기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

요약

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할 연구

초록

Decidua, 일컬어 임신 endometrium, 비판적으로 중요 한 생식 조직 이다. Decidualized stromal 세포와 면역 세포의 주로 구성 decidual 세포는 호르몬 및 염증 성 요소는 성공적인 blastocyst 주입, placental 개발에 대 한 중요 한 역할의 분 비에 대 한 책임은 용어 및 preterm 노동의 개시입니다. 많은 임신 합병증은 다른 세포 인구 decidua 구성의 정밀한 균형의 물결에서 발생할 수 있습니다. 특정 decidual 세포 유형의 비율 변경 수 있습니다 이러한 중요 한 프로세스를 방해 하 고 배아 이식 실패, 자궁내 성장 제한, 자간 전 증 임신의 심각한 합병증 개발의 위험을 증가 하 고 preterm 노동입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 비용 및 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 효과적인 방법 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 결합 하 여 효소 소화와 부드러운 기계적 장애 decidual 조직, 고수익 decidual 셀 chorion 오염 거의 없이 함께 얻은 것입니다. 중요 한 것은, 격리 decidual 셀 특징 이었다 (stromal 세포 (55-60%), 백혈구 (35%), trophoblast (0.01%) 세포 또는 상피 (1%)) 유지 높은 생존 능력 (80%)는 멀티 컬러 이미징 흐름 cytometry 분석 결과 의해 확인 되었다. 이 프로토콜에 decidua parietalis 이며 첫 번째 및 두 번째 임신 placentae을 적용할 수 있습니다. 절연, 일단 decidual 세포는 다양 한 임신 합병증에 다른 decidual 셀 부분 모집단의 역할을 이해 하는 것을 목표로 하는 실험적인 응용 프로그램에 대 한 사용할 수 있습니다.

서문

가장 적극적인 성인 여성 조직 중 하나 endometrium 난소 호르몬, 에스트로겐 (E2)과 황 체 호르몬 (P4)에 의해 자극에 대 한 응답에서 각 생리 주기를 개장 하는 극적인 겪 습. 일컬어 임신 endometrium decidua P4 기반 차별화 E2 지배 증식 단계 결과로 postovulatory 단계의 끝에 의해 형성 되는 매우 중요 한 생식 조직 이다. Decidual 셀 성공적인 blastocyst 이식 한 태아 이식 모성 관용을 유지 하기 위한 utero placental 인터페이스의 개발을 위한 호르몬 요인의 분 비에 대 한 책임이 있습니다.

Decidualization는 주입 및 후속 decidual 나선형 동맥의 리 모델링 필요 합니다. 자궁내 막 기질 세포 decidualization을, P4 및 캠프, 통제 생리 주기¹의 후반 luteal 단계를 겪는 다. 이 프로세스는 주위 혈관 및 개장 하는 맥 관 구조에 규제를 밀매 하는 백혈구의 역할을 제안 하는 기질에 걸쳐 확산 시작 됩니다. 이 세포 변환 원형 형태, 증가 핵 크기 및 거친 바인딩과 그물 및 Golgi 기구²의 확장 특징 이다. Decidualized stromal 세포 paracrine 요인 blastocyst 이식 지원 수 있으며 수많은 호르몬 (즉, prolactin), 신생 성장 인자, 인슐린 성장 인자 의무적인 단백질-1의 분 비에 의해 특징 (IGFBP-1), 스타 글란 딘 (PG) E (세포내 캠프의 자극), cytokines, 세포 외 기질 구성 요소 및 태 반 착상 및 개발^{3,,45,6에 대 한 필수적인 영양소} .

Decidual 셀 인구 decidualized stromal 세포와 전적으로 이루어진 하지 하지만 또한 큰, 임신 특정 decidual 백혈구 인구를 포함 되어 있습니다. Decidualization 과도 지역화 된 부 종 및 자연적인 살인자 (NK) 세포, T 세포, 수지상 세포, 대 식 세포의 유입을 포함 됩니다. 가장 큰 백혈구 부분 모집단은 자 궁 NK 세포, cytokines의 소스는 decidua 및 신생 요인 decidualization 과정에서 원조 하 고 증가 수 있습니다 침투 모든 모성 백혈구의 약 50-70%를 구성 임신⁷전체 수입니다. 대 식 세포, 면역 세포의 두 번째로 큰 부분 모집단을 되 고 이식 사이트 발견 하 고 임신⁸증가. Cytokines의 근원 그리고 성장 요소 (CSF-1)⁹, 종양 괴 사 인자 α (TNFα)¹⁰ 및 스타 글란 딘을 자극 하는 식민지 같은 요인 (PG) E¹¹.

