ラット脛骨成長プレート傷害モデルによる修復機構の特徴付けと成長プレートの再生戦略の評価

要約

成長プレートは、縦の成長が起こる子供の長骨の軟骨領域である。負傷した場合、骨組織が形成され、成長を阻害する可能性があります。本発明者らは、骨修復組織を導く成長プレート損傷のラットモデルを説明し、修復メカニズムおよび成長プレート再生戦略の研究を可能にする。

要約

すべての小児骨折の3分の1が成長プレートを伴い、骨の成長が損なわれる可能性があります。成長プレート（または体液）は、縦骨成長の原因となる小児のすべての長骨の末端に見られる軟骨組織である。一旦損傷すると、成長プレート内の軟骨組織は早期の骨化を受け、「骨の棒」を形成する望ましくない骨修復組織につながる可能性がある。いくつかの場合、この骨の棒は、角変形などの骨成長の変形をもたらし得るか、またはそれは縦方向の骨成長を完全に停止させることができる。現在、損傷した成長プレートを完全に修復することができる臨床的処置はない。骨形成の根底にあるメカニズムをよりよく理解し、それを阻害する方法を特定するために、成長プレート損傷の動物モデルを使用することは、成長プレート損傷に対するより良い治療法を開発する絶好の機会である。このプロトコールは、ドリルホール欠陥を用いてラット近位脛骨成長プレートを破壊する方法を記載する。このSMA動物モデルは確実に骨バーを生成し、子供に見られるものと同様の成長変形を生じさせる可能性がある。このモデルは、骨バー形成の分子メカニズムの研究を可能にし、成長板損傷の潜在的治療選択肢を試験する手段として役立つ。

概要

成長板の傷害はすべての小児骨折の30％を占め、骨の成長障害をもたらす可能性があります¹ 。骨折に加えて、成長板損傷は、骨髄炎² 、原発性骨腫瘍³ 、放射線および化学療法⁴ 、および医原性損傷⁵を含む他の病因によって引き起こされる可能性がある。成長プレート（またはフィシス）は、縦骨成長の原因となる子供の長骨の端にある軟骨領域である。これは、内軟骨の骨化を通じて骨の伸長を促進する。軟骨細胞は増殖および肥大を受け、次に骨芽細胞を形成するために入骨芽細胞によって改造される⁶ 。成長板はまた、発展中の骨格の弱い領域であり、怪我をしやすい。成長プレートの骨折または損傷に関する主な懸念は、成長プレート内の損傷した軟骨組織が、eは不要な骨修復組織で置き換えられ、これは「骨の棒」としても知られています。成長板の大きさや位置によっては、骨の棒が角度の変形や完全な成長停止を引き起こす可能性があります。これはまだ完全な高さに達していない幼児のための壊滅的な後遺症です。

現在、損傷を受けた成長プレートを完全に修復できる治療法はない。骨バーが形成されたら、臨床医はそれを外科的に取り除くかどうかを決定しなければならない⁸ 。少なくとも2年または2 cmの骨格成長が残っており、骨板の面積が成長板面積の50％未満である患者は、通常、骨バー切除の候補となります⁸ 。骨バーの外科的除去は、骨組織の再形成を防止し、周囲の無傷の成長プレートが成長を回復させることを可能にするために、自己脂肪グラフトを挿入することがしばしば続く。しかし、これらの技術はproblエモティックであり、しばしば失敗し、骨の再発や成長への悪影響が続いている⁹ 。骨形成を防止するだけでなく、成長プレート軟骨を再生し、正常な骨の伸長を回復させる効果的な治療法を開発することが極めて重要である。

骨梁形成の根底にある分子メカニズムは、まだ完全に解明されていない。これらの生物学的機構をより深く理解すれば、成長板の傷害を患っている子供のためのより効果的な治療的介入につながる可能性がある。ヒトにおけるこれらのメカニズムの研究は困難であるため、動物モデル、特に成長プレート傷害のラットモデル10,11,12,13,14,15,16が使用されている。これに提示された方法傷害後7日目に骨化を開始し、損傷後28日目にリモデリングを伴う完全に成熟した骨バーを形成する、予測可能で再現性のある修復組織へのラット脛骨成長板の穿孔欠損がどのように導くかを記載している。これは、骨バー形成の生物学的メカニズムを研究するとともに、骨バーを予防し、および/または成長プレート軟骨を再生することができる新規治療法を評価するための小動物in vivoモデルを提供する。例えば、このモデルは、成長プレート軟骨を再生することができ、成長プレート損傷を患う子供のための貴重な治療を提供することができる軟骨形成性生体材料を試験するために使用することができる。この論文で提示されている技術は、傷害部位への生育板損傷およびその後の生体材料の送達を生成するために使用される外科的方法を記載する。また、骨バーの形成と組織の修復を評価する方法についても検討します。

