattamento clinico che possa riparare completamente una piastra di crescita ferita. Utilizzando un modello animale di lesioni alla piastra di crescita per comprendere meglio i meccanismi alla base della formazione di barre ossee e per individuare i modi per inibire è una grande opportunità per sviluppare trattamenti migliori per le lesioni della piastra di crescita. Questo protocollo descrive come disfare la piastra di crescita tibiale prossimale del ratto con un difetto di foro. Questa smaLl modello animale produce in modo affidabile un baretto osseo e può provocare deformità di crescita simili a quelle osservate nei bambini. Questo modello permette di indagare sui meccanismi molecolari della formazione di barre ossea e serve come mezzo per testare le possibili opzioni di trattamento per le lesioni della piastra di crescita.

Introduzione

Le lesioni della piastra di crescita rappresentano il 30% di tutte le fratture pediatriche e possono causare una diminuzione della crescita ossea ¹ . Oltre alle fratture, le lesioni della piastra di crescita possono essere causate da altre eziologie, tra cui osteomielite ² , tumori ossee primari ³ , radiazioni e chemioterapia ⁴ e danni iatrogeni ⁵ . La piastra di crescita (o physis) è una regione della cartilagine alla fine delle ossa lunghe dei bambini che è responsabile della crescita longitudinale dell'osso. Aziona l'allungamento ossea attraverso l'ossificazione endocondrale; I condrociti subiscono la proliferazione e l'ipertrofia e vengono poi rimodellati dagli osteoblasti in arrivo per formare l'osso trabecolare ⁶ . La piastra di crescita è anche una zona debole dello scheletro in via di sviluppo, rendendola soggetta a lesioni. La principale preoccupazione per le fratture o le lesioni della piastra di crescita è che il tessuto di cartilagine danneggiato all'interno della piastra di crescita può bE sostituito con un tessuto di riparazione ossea indesiderato, noto anche come "bar". A seconda della sua dimensione e della sua posizione all'interno della piastra di crescita, il bony bar può portare a deformità angolari o arresto completo, una sequela devastante per bambini piccoli che non hanno ancora raggiunto la loro piena altezza ⁷ .

Attualmente non esiste alcun trattamento che possa riparare completamente una piastra di crescita ferita. Una volta che il barile osseo si forma, il medico deve decidere se rimuoverlo o meno. I pazienti con almeno 2 anni o 2 centimetri di crescita scheletrica rimanenti e con un baretto osseo che copre meno del 50% della superficie della piastra di crescita sono solitamente candidati alla resezione ossea a barre ⁸ . La rimozione chirurgica del baretto osseo è spesso seguita dall'interposizione di un innesto di grasso autologo per impedire la riformazione del tessuto osseo e per consentire alla piastra di crescita circostante per rimediare la crescita. Tuttavia, queste tecniche sono problemiEmatic e spesso falliscono, portando alla ricorrenza ossea e continuando ad avere effetti negativi sulla crescita ⁹ . C'è una necessità fondamentale di sviluppare trattamenti efficaci che non solo impediscono la formazione di barili ossei, ma anche rigenerano la cartilagine della piastra di crescita, ripristinando così l'allungamento ossea normale.

I meccanismi molecolari sottostanti alla formazione del barile ossa devono ancora essere completamente chiariti. Una maggiore comprensione di questi meccanismi biologici potrebbe portare ad interventi terapeutici più efficaci per i bambini affetti da lesioni della piastra di crescita. Poiché lo studio di questi meccanismi negli esseri umani è difficile, sono stati utilizzati modelli animali, in particolare il modello di ratto di lesioni della piastra di crescita ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16} . Il metodo presentato in questoLa carta descrive come un difetto di foro di trivellazione nella piastra di crescita tibiale del ratto conduce a un tessuto di riparazione prevedibile e riproducibile che inizia la ossaficazione già nei primi 7 giorni dopo la lesione e forma un baretto osseo completamente riempito con rimodellamento a 28 giorni dopo la lesione ¹⁰ . Ciò fornisce un piccolo modello in vivo animale in cui studiare i meccanismi biologici della formazione del barile ossa, nonché valutare nuove terapie che potrebbero impedire il baretto osseo e / o rigenerare la cartilagine della piastra di crescita. Ad esempio, questo modello può essere utilizzato per testare biomateriali condrogenici che possono rigenerare la cartilagine della piastra di crescita e offrire un trattamento prezioso per i bambini affetti da lesioni della piastra di crescita. Le tecniche presentate in questo documento descriveranno i metodi chirurgici impiegati per produrre lesioni alla piastra di crescita e la successiva consegna dei biomateriali al sito di lesioni. Discuteremo anche i metodi per valutare la formazione di barre ossea e la riparazione del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure animali devono essere approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). Il protocollo animale per la seguente procedura è stato approvato dall'Università del Colorado Denver IACUC.

