בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

Summary

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

Abstract

רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר. תאים decidual, המורכב בעיקר תאי סטרומה decidualized של תאים חיסוניים, אחראים הפרשת גורמים הורמונליים דלקתית אשר הם קריטיים עבור הבלסטוציסט מוצלחת השרשה, פיתוח היפרדות לשחק תפקיד חניכה של העבודה לטווח, לידה מוקדמת. רבים הריון לסיבוכים לפליטת של איזון עדין של אוכלוסיות תאים שונים הכוללת רותמי. שינויים ביחס של סוגי תאים decidual מסוים עשוי לשבש תהליכים חיוניים אלה ולהגביר את הסיכון לפתח סיבוכים חמורים של ההריון, כגון כשל השרשה של העובר, פיגור גדילה תוך רחמי, רעלת, צירי. פרוטוקול שמפורטות כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידודו של התאים decidual העיקרי של האדם שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. על ידי שילוב עיכול אנזימטי ובהפסקות מכני עדין של הרקמה decidual, הושג תשואה גבוהה של תאים decidual עם כמעט ללא זיהום chorion. חשוב, מאופיינים מבודד תאים decidual (תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (% 1) או trophoblast (0.01%) תאים) ומתוחזק הכדאיות גבוהים (80%) אשר אושר ע י ססגוניות assay cytometry זרימה הדמיה. פרוטוקול זה ספציפית parietalis רותמי, ניתן להתאים בשליש הראשון והשני placentae. מבודדת בעבר, תאים decidual יכול לשמש עבור מספר רב של יישומים ניסיוני במטרה להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא decidual שונים של סיבוכים בהריון.

Introduction

רירית הרחם, אחד הפעילים ביותר למבוגרים נקבה ברקמות, עובר שיפוץ דרמטי בכל מחזור הוסת בתגובה לגירוי על ידי השחלה הורמונים, אסטרוגן (E2) ופרוגסטרון (P4). רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר שנוצר עד לסוף השלב postovulatory כתוצאה מונחה P4 בידול בעקבות השלב proliferative E2-הדומיננטי. תאים decidual אחראים הפרשת ההורמונים גורמים הבלסטוציסט מוצלחת השרשה ועל פיתוח של הממשק עם רחם-היפרדות לשמירה על סובלנות אימהי להשתלת העובר.

Decidualization נדרש השרשת ובניה עוקבות של העורקים ספירלה decidual. תאי סטרומה רירית הרחם עוברים decidualization, תחת השליטה של P4, מחנה, במהלך שלב luteal מאוחר של המחזור החודשי¹. תהליך זה הוא יזם סביב כלי הדם מתפשט ברחבי stroma, רומז תפקידה להערכת ואבו ליקוציט סחר רגולציה. זה שינוי הסלולר מאופיין של מורפולוגיה מעגלית, גודל הגרעין גדל והרחבה של תוך-פלזמית קשה ו גולג'י². Decidualized תאי סטרומה הם מסוגלים לייצר paracrine גורמים התומכים הבלסטוציסט השרשה, המאופיינת על ידי הפרשת הורמונים (קרי פרולקטין) רבים, גורמי גדילה אנגיוגנזה, אינסולין גורם גדילה מחייב חלבון-1 (IGFBP-1), פרוסטגלנדין (עמוד) E (ממריץ של מחנה תאיים), ציטוקינים, מטריצה חוץ-תאית רכיבים וחומרים מזינים חיוניים עבור היפרדות השרשה ופיתוח^3,4,5,6 .