임신, 내내 그리고 기간 노동 전에 decidua cytokines 및 발산 모성 주변 백혈구 활성화 및 노동 시작 자 궁 조직으로 마이그레이션하기에 대 한 책임의 주요 원천이 다. 동물 연구를 보여주는 수많은 프로 염증 성 cytokines 있습니다 마우스 decidua에 최대 통제 노동, 동안와 같은 TNF-, 일리노이-6, 일리노이-12, IL-1b¹². 인간의 decidua에서 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1b, 일리노이-6와 IL-8 (주요 호 중구 chemoattractant) 노동¹³에 비해 노동 하는 동안 더 높은 식 전시. 이러한 decidual 조직¹⁴;으로 활성화 및 백혈구의 유입에서 cytokines 결과 분 비 myometrial 4-fold, ^{가 두 인접 한 자 궁 조직 사이 활성화의 나타내는 더 큰 앞 decidual 침투 기간 노동, 동안 decidual 대 식 세포와 두 인간 호 중구 침투와 쥐에서 증가 볼 15}. 백혈구 침투 이러한 PGs myometrium¹⁶의 동기 수축 활성화의 생산, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 막 시작^17,18, 파열 뿐만 아니라 증폭 자 궁 활성화 과정 ('cytokine 폭풍우') 프로 염증 성 cytokines.

Decidual 세포 이식 과정, 초기 임신 기간에 노동의 활성화에 참여 하는 고에 산 모-신생아 공차를 유지에 중요 한 역할을 하는 등의 많은 중요 한 기능으로 인해 다른 병 리 중 발생할 수 있는 임신입니다. 예를 들어, 회귀 이식 실패와 반복 임신 손실 (1) 불 임; decidual 성숙의 오류 로부터 발생할 수 있습니다. (2) 자궁내 성장 금지 (IUGR)과 부적 절 한 개발 및 부전 decidua/태 반 또는; decidual myometrial에 손상 된 혈관 변환의 자간 전 증 (3) 조산 뿐만 아니라 있는 조기 decidual 활성화에서 발생할 수 있습니다.

이러한 주요 질환, 인간 생체 내에 연구의 윤리적이 고 실질적인 제한 함께 비추어 이해의 목적으로 생체 외에서 분석을 위해 필수적 이다 기본 인간 decidual 세포 라인을 설립 하 고 임신 합병증의 임상 관리를 개선. 따라서, 우리의 연구의 목적은 높은 셀 생산량 및 생존 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집 된 인간의 기본 decidual 셀의 격리에 대 한 허용 하는 프로토콜을 개발 했다. 이 현재 프로토콜 명확 하 게 설명 합니다 시간 및 비용 effective 메서드는 세포 decidual의 특정 하위의 분리에 대 한 생체 외에서 분석의 다양 한 사용 될. 풍부의 특성화 및 기간과 비교를 첫 번째 또는 두 번째 임신에서 decidual 부분 모집단의 표현 형 인간의 임신 기간 내내 그들의 역할을 정의 하는 데 중요 하다.

프로토콜

Placentae 선택 제왕 섹션을 겪고 노동 여성에 건강 한 용어에서 수집 됩니다. 수집, 처리, 그리고 인간의 샘플의 일회용 마운트 시 나이 병원 윤리 위원회의 지침을 준수 합니다. 서 면된 동의 각 환자에 게 서 얻어진 다. 이 연구는 마운트 시 나이 병원에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다.

1입니다. 준비

참고: 모든 단계 증기 두건에서 실시 되어야 하 고 모든 수술 장비 통해 압력솥 증기 두건에 배치 하기 전에 소독 해야 합니다. (병, 50 mL 튜브, 등) 다른 모든 자료는 70% 에탄올 용액으로 살 균 해야 합니다. 항상 착용 개인 보호 장비에 항상 유해 쓰레기 (연구실 코트, 장갑, 긴 머리를 다시 묶어, 등)와 함께 작업 하는 경우.