1. Ottenere i ratti

NOTA: a meno che non siano desiderati animali geneticamente modificati, i ratti di Sprague-Dawley immaturi di sei settimane non sono necessari al momento dell'intervento. Potrebbero essere potenzialmente utilizzati altri ceppi; Tuttavia, la maggior parte degli studi pubblicati sono stati eseguiti sui ratti di Sprague-Dawley.

2. Preparazione di forniture chirurgiche

1. Autoclave pacchetti di fornitura chirurgica che includono uno dei seguenti: # 3 maniglia per bisturi, supporto per aghi, pinze Adson e forbici per iride.
2. Autoclave i mandrini keyless. Le punte di trivellazione possono essere sterilizzate tra gli interventi chirurgici degli animali quando operano su più animali.
   NOTA: Le regole IACUC locali relative all'utilizzo di un intervento chirurgico sterileDevono essere rispettati gli strumenti icali su più animali. Ad esempio, l'Università del Colorado Denver IACUC consente di utilizzare uno strumento chirurgico da utilizzare fino a 5 animali prima della loro sospensione. Inoltre, gli attrezzi chirurgici devono essere sterilizzati a caldo utilizzando un sterilizzatore di perline tra gli animali. Per altri animali devono essere utilizzati ulteriori imballaggi chirurgici sterili.
3. Autoclave piedini Steinmann da 5 cm, uno per ogni animale.
   NOTA: Per ridurre il rischio di infezione, i piedini Steinmann non devono essere usati per più animali.
4. Autoclave frese dentali da 1,8 mm, una per ogni animale.
   NOTA: Per ridurre il rischio di infezione, le bacchette dentali non devono essere utilizzate per più animali.
5. Autoclave un applicatore di clip della ferita, se applicabile. In alternativa, possono essere utilizzate suture sepolte per chiudere lo strato cutaneo. Vedere la fase 7.3.
6. Se possibile, sterilizzare una perforatrice con irradiazione o sterilizzazione a gas.
7. Raccogliere le seguenti forniture supplementari: rasoio elettrico, steSiringhe di acido poliglicolico 3-0, garza sterile, povidone-iodio, salina sterile, siringhe sterili da 10 ml, aghi sterili a 23 gauze, tamponi di isopropilico, isoflurano, pinze, analgesici post-chirurgici ( ad esempio NSAID e buprenorfina) Teli chirurgici sterili, guanti chirurgici sterili, lame a scalpello sterile # 15, fermaglio sterile, macchina per anestesia, sterilizzatore di perle, rilievo di riscaldamento e sottopiedi assorbenti.

3. Anestesia e preparazione degli animali

1. Anestetizza l'animale introducendolo in una camera di induzione da 1 a 2 L che riceve un flusso di ossigeno da 1 L / min con 5% di isoflurano da un sistema di vaporizzazione con un sistema passivo di scavenging.
   NOTA: L'esposizione al 5% di isoflurano dovrebbe anestetizzare i ratti di 6 settimane entro 5 minuti.
2. Spostare l'animale sul sito chirurgico e mantenere l'animale sotto anestesia con 2 - 3% isoflurano usando un cono per il resto della procedura. Posizionare l'animale supino su un tampone di riscaldamento e un assorbimentoEnt underpad.
   NOTA: L'animale non deve essere fissato al tavolo chirurgico. Tenendo la gamba come specificato nei passaggi seguenti è un metodo sufficiente di stabilizzazione.
   NOTA: Tutte le procedure successive devono essere eseguite con l'animale sotto anestesia. 2 - 3% di isoflurano dovrebbe essere sufficiente a mantenere l'anestesia nei ratti di questa età. Ciò può essere confermato provando il riflesso bicolore di ritiro.
3. Amministrare analgesici intraoperatorie secondo politiche approvate istituzionalmente ( ad es. Buprenorfina a 0,05 mg / kg e carprofene a 5 mg / kg).