האוכלוסייה תא decidual לא מורכבת אך ורק תאי סטרומה decidualized אבל מכיל גם אוכלוסיות גדולות, הריון ספציפי ליקוציט decidual. Decidualization כרוך קרדיוגני מקומי חולף זרם של תאים הטבעיים (NK) רוצח, תאי-T, תאים דנדריטי macrophages. Subpopulation ליקוציט הגדול הוא תאי NK הרחם, הכוללת כ- 50-70% של כל לויקוציטים אימהי שחדר רותמי אשר הם מקור של ציטוקינים וגורמים האנגיוגנזה אשר עשויים לסייע בתהליך decidualization, לודיג מספר לאורך כל ההריון⁷. מקרופאגים, להיות subpopulation השנייה בגודלה של תאים חיסוניים, נמצאות סביב האתר השרשה ולהגדיל במהלך הריון⁸. הם מקור של ציטוקינים, צמיחה גורמים כגון המושבה מגרה פקטור (CSF-1)⁹, הגידול נקרוזה מקדם α (TNFα)¹⁰ ופרוסטגלנדין (עמוד) E¹¹.

לאורך כל ההריון, לפני הלידה המונח, רותמי היא המקור העיקרי של ציטוקינים ו נוגדנים אחראית ליקוציט היקפיים אימהי הפעלה והעברה עוקבות לרקמות הרחם ליזום עבודה. מחקרים שנעשו בבעלי חיים הראה כי ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים הם למעלה מוסדר ב רותמי העכבר במהלך העבודה, כגון TNF-a, IL-6, IL-12, ו- IL-1b¹². ב האדם רותמי, ציטוקינים פרו דלקתיים IL-1b, IL-6 ו- IL-8 (הגדולות chemoattractant נויטרופילים) התערוכה ביטוי גבוה יותר במהלך העבודה לעומת לא העבודה¹³. אלו ומופרש ציטוקינים תוצאה הפעלת ואת זרם של לויקוציטים אל רקמות decidual¹⁴; מקרופאג decidual, נויטרופילים בחדירת שני האדם ואת עכברוש ביבוא במהלך תקופת העבודה, עם חדירת decidual שקדמו myometrial 4-fold רבתי, המציינת את מפל של הפעלת בין רקמות הרחם שני סמוכים זה ¹⁵. אלה שחדר לויקוציטים לייצר PGs מסוגל להפעיל התכווצויות סינכרונית של ה myometrium¹⁶, מטריקס metalloproteinases (MMPs) ליזום ממברנה לקרע^17,18, כמו גם ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי להגביר את תהליך הפעלת הרחם ('סערת ציטוקינים').

בשל תפקידים חשובים רבים של תאים decidual, כמו משחק תפקיד קריטי בתהליך ההשתלה, שמירה על רגישות אימהית-עוברית ההיריון המוקדמים, השתתפות ההפעלה של העבודה-מונח הלקויות השונות יכול להיווצר במהלך הריון. למשל, בעיות פוריות (1) בשל השרשה חוזרים ונשנים כישלון ואובדן הריון חוזרים ונשנים יכול לנבוע כשל של התבגרות decidual; (2) הגבלת גדילה תוך רחמי (IUGR), רעלת עקב פיתוח לקוי, חוסר תפקוד של רותמי/השליה או טרנספורמציה וסקולרית פרוץ בצומת decidual-myometrial; כמו גם לידה לידה מוקדמת (3) אשר יכול לנבוע הפעלה decidual מוקדמת.

לנוכח הפרעות עיקריים אלה, יחד עם המגבלות מוסרי ומעשי של האדם ויוו מחקרים, הקמת שורות תאים decidual אנושיים העיקרי הוא חיוני עבור ניתוח במבחנה במטרה הבנה טובה יותר, שיפור ניהול קליני של סיבוכים בהריון. לפיכך, מטרת המחקר שלנו היה לפתח פרוטוקול המאפשר ניתוקה של תאים אנושיים decidual ראשי עם תשואה גבוהה התא ואת הכדאיות שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. בפרוטוקול הנוכחי זה מתאר בבירור זמן cost effective שיטה עבור בידוד של תתי סוגים ספציפיים של decidual תאים אשר לשמש למגוון רחב של ניתוחים במבחנה . אפיון של שפע של פנוטיפ של decidual תת אוכלוסיות המונח, בהשוואה בשליש הראשון או השני הוא חיוני כדי הגדרת התפקידים שלהם לאורך כל ההיריון האנושי.