プロトコル

すべての動物の手続きは、地元の動物実験および使用委員会（IACUC）の承認を受けなければなりません。以下の手順のための動物プロトコールは、コロラド大学デンバーIACUCによって承認された。

1.ラットを得る

注：遺伝子組み換え動物が望まれない限り、6週齢の骨格未熟のSprague-Dawleyラットが手術時に必要とされる。他の株も潜在的に使用することができる。しかし、公開された研究の大部分はSprague-Dawleyラットで実施されている。

2.外科用品の準備

1. ＃3メスハンドル、針ホルダー、Adson鉗子、アイリスハサミの各1つを含むオートクレーブ外科用サプリメントパック。
2. キーレスドリルチャックをオートクレーブします。ドリルチャックは、複数の動物を操作する場合、動物の手術の間にビーズを滅菌してもよい。
   注：無菌手術の使用に関連するローカルIACUC規則複数の動物のツールを遵守しなければなりません。例えば、コロラド大学デンバーIACUCは、中止する前に最大5匹の動物に1つの外科ツールセットを使用させることができます。さらに、外科用具は動物間のビーズ滅菌機を用いて加熱殺菌しなければならない。追加の無菌外科用パックを追加の動物に使用しなければならない。
3. オートクレーブ5cmのスタインマン（Steinmann）ピン（各動物につき1本）。
   注：感染の危険性を減らすために、スタインマンピンは複数の動物に使用してはなりません。
4. オートクレーブ1.8mmの歯科用バール（各動物につき1本）。
   注：感染の危険性を減らすために、複数の動物に歯科用バーを使用してはなりません。
5. 該当する場合は、創傷クリップアプリケータをオートクレーブする。あるいは、埋め込まれた縫合糸を用いて皮膚層を閉じることができる。手順7.3を参照してください。
6. 可能であれば、照射またはガス滅菌を使用して回転ドリルを滅菌する。
7. 電気シェーバー、ステーリウ-3-0ポリグリコール酸縫合糸、滅菌ガーゼ、ポビドンヨード、滅菌生理食塩水、滅菌10mLシリンジ、滅菌23ゲージ針、イソプロピルアルコールスワブ、イソフルラン、キャリパー、手術後鎮痛薬（NSAIDおよびブプレノルフィンなど）滅菌手術用手袋、無菌＃15メス刃、滅菌創傷クリップ、麻酔機、ビーズ滅菌機、加温パッド、および吸収性アンダーパッドを含むが、これらに限定されない。

3.麻酔と動物の準備

1. 受動的な掃気システムを備えた気化システムから5％イソフルランで1L /分の酸素流を受ける1Lから2Lの誘導チャンバに動物を導入することによって動物を麻酔する。
   注：5％イソフルランへの暴露は、6週齢のラットを5分以内に麻酔する必要があります。
2. 動物を手術部位に移動させ、手順の残りの部分にノーズコーンを用いて2〜3％のイソフルランで動物を麻酔下に維持する。動物の仰臥位を温かいパッドの上に置き、吸収剤アンダーパッド。
   注：動物は手術台に固定する必要はありません。以下の手順で指定されているように脚を保持することは、安定化の十分な方法です。
   注：すべてのその後の手順は、麻酔下の動物で行う必要があります。 2〜3％イソフルランは、この年齢のラットにおいて麻酔を維持するのに十分であるべきである。これは、二足歩行離脱反射を試験することによって確認することができる。
3. 施設で承認された方針（ 例えば、ブプレノルフィン0.05mg / kg、カルプロフェン5mg / kg）に従って、術中鎮痛薬を投与する。

4.手術用脛骨の準備

1. 電気シェーバーを使って内鞘から骨盤までの後肢全体を剃ります。
2. キャリパーを使用して、前脛骨プラトーから内頸髄の下側までの脛骨の長さを測定し、記録する。あるいは、X線またはマイクロCT ¹¹を使用して脛骨の長さ全体を測定する ^{、 12,14} 。必要に応じて、X線またはマイクロCTを使用して手術前に成長プレートの寸法を測定する。
3. 脚、腹部、生殖器全体をアルコールスワブで拭き、次にポビドンヨードを浸したガーゼで拭いて手術部位を掃除します。
   注：感染のリスクを最小限に抑えるため、動物が麻酔から取り除かれるまで（ステップ7.4）、滅菌条件下で行わなければならない。すべての外科用材料に無菌技術を用いてアクセスしなければならない。手術中に無菌性を維持するためには、手術助手の使用を強くお勧めします。
4. 滅菌手術用手袋を着用し、動物の上に有窓の無菌手術用ドレープを置き、脚を中央窓を通して露出させたままにする。