1. 효소 소화 솔루션 (최종 솔루션: 200 mL)
   1. 플라스틱의 HBSS-180 mL / 500 mL 비 커에 살 균 감동적인 자석을 추가 하 고 플레이트 실 온에서 교 반에-.
   2. 밖으로 무게 추가 하 고 다음 HBSS/솔루션에 천천히 순차적으로: 20 mL FBS, 400 mg 콜라 2 ([최종] = 2 mg/mL), 20 mg 간장 콩 트립 신 억제제 ([최종] = 0.1 mg/mL), 30 mg DNase 1 ([최종] = 0.15 mg/mL), 및 200mg BSA ([최종] = 1 mg/mL)
   3. 감동 중간 속도를 설정 하 고 10-20 분 (교 반 하면서 주석 포 일 또는 파라핀 필름 커버) 파문 혼합물 허용.
   4. 플라스틱 퍼 널을 사용 하 여 250 mL 유리 병에 혼합된 솔루션을 부 어 하 고 증기 두건에.
   5. 플라스틱 가기 여과 장치 (0.22 μ m 멤브레인 필터, 500 mL), aliquot 20 mL 50 mL 튜브 (총 10 관) 및 사용까지-20 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.
2. RPMI 1640 미디어 (세척 솔루션 및 10% 완전 한 성장 매체는 2%)
   1. RPMI 1640와 FBS 증기 두건에서 유리 병에 결합 합니다.
   2. 2 %FBS 솔루션, 490 mL와 10 mL FBS RPMI 1640의 결합.
   3. 10 %FBS 솔루션 RPMI 1640 450 mL 및 50 mL FBS 결합 하 여.
   4. Normocin의 500 μ RPMI 미디어와 FBS (50 mg/mL 재고, 0.05 mg/mL 작업 농도)를 포함 하는 이전 단계에서 500 mL 유리병에 플라스틱.
   5. 사용까지 4 ° C에서 500 mL 유리병에는 0.22 μ m 멤브레인 필터 및 저장소를 통해 미디어를 전달 합니다.
3. 실험을 시작 하기 전에 30 분 배치의 약 20 mL 수 37 ° C 비드 욕조에 효소 소화 솔루션 냉동, 2 %FBS 37 ° C 비드 욕조에 10% FBS RPMI 1640 미디어 락 물 목욕 설정 하 고 37 ° C로 설정 2 세대, 그리고 설정 4 ° c 온도 제어 원심 분리기

2. Decidual 조직 용어 Placental 세포 막에서의 수집

1. HBSS 병 장소 + +, HBSS-/-5 50 mL 튜브 랙 연기 후드 아래에. HBSS 25 mL를 플라스틱 + + 1 개의 관에.
2. Gloved 손을 사용 하 여, 꺼내 용어 태 반 수술 실 극장에서 수송을 위해 사용 하는 컨테이너에서. 기저귀 패드 (어머니 쪽)에 태를 놓고 태아 막이 위와 집게를 사용 하 여 밖으로 확산.
   1. 증기 두건에 겹치는 기저귀 패드를 하다.
   2. 별도 기저귀를 사용 하 여 그래서 어머니 쪽 얼굴 태를 플립.
   3. 고 막 파열의 지점을 찾아 전개 하 여 fumehood 표면에 평평 하다 막 수 있도록 절 개.
      참고: 막 태에서 철수는, 일단은 decidua 얼굴 뒤에 amnion 레이어와 chorion 레이어에 휴식 될 것입니다.
3. Chorion 25 mL HBSS 포함 50 mL 튜브에 장소에서 decidual 조직을 긁어 신중 하 게 플라스틱 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 + +.
4. 적당 한 압력으로 멤브레인을 다쳤어요. 그것은 chorion 오염 발생할 수 있습니다 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다. 뿐만 아니라, 일부 decidual 셀을 포함 하는 이러한 작은 혈전을 수집 합니다.
   주의: decidual 컬렉션 후 태 고 해야 합니다 생물 플라스틱 상자에 포장 (제도적 규칙)에 따라 적절 한 처리 하기 전에-20 ° C 냉동 고에 얼. 피 묻은 기저귀 패드 인감 꽉 비닐 봉투에 포장 하 고 생물 안전 상자에서 삭제 해야 합니다.