Protocol

Placentae נאספים מהסמסטר בריא, לא בנשים העבודה שעברו קיסרי אלקטיבי. איסוף, עיבוד, חד פעמית של דגימות האדם לדבוק הקווים המנחים של הלוח הר סיני החולים אתיקה. בכתב מתקבל של כל מטופל. מחקר זה אושרה על ידי מועצת המנהלים של אתיקה מחקר בבית החולים הר סיני.

1. תכשירים

הערה: כל השלבים להתבצע תחת ברדס fume, כל ציוד כירורגי חייב להיות מעוקר דרך החיטוי לפני השמה בשכונה fume. כל חומר אחר (בקבוקים, צינורות 50 מ ל, וכו ') חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול פתרון. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת בעת עבודה עם פסולת ותברואה (חלוק, כפפות, שיער ארוך אסוף, וכו ').

1. פתרון עיכול אנזימטי (הפתרון הסופי: 200 מ ל)
   1. פיפטה 180 מ של HBSS-/ - לתוך גביע 500 מ"ל, להוסיף מגנט מלהיב סטרילי ומניחים על ערבוב צלחת בטמפרטורת החדר.
   2. שוקל ולהוסיף את הפעולות הבאות לפתרון של HBSS-/-לאט ברצף: 20 מ ל FBS, 400 מ"ג Collagenase 2 ([הסופי] = 2 מ"ג/מ"ל), 20 מ ג מעכבי טריפסין שעועית סויה ([סופי] = 0.1 מ"ג/מ"ל), 30 מ"ג DNase 1 ([הסופי] = 0.15 מ"ג/מ"ל), ו- 200 מ"ג BSA ([סופי] = 1 מ"ג/מ"ל)
   3. הגדר את ערבוב במהירות בינונית, ולאפשר את התערובת ומערבבים למשך 10-20 דקות (כיסוי עם סרט נייר כסף או פרפין פח תוך כדי ערבוב).
   4. שופכים את הפתרון מעורב לתוך בקבוק זכוכית 250 מ ל באמצעות משפך פלסטיק ולמקם בשכונה fume.
   5. עוברים את הפתרון באמצעות יחידת סינון העליון פלסטיק (0.22 μm ממברנה מסנן, 500 מ"ל), aliquot 20 מ"ל לתוך צינורות 50 מ ל (סה כ 10 צינורות), חנות ב-20 ° C עד השימוש.
2. RPMI 1640 מדיה (2% שטיפה פתרון ו- 10% צמיחה מלאה בינוני)
   1. לשלב RPMI 1640 FBS בבקבוק זכוכית בשכונה fume.
   2. 2% FBS פתרון, לשלב 490 מ של RPMI 1640, 10 מ ל FBS.
   3. 10% FBS הפתרון, לשלב 450 mL RPMI 1640 ו- 50 מ ל FBS.
   4. פיפטה 500 μL של normocin לתוך בקבוק הזכוכית 500 מ"ל מהשלב הקודם המכיל RPMI ומדיה FBS (50 מ"ג/מ"ל מניות, 0.05 מ"ג/מ"ל ריכוז בעבודה).
   5. להעביר מדיה דרך μm ממברנה מסנן 0.22 בחנות בבקבוק זכוכית 500 מ"ל ב 4 ° C עד השימוש.
3. 30 דקות לפני הפעלת הניסוי, מקום aliquot של 20 מ"ל של קפוא עיכול אנזימטי פתרון באמבט חרוז 37 ° C, למקם את 2% FBS ואמצעי התקשורת FBS RPMI 1640 10% באמבט חרוז 37 ° C, להפעיל את האמבט במים נדנדה והגדר 37 ° C , דור 2, והינו ממוקם צנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה עד 4 ° C.