4. Preparazione della Tibia per la chirurgia

1. Rasare l'intera gamba posteriore dal malleolo mediale al bacino con un rasoio elettrico.
2. Misurare e registrare la lunghezza tibiale dall'altopiano tibiale anteriore al lato inferiore del malleolo mediale usando le pinze. In alternativa, misurare l'intera lunghezza tibiale usando raggi X o microCT ¹¹ Sup> ^{, 12 , 14} . Facoltativamente, misurare le dimensioni della piastra di crescita prima dell'intervento chirurgico usando raggi X o microCT.
3. Pulire il sito chirurgico spazzando l'intera gamba, l'addome e il genitali con tamponi di alcol e poi con garza imbevuta di povidone-iodio.
   NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di infezione, tutte le procedure successive, fino a quando l'animale viene rimosso dall'anestesia (punto 7.4), deve essere eseguito in condizioni sterili. Tutti i materiali chirurgici devono essere accessibili usando la tecnica sterile. L'uso di un assistente chirurgico è altamente raccomandato per mantenere la sterilità durante l'intervento chirurgico.
4. Indossare guanti chirurgici sterili, posizionare un drappo chirurgico sterile fenestrato sopra l'animale, lasciando le gambe esposte attraverso la fenestrazione centrale.

5. Procedura chirurgica per accedere alla piastra di crescita

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Figura 1: Panoramica della procedura chirurgica.
A) Ubicazione di diversi marcatori anatomici utilizzati per creare una lesione di piastra di successo. La capsula del ginocchio è immediatamente posteriore al kneecap (bianco), separando la tibia dal femore. La piastra di crescita tibiale (rosso scuro) può essere visto inferiori a quella del kneecap e aggirare la tibia. La piastra di crescita prossimale è un piano piuttosto piano, ad eccezione del quarto anteriore che forma un piano diagonale. L'intersezione di questi due piani forma l'angolo della piastra di crescita, che viene utilizzato per un'adeguata angolazione del trapano. L'inserimento del semitendinosus è dove i muscoli del quadricipite si inseriscono nella tibia posteriore. B) Incisione attraverso l'aspetto anteriore-mediale dei tessuti molli tibiali per accedere all'osso corticale. C) Posizione della finestra corticale che utilizza l'allineamento con l'inserimento del semitendinosso distale come punto di riferimento. D) ValutazioneLa profondità del danneggiamento allineando il bordo sulla barra dentale con la finestra corticale.

1. Effettuare un'incisione di 1 cm attraverso la pelle lungo l'aspetto mediale-anteriore della tibia prossimale usando una maniglia a 3 bisturi e una lama # 15, partendo dall'estremità distale del condile femorale mediale ( Figura 1A ).
   1. Tirare la pelle contro l'osso sottostante e tenere saldamente la gamba durante l'incisione.
      NOTA: Questo manterrà l'incisione cutanea nella posizione desiderata e aiuterà nella creazione di una incisione pulita. Non premere troppo saldamente con il bisturi per evitare di forare la capsula del ginocchio, che potrebbe provocare sanguinamenti profondi e rendere difficili i rimanenti passi.
2. Prendere nota di importanti marcatori anatomici, tra cui: 1) la piastra di crescita, 2) l'angolo della piastra di crescita, 3) la capsula del ginocchio e 4) l'inserimento di semitendinosus ( figura 1A ).
3. Usando il bisturi, fai un'incisione di ~ 0,5 cm attraverso la thFascia e tessuti molli sull'aspetto mediale-anteriore della tibia prossimale, dalla piastra di crescita al fondo dell'incisione cutanea ( Figura 1B ).
4. Disseccare o raschiare delicatamente la fascia e i tessuti molli dalla tibia usando il bisturi ( Figura 1B ).
   NOTA: È importante rimuovere o raschiare il maggior numero di tessuti molli dalla tibia, in modo da non interferire con le fasi di foratura.
5. Drill una finestra corticale attraverso l'osso corticale tibiale alla diafisi con un perno Steinmann attaccato ad un utensile rotativo a 10.000 giri / min. (Bassa velocità dello strumento rotante specificato nella sezione dei materiali). Crea la finestra corticale in modo che si allinea con l'inserimento distale di semitendinosus ( Figura 1C ).
   1. Tenere il trapano perpendicolare alla diafisi tibiale e farsi strada lentamente, facendo attenzione a non perforare l'altro lato della diafisi; La finestra corticale deve essere solo di ~ 2 mm in profondità e sarà fatta quando noSi sente la resistenza.
   2. Come sopra, tenere saldamente la gamba con l'altra mano.
      NOTA: Per questa fase è possibile utilizzare una fresa dentale. Tuttavia, se si utilizza una borsetta dentale, la gamba deve essere tenuta molto salda per creare una finestra corticale pulita e per assicurarsi che il bur abbassa e taglia l'osso nella posizione desiderata. Per questo passo è consigliato un perno Steinmann, data la sua capacità di taglio molto superiore.
6. Dab la finestra corticale con garza, come si prevede l'emorragia leggera.