5.成長プレートにアクセスするための手術手順

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図1：手術手順の概要。
A）成長板損傷を成功させるために使用されるいくつかの解剖学的マーカーの位置。膝蓋骨は、脛骨を大腿骨から分離して、膝蓋骨のすぐ後（白い）にある。脛骨成長板（暗赤色）は、膝蓋骨より劣って見え、脛骨を回避することができる。近位の成長プレートは、斜めの平面を形成する前四分円を除いて、ほとんど平坦な平面である。これらの2つの面の交点は、適切な穿孔角度に使用される成長板角度を形成する。半腱様筋の挿入は、四頭筋が後脛骨に挿入される箇所である。 B）皮質骨にアクセスするための脛骨軟組織の前内側面を通る切開。 C）遠位半硬直挿入を基準点としてアラインメントを用いた皮質ウインドウの位置。 D）評価歯ブラシの斜面を皮質窓と整列させることによって損傷の深さを測定する。

1. ＃3のメスのハンドルと＃15のブレードを使用して、内側の大腿顆の遠位端から開始して、近位の脛骨の内側 - 前方の側面に沿って皮膚を通して約1cmの切開を行う（ 図1A ）。
   1. 下にある骨に皮膚をしっかりと引き、切開をしながら脚をしっかりと保持します。
      注：これは、皮膚の切開部を所望の位置に保ち、きれいな切開部の形成を助ける。メスをしっかりと押して膝の穿刺を避けるようにしないと、多量の出血が発生し、残りのステップが困難になります。
2. 1）成長プレート、2）成長プレートの角度、3）膝のカプセル、および4）半腱様索の挿入（ 図1A ）を含む重要な解剖学的マーカーを記録する。
3. メスを使って、〜0.5cmの切開をthe近位の脛骨の内側 - 前側の側面の筋膜および軟部組織を、成長プレートから皮膚切開部の底部に移植する（ 図1B ）。
4. メスを使用して、脛骨から筋膜および軟部組織を静かに切開または削り取る（ 図1B ）。
   注記：穿孔のステップを妨げないようにできるだけ多くの軟組織を脛骨から取り除くか削り取ることが重要です。
5. 回転ツールに10,000 rpmで取り付けられたSteinmannピン（材料のセクションで指定された回転ツールの低速）を用いて、骨幹の脛骨皮質骨を通って皮質の窓を穿孔する。遠位の半腱弓挿入（ 図1C ）と整列するように皮質ウインドウを作成する。
   1. ドリルを脛骨骨幹に対して垂直に保持し、骨幹の他の側面を穿孔しないように注意しながら、ゆっくりと穿孔する。皮質のウインドウは深さが約2mmである必要があり、耐性が感じられる。
   2. 上記のように、もう一方の手で脚をしっかりと保持します。
      注：このステップでは、歯科用バーを使用することができます。しかし、歯科用バーを使用する場合、脚はきれいな皮質の窓を作り、バーが所望の位置に骨をつかんで切断するようにしっかりと保持しなければならない。優れた切断能力を備えているため、このステップではSteinmannピンが推奨されます。
6. 軽い出血が予想されるので、ガーゼ皮質ウィンドウをダブします。

6.成長プレート損傷の作成

1. 回転ツールに取り付けられた1.8 mmの歯科用バーを使用して、中央の成長プレートを介してドリルホール損傷を作成します。
   注：中央の成長プレートを破壊するには、適切な深さ、角度、および方向が重要です（ 図1CおよびD ）。適切な深さ、角度、および方向を得るための指示を以下に示す。
   1. 歯科用バーを使用して適切な深さを測定するために、begi歯科用バーの端部を近位脛骨と整列させることにより、膝窩を横切る半腱様棘が形成される（ 図1C ）。
   2. 膝のカプセルに歯科用バールの終わりで、半腱様筋に沿ってバールシャフトに続き、バールが皮質の窓と整列する場所を書き留めます。これは、バーが関節面を乱さずに成長プレートを完全に破壊する適切な深さである（ 図1C ）。
      注：歯科用バーは、適切な深さを測定するために使用されます。穿孔は、穿孔中に深さを参照するために皮質窓と整列する位置に恒久的なマーカーでマークすることができる。しかし、解剖学的マーカーおよび上記のプロトコルが緊密に参照されている場合、ここで指定された歯科用バールの第1の斜角（FG6）は、皮質窓（ 図1Cに示されるように）と適切に位置合わせされる。
   3. 適切なドリル角度を得るには、回転ツールをt脛骨骨幹に対して30°の角度をなしている。
      注：これは視覚的な近似です。
   4. 適切なドリルの方向を得るには、成長プレートの角度を目標にします （ 図1C ）。デンタルバーに沿って成長板角度に視線を引いて、中央の欠点を作り出すのを助ける。
   5. 大脳皮質のウィンドウに入る前に、回転ツールを10,000RPM（材料のセクションで指定された回転ツールの低速）にします。
   6. 回転ツールを適切な角度と方向に動かして、皮質ウィンドウに入り、バーマーカーが皮質ウィンドウと整列するまで回転ツールを押します。適切な深さに達したら、回転ツールを取り外します。
      注：クリーンな傷をつくるために、成長プレートにバーを付けて最小限の時間を使って、1つの迅速な動きで成長プレートの破壊を実行します。これはデータ分析にとって重要です。
2. 出血が予想されるので、〜30秒間ガーゼ皮質ウィンドウをダブします。
3. バールの長さを再度測定して、適切な怪我の深さを確保する（ステップ6.1.2）。
   1. ドリルトラックにバーを挿入し（ロータリツールをオフにして）、マーキングされたバーを皮質窓に合わせます（ 図1D ）。
4. 深さが不十分な場合は、回転ツールをオンにして目的の深さまで押します。
   注：2回目の掘削は理想的ではありませんが、成長プレートを完全に破壊することは、骨バーの開発にとって最も重要です。
5. 10mLシリンジと23ゲージ針を使用して〜3mLの滅菌生理食塩水でドリルトラックをすすいでください。
6. ガーゼで傷を乾燥させる。