2. אוסף של רקמת Decidual מן המונח היפרדות הקרומים

1. למקם בקבוקים עם HBSS + +, HBSS-/-חמישה צינורות 50 מ ל במעמד מתחת למכסה המנוע fume. פיפטה 25 מ של HBSS + / + צינור אחד.
2. באמצעות הידיים בכפפה, להוציא את השליה המונח מהגורם המכיל המשמש להובלת זה מן התיאטרון חדר הניתוח. מקם את השליה על משטח החתלה (אימהית בצד למעלה) ולהפיץ את הקרומים העובריים בעזרת מלקחיים ומספריים.
   1. שכב רפידות חיתול חופפים על מכסה המנוע fume.
   2. השתמש חיתול נפרד כדי להעיף את השליה אז הצד האימהי הוא הפנים למעלה.
   3. למצוא נקודת של קרום קרע ולבצע חתכים כדי לאפשר את הממברנה כדי לגולל ושכבה פרקדן על פני השטח fumehood.
      הערה: לאחר הקרום שהוחזר מן השליה, רותמי יהיה עם הפנים למעלה נח על השכבה chorion, עם השכבה השפיר מאחור.
3. בזהירות באמצעות המגרד של תא פלסטיק, לגרד את הרקמה decidual chorion ואת המקום לשפופרת 50 מ ל המכיל 25 מ ל HBSS + / +.
4. לגרד את הקרום עם לחץ מתון. אל תחיל מדי לחץ כמו זה עלול לגרום זיהום chorion. לאסוף קרישי דם קטנים כמו גם, אלה מכילים מספר תאים decidual.
   התראה: לאחר אוסף decidual, השליה חייב להיות ארוז בתוך סל פלסטיק חומרים מסוכנים, קפוא במקפיא-20 ° C לפני סילוק מתאים (לפי הכללים מוסדית). רפידות חיתול מדם חייב להיות עטוף בשקית ניילון חותם חזק והשמדתי בתוך קופסת הבטיחות הביולוגי.

3. שטיפת, אנזימטי עיכול של הרקמה Decidual

1. לשטוף את רקמות שנאספו על ידי בעדינות רועד הצינור 50 מ ל בעבודת יד ולהעביר אותו דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) 250 μm מנוחה מעל מיכל הדגימה סטרילי (שתן).
2. חזור על לשטוף את פעמיים עם HBSS + / + פעמיים עם HBSS-/ - צינורות טריים עבור כל כביסה. (סופי שוטף עם HBSS-/-מאפשר הסרת סידן ומגנזיום נוכח HBSS + +, אשר יפריע אחרת תהליך עיכול אנזימטי הבא).
   שימו לב. במהלך השלבים כביסה, זיהום רקמות chorion יהיה כפי הרקמה decidual הוא אור ורוד בצבע הוא אמורפי, בזמן chorion הלבן, דחוס וצמיגי. לכן, זיהום chorion ניתן להסירו בקלות עם מלקחיים.
3. לחלופין, אם הרקמה decidual עבה, להעביר אותו צלחת פטרי בקוטר 10 ס מ סטרילי והמשך מינצ של הרקמה עם שני אזמלים מנוגדות בצלחת.
4. למקם את הרקמה שטף סטרילי 50 מ ל שפופרת המכילה 100 מ ג של רקמות/mL של פתרון עיכול אנזימטי (ראו הכנות).
   1. כנקודת התייחסות, לוודא הרמה של רקמת decidual יגיע הסימן 5-10 מ"ל ברכבת התחתית 50 מ.
   2. השתמש בערך 20 מ"ל של פתרון עיכול אנזימטי (הוכן בשלב 1.1) לעכל את רותמי הכולל שנאסף קרום עוברי כל. המונח.
5. לסגור את הפקק של הצינור עם הסרט פרפין (לאטום את הצינור בחוזקה, לעטוף פרפין הסרט סביב פקקי העליון של הצינור) תחת התרבות הוד, דגירה רקמת decidual ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמבט מים חזק (145 סל ד דור 2).
6. לאחר דגירה, להסיר את הסרט פרפין לעקר את פני השטח של הצינור המכיל רקמות מתעכל עם 70% אתנול, מתחת למכסה המנוע fume. לנער את הצינור בקצרה בעבודת יד.
7. לאסוף תא ההשעיה דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) לתוך מיכל הדגימה סטרילי חדש. לדלל עם אמצעי אחסון שווה (20 מ ל) של RPMI + 10% FBS המכיל 0.1% normocin כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. המשך ישירות לשלב צנטריפוגה 4.1.
8. במידת הצורך, למקם את הרקמה מעוכל הנותרים בחזרה לתוך צינור 50 מ עם 20 מ של עיכול אנזימטי טריים פתרון וחזור על מערכת העיכול (20 דקות, 37 ° C, רועד אמבט מים).
9. אם עיכול השני הוא הכרחי, במקום ברכבת התחתית הראשונה עם תא השעיה על קרח (כיסוי עם סרט פרפין לשמור סטרילי). חזור על שלבים 3.5-3.6 ולשלב את המתלים שני תאים.