6. Creazione della lesione della piastra di crescita

1. Creare un danno nel foro attraverso la piastra di crescita centrale utilizzando un foro dentale da 1,8 mm attaccato ad un utensile rotante.
   NOTA: La profondità, l'angolo e la direzione correnti sono fondamentali per la disfunzione della piastra di crescita centrale ( Figura 1C e D ). Le istruzioni per ottenere la profondità, l'angolo e la direzione appropriati sono riportate di seguito.
   1. Per misurare la profondità appropriata utilizzando il burro dentale, si prega di iniziareAllineando l'estremità del fusto dentale con la tibia prossimale, dove il semitendinoso attraversa la capsula del ginocchio ( Figura 1C ).
   2. Con l'estremità del fusto dentale alla capsula del ginocchio, seguire l'albero di bara lungo il semitendinosus e fare notare dove il fusto si allinea con la finestra corticale. Questa è la profondità appropriata per il bur per interrompere completamente la piastra di crescita senza interrompere la superficie articolare ( Figura 1C ).
      NOTA: il fusto dentale viene utilizzato per misurare la profondità appropriata. Il bur può essere contrassegnato con un indicatore permanente nella posizione in cui si allinea con la finestra corticale per riferirsi alla profondità durante la perforazione. Tuttavia, se i marcatori anatomici e il protocollo di cui sopra sono strettamente collegati, il primo smusso sulle barre dentarie specificato qui (FG6) allineerà correttamente la finestra corticale (come si vede nella figura 1C ).
   3. Per raggiungere l'angolo di foratura appropriato, tenere premuto lo strumento rotante con un angolo di meno tHan 30 ° rispetto alla diafisi tibiale.
      NOTA: questa è una approssimazione visiva.
   4. Per raggiungere la direzione di foratura appropriata, puntare sull'angolo della piastra di crescita ( Figura 1C ). Disegnare una linea visiva lungo la bocca dentale all'angolo della piastra di crescita per aiutare a creare un difetto centrale.
   5. Accendere l'attrezzo rotante a 10.000 giri / minuto (bassa velocità dello strumento rotante specificato nella sezione dei materiali) prima di entrare nella finestra corticale.
   6. Con l'utensile rotante ad angolo e direzione appropriati, entrare nella finestra corticale e spingere l'utensile rotante finché l'indicatore di foratura non si allinea con la finestra corticale. Una volta raggiunta la profondità appropriata, rimuovere l'utensile rotante.
      NOTA: eseguire la rottura della piastra di crescita in un movimento rapido, usando il tempo minimo con il fusto nella piastra di crescita per creare un danno pulito. Questo è importante per l'analisi dei dati.
2. Dab la finestra corticale con garza per ~ 30 s, come sanguinamento è previsto.
3. Assicurare la profondità appropriata del danneggiamento ripetendo la lunghezza della fresa (passo 6.1.2).
   1. Inserire il foro nella pista di trapano (con l'utensile rotante spento) e allineare il segno contrassegnato con la finestra corticale ( figura 1D ).
4. Se la profondità è insufficiente, ruotare l'attrezzo rotante e spingerla fino alla profondità desiderata.
   NOTA: Anche se un secondo giro di foratura non è ideale, interrompere completamente la piastra di crescita è fondamentale per lo sviluppo del baretto osseo.
5. Sciacquare la pista con circa 3 ml di soluzione salina sterile usando una siringa da 10 ml e un ago da 23 gauge.
6. Asciugare la ferita con la garza.