7.傷病手続

1. バイオマテリアルベースの成長プレート処理を評価する場合は、適切なサイズの針（生体材料の粘度に応じて18〜26ゲージ）を使用して、ドリルトラックを通して損傷部位に生体材料を注入します。
   注：成長板の損傷の容積は〜3＆＃181; Lであり、ドリルトラックの体積は約20μLである。成長プレート損傷およびドリルトラックに注入できる材料の最大量は、20〜25μLである。
2. 3-0ポリグリコール酸縫合糸で筋膜を縫合して創傷を閉じる。皮質ウインドウの上に骨ワックスを塗り、下にある骨を隔離します（オプション）。
3. 埋め込まれた縫合糸または創傷クリップで皮膚切開部を閉じる。
   注意：動物が傷害部位で引っ掻き傷を開ける可能性があるため、創傷クリップをお勧めします。
4. イソフルラン麻酔から動物を取り出し、暖かい毛布に置き、目が覚めるまでモニターする。
5. 感染の危険性を減らすために、動物を乾燥したオートクレーブ寝具を入れた新しいケージに入れてください。
6. 動物は術後に体重を支えることができます。
7. 手術の72時間後に動物を12時間毎にモニターし、感染の兆候を確認し、創傷クリップが所定の位置に残っていることを確認し、術後（ 例えば、ブプレノルフィン0.05mg / kgを12時間毎に36時間、カルプロフェンを5mg / kgで24時間毎に72時間）。
8. 麻酔下手術の10〜14日後に創傷クリップを除去する。

結果

この方法を用いる成功した成長板損傷は、関節軟骨表面を崩壊させることなく脛骨成長板の中心を破壊することを含む。骨髄修復組織は損傷後約7日目に始まると報告されており、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）によって視覚化されるように、損傷後28日目までに完全に発達する（ 図2 ）。以前に発表されたデータに基づいて骨形成の開始お...

ディスカッション

成長傷害動物モデルは、この傷害の生物学的機構の理解に大きく貢献し、潜在的に成長板損傷を患っている子供のためのより効果的な治療的介入につながる可能性がある。この作業で提示されたモデルを使用して骨バーを正常に作製し、 in vivoでその形成を研究するには、関節軟骨を破壊することなく十分な深さまで穿孔することが重要です。動物間での外科的実施の変化、およびよ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scalpel handle	McKesson	MCK42332500
Needle holder	Stoelting	RS-7824
Adson tissue forceps	Sklar	50-3048
Iris Scissors	Sklar	47-1246
Rotary Tool	Dremel	7700	Variable speed rotary tool
Keyless Rotary Tool Chuck	Dremel	4486
Dental Burs	Dental Burs USA	FG6	Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins	Simpex Medical	T-078
Hair clippers	Wahl	5537N
3-0 PGA surutes	Oasis	MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2"	Covidien	441211
Povidone Iodine	McKesson	922-00801
Sterile saline	Vetone	510224
10 mL luer lock syringe	Becton Dickinson	309604
23 gauge needle	Becton Dickinson	305145
Isopropyl alcohol pads	Dynarex	1113
Isoflurane	IsoFlo	30125-2
Caliper	Mitutoyo	500-196-30
Carprofen	Rimadyl	27180
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals Inc	NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape	McKesson	25-517
Surgical Gloves	Uline	S-20204
#15 Scalpel Blade	Aven	44044
9 mm wound clips	Fine Science Tools	12032-09
Reflex clip applier	World Precision Instruments	500345
Absorbant underpads	McKesson	MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer	VetEquip	911103
Germinator 500	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Warm water recirculator	Kent Scientific	TP-700
Absorbent Underpads	Medline Industries	MSC281230