4. יצירת השעיה תא בודד

1. Centrifuge התליה תא (420 גרם, 4 ° C, 11 דקות).
2. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 40 מ"ל של RPMI + 2% FBS המכיל 0.1% normocin ("מאגר שטיפת").
   הערה: תא גלולה להיות רפוי, כמו ג'לי עקב זיהום תאי הדם האדומים, תשאף תגובת שיקוע בזהירות. הסרה של השלב העליון עם פיפטה ידני ייתכן שתידרש.
3. חזור על צנטריפוגה-420 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 11 דקות.
4. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע (כאמור הערה שלב 4.2) ו resuspend בגדר תא ב 5 מ של שטיפת מאגר ולהוסיף 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות בצינור אותו.
   הערה: אם בגדר גדולים או מדמם מאוד, זה ניתן לחלק את שני צינורות עבור השלב פירוק כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר לשטוף ואת חלוקת באותה מידה שני צינורות ואז הוספת 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות כל שפופרת.
5. דגירה על קרח במשך 20 דקות בקצרה מערבולת צינור בתחילתה ואת בסוף הדגירה כדי lyse כדוריות דם אדומות.
6. צנטריפוגה-420 g עבור 11 דקות ב 4 º C.
7. . בזהירות, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 40 מ של מאגר לשטוף.
8. עוברים את התאים μm 70 ניילון מסנן כדי להסיר תאים גושים.
9. צנטריפוגה-420 גרם עבור 11 דקות ב 4 º C.
10. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום מלאה (RPMI 10% + FBS המכיל 0.1% normocin).
11. לספור תאים באמצעות trypan צבען כחול-הדרה hemocytometer ההליך כמפורט להלן:
    1. מתחת למכסה המנוע תרבות בעדינות פיפטה תא ההשעיה לאורך 3 x כדי לערבב ביסודיות לפני שילוב עם trypan blue. ב- mL 1.5 שפופרת להכין תא ההשעיה, מדולל 1:2 (לשלב, 20 μL של פתרון trypan blue) וμl 20 של השעיה תא decidual. מערבבים בזהירות trypan blue-תא פתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים (פתרון זה אינו סטרילי).
    2. מניחים את hemocytometer על השלב של המיקרוסקופ עם זכוכית coverslip על העליונה.
       הערה: Hemocytometer היא מיקרוסקופ שקופית עם רשתות עליו לתת תשעה ריבועים גדולים מחולק לשלושה קווים. כל ריבוע גדול יש אזור של 1 מ מ², העומק של נוזל בבית הבליעה 0.1 מ מ. לכן, שאמצעי האחסון של נוזל יכול למלא כל ריבוע גדול 1 מ"מ * 1 מ"מ * 0.1 מ"מ = 0.1 מ"מ³= 10 מ ל^-4 .
    3. לאט לאט להוסיף 10 μL של תערובת trypan blue-תא לתוך החריץ של hemocytometer, המאפשר נימיות לפזר את תערובת תא מעל השקופית כולה (לעצור לפני תערובת ממלא טוב).
    4. הצג את התאים במיקרוסקופ (ב 10 X הגדלה), לספור את כל התאים לבן/ירוק השוללים trypan blue (אלה הם התאים קיימא) ארבע המשבצות החיצוניות גדול של hemocytometer. בעת ספירת תאים יגעו בשורה, לספור רק את אותו מגע בצד ימין ואת השורות העליונות, אך לא כאלה נוגע לימין ואת התחתון קווים. לא לספור תאים כחול כהה; צבע כחול מציין כי התא מת כפי trypan blue צבען יכול בקלות לחדור דרך קרום פלזמה לתוך הציטופלסמה.
    5. כדי לחשב את מספר התאים קיימא ב 1 מ"ל של התא השעיה (X):
       