7. Procedure post-Injury

1. Se si valuta un trattamento a base di biomateria basata sulla piastra di crescita, iniettare il biomateriale attraverso la pista di trapano nel sito di lesioni usando un ago adeguatamente dimensionato (da 18 a 26 gauge, a seconda della viscosità biomateriale).
   NOTA: Il volume della lesione della piastra di crescita è ~ 3 & #181; L e il volume del tracciato è di ~ 20 μL. Il volume massimo di materiale che può essere iniettato nella lesione della piastra di crescita e nella traccia di trapano è compresa tra 20 e 25 μL.
2. Chiudere la ferita suturando la fascia con suture di acido poliglicolico 3-0. Applicare la cera ossea sopra la finestra corticale per isolare l'osso sottostante (facoltativo).
3. Chiudere l'incisione cutanea con suture secche o clip di ferita.
   NOTA: Si raccomanda l'uso di clip di ferita, in quanto l'animale graffia nel sito di lesioni e può aprire la ferita.
4. Togliere l'animale dall'anestesia isoflurana, posizionarla su una coperta riscaldante e controllarla finché non si sveglia.
5. Per ridurre il rischio di infezione, mettere l'animale in una nuova gabbia contenente biancheria secca e autoclavata.
6. Consentire all'animale di sopportare il peso post-operativo.
7. Monitorare l'animale ogni 12 h per 72 h dopo l'intervento chirurgico per verificare i segni dell'infezione, per assicurare che le clip della ferita rimangano in posizione e ad amministrare postoperativamenteE analgesici secondo le politiche istituzionalmente approvate ( ad esempio buprenorfina a 0,05 mg / kg ogni 12 h per 36 h e carprofene a 5 mg / kg ogni 24 h per 72 h).
8. Rimuovere le clip della ferita 10 - 14 giorni dopo l'intervento chirurgico sotto anestesia.

Risultati

Il successo della ferita della piastra di crescita con questo metodo comporta la rottura del centro della piastra di crescita tibiale senza interrompere la superficie della cartilagine articolare. Il tessuto di riparazione ossea è stato riportato all'inizio di circa 7 giorni dopo la lesione e diventa pienamente sviluppato da 28 giorni dopo la lesione ¹³ , come visualizzato dalla micro tomografia computerizzata (micro CT) ( Figura 2 ). Anche s...

Discussione

Un modello di animali di lesioni sulla piastra di crescita notevolmente aggiunge alla nostra comprensione dei meccanismi biologici di questo pregiudizio, portando così potenzialmente ad interventi terapeutici più efficaci per i bambini affetti da lesioni della piastra di crescita. Per creare con successo un bony bar e per studiare la sua formazione in vivo utilizzando il modello presentato in questo lavoro, è fondamentale per interrompere la piastra di crescita perforando ad una profondità sufficiente, senz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scalpel handle	McKesson	MCK42332500
Needle holder	Stoelting	RS-7824
Adson tissue forceps	Sklar	50-3048
Iris Scissors	Sklar	47-1246
Rotary Tool	Dremel	7700	Variable speed rotary tool
Keyless Rotary Tool Chuck	Dremel	4486
Dental Burs	Dental Burs USA	FG6	Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins	Simpex Medical	T-078
Hair clippers	Wahl	5537N
3-0 PGA surutes	Oasis	MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2"	Covidien	441211
Povidone Iodine	McKesson	922-00801
Sterile saline	Vetone	510224
10 mL luer lock syringe	Becton Dickinson	309604
23 gauge needle	Becton Dickinson	305145
Isopropyl alcohol pads	Dynarex	1113
Isoflurane	IsoFlo	30125-2
Caliper	Mitutoyo	500-196-30
Carprofen	Rimadyl	27180
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals Inc	NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape	McKesson	25-517
Surgical Gloves	Uline	S-20204
#15 Scalpel Blade	Aven	44044
9 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-09
Reflex clip applier	World Precision Instruments	500345
Absorbant underpads	McKesson	MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer	VetEquip	911103
Germinator 500	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Warm water recirculator	Kent Scientific	TP-700
Absorbent Underpads	Medline Industries	MSC281230