       2 = גורם לדילול
       10,000 = פקטור המרה (1 מ"ל = 1 ס מ³ = 10, 000 * 0.1 מ מ³)
12. לדלל decidual לתאים ריכוז סופי רצוי RPMI + 10% FBS (מדיום הגידול).
    הערה: עבור ציפוי תרביות רקמה, פיפטה 2 * 10⁶ תאים/היטב לתוך צלחת פלסטיק 6-ובכן, 10 * 10⁶ תאים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס מ או 75,000 לתאים coverslip זכוכית.

תוצאות

כדי לאמת את היעילות ואת הכדאיות של תאים מבודדים, אופיינו על ידי שתי שיטות: flow cytometry, immunocytochemistry (ICC). אוכלוסיות תאים 4 ממוקדים; decidualized תאי סטרומה אותרו על ידי הנוגדן אנטי-vimentin, פן-ליקוציט סמן CD45 שימש כדי לזהות תאים חיסוניים decidual, cytokeratin שימש כדי לזהות תאים אפיתל אנדותל, בסופו ש?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידוד תאים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח האנושיות placentae כי הוא מאוד נגיש וברור. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בשני גורמים קריטיים, (1) יעילות של גירוד decidual מהשכבה chorion בקרום עוברי וטיפול (2) שבה התאים decidual מטופלות לאורך כל הפר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Diaper pads	Sigma-Aldrich	D9542
Large surgical scissors	AL Medical	2018-12-20.
Large surgical forceps	Fine Science Tools	11000-18
Plastic disposable cell scraper (25 cm)	Sarstedt	83.183
250 mm (size 60 mesh) metal sieve	Sigma-Aldrich	S1020-5EA
Disposable scalpel with plastic handle (#21)	Fisher Scientific	08-927-5D
Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)	Sarstedt	82.1473.001
Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)	VWR	25384-146
Nylon filter (70 mm)	VWR/Corning	21008-952
Erythrocyte lysis buffer	Qiagen	79217
Trypan blue, 0.4% solution	Lonza	17-942E
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Hemocytometer	Reichert	1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media	Invitrogen	11835-055
Fetal bovine serum	Wisent	080-150
Normocin (50mg/ mL)	Invivogen	ant-nr-1
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)	Millipore	SCGPT05RE
Collagenase 2, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	C6885
Soy bean trypsin inhibitor, powder	Sigma-Aldrich	T9003-250mg
DNase powder	Roche	10104159001
Bovine serum albumin (BSA powder)	Fisher Scientific	BP1600-100
Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B	Leica
Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2	Amnis
IDEA software	Millipore Sigma
APC-conjugated Vimentin antibody	R&D Systems	IC2105A
APC H7-conjugated CD45 antibody	BD	641399
FITC-conjugated Cytokeratin antibody	MACs Miltenyi Biotec	130-080-101
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody	Novus	NBP2-47941PCP
eFluor450 Fixable Viability dye	Thermo Fisher Scientific	65-0863-14
Vimentin primary antibody	Santa Cruz	sc-7558
CD45 primary antibody	Dako	M0701
Cytokeratin primary antibody	Dako	M0821
Cytokeratin 7 primary antibody	Dako	M7018
Mouse IgG	Santa Cruz	sc-2025
Goat IgG	Santa Cruz	sc-2028
Alexa Fluor 546 secondary antibody	Invitrogen	A10036
Alexa Fluor 594 secondary antibody	Fisher Scientific	A-11058
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542