3. 세탁기 및 효소 소화 Decidual 조직의

1. 부드럽게 손으로 50 mL 튜브를 흔들어 하 메 마른 견본 (소변) 컨테이너에 휴식 250 μ m 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)를 통해 전달 하 여 수집 된 조직 세척.
2. HBSS로 두 번 세척을 반복 + +와 두 번 HBSS-/-각 세척에 대 한 신선한 튜브에. (최종 HBSS-세척 /-칼슘과 마그네슘 HBSS에 존재의 제거에 대 한 수 있습니다 + +는 그렇지 않으면 다음 효소 소화 과정을 방해).
   참고입니다. 세척 단계 동안 chorion 조직 오염 decidual 조직 색상에 핑크 빛과 chorion 동안 비정 질 이며 백색, 밀도, 힘 줄은 명백한 될 것입니다. 따라서, chorion 오염 집게와 함께 쉽게 제거할 수 있습니다.
3. 필요에 따라 decidual 조직이 두꺼운 경우 무 균 10 cm 직경 페 트리 접시에 그것을 전송 하 고 접시에 두 개의 반대 scalpels와 조직의 말하다 계속 합니다.
4. 효소 소화 솔루션의 조직/mL의 100 mg을 포함 하는 살 균 50 mL 튜브에 씻어 조직 배치 (준비 참조).
   1. 참조 점으로 decidual 조직의 수준 50 mL 튜브에 5-10 mL 마크에 도달 하면 확인 합니다.
   2. 효소 소화 솔루션 (단계 1.1에서에서 Prepared)의 약 20 mL를 사용 하 여 전체 기간 태아 막에서 수집한 총 decidua 소화.
5. 파라핀 영화와 튜브의 뚜껑을 봉인 (튜브를 단단히 밀봉 하 고 포장 모자와 튜브의 상단 주위 파라핀 필름) 문화에서 후드를 떨고 물 목욕 (145 rpm에서에서 20 분 동안 37 ° C에서 decidual 조직을 품 어 2 세대).
6. 부 화, 후 파라핀 필름을 제거 하 고 소화 조직 70% 에탄올을 포함 하는 튜브의 표면 소독 연기 후드 아래. 짧게 손으로 튜브 흔들.
7. 새로운 살 균 견본 콘테이너로 금속 체 (250 μ m, 크기 60 메쉬)을 통해 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 효소 반응을 중지 RPMI + 10 %FBS 포함 0.1 %normocin 동등한 볼륨 (20 mL)와 희석. 원심 분리 단계 4.1 직접 진행 합니다.
8. 필요한 경우, 나머지 소화 되지 않은 조직 20 mL 신선한 효소 소화 솔루션의 새로운 50 mL 튜브에 다시 놓고 소화 (20 분, 물 목욕을 떨고 37 ° C)를 반복 합니다.
9. 두 번째 소화 필요한 경우 얼음 (무 균 유지 파라핀 필름 커버)에 셀 서 스 펜 션 첫 번째 튜브를 놓습니다. 3.5-3.6 단계를 반복 하 고 두 셀 정지를 결합.

4. 단일 셀 서 스 펜 션 생성

1. 세포 현 탁 액 (420 g, 4 ° C, 11 분) 원심
2. 상쾌한을 제거 하 고 resuspend RPMI + 2 %FBS 포함 0.1 %normocin ("워시 버퍼") 40 mL에 셀.
   참고: 셀 펠 릿 느슨한 하 고 붉은 혈액 세포 오염 때문 젤라틴, 발음 주의 상쾌한 것입니다. 수동 피 펫을 상위 단계의 제거 필요할 수 있습니다.
3. 11 분 4 ° C에서 420 g에서 원심 분리를 반복 합니다.
4. 조심 스럽게 (참고 단계 4.2 했 듯이)는 상쾌한을 제거 하 고 워시 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend 같은 튜브에 35 mL의 적혈구 세포의 용 해 버퍼를 추가.
   참고: 펠 릿이 크거나 매우 살 벌 한, 그것은 수 분할 적혈구 세포 단계에 대 한 두 개의 튜브로 추가 하 여 워시 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 두 개의 튜브를 똑같이 나누어 적혈구 세포의 용 해 버퍼의 35 mL 각 튜브를.
5. 20 분 시작 하 고 붉은 혈액 세포를 lyse에 외피의 끝에 짧게 소용돌이 tube(s)에 대 한 얼음에 품 어.
6. 4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심
7. 신중 하 게, 제거는 상쾌한 고 워시 버퍼의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.
8. 세포 세포 덩어리를 제거 하는 70 μ m 나일론 필터를 통해 전달 합니다.
9. 4 ° c.에 11 분 420 g에서 원심 분리기
10. 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend (RPMI 10% + 0.1 %normocin 포함 하는 FBS).
11. Trypan 파랑 염료-제외 hemocytometer 절차 아래에 설명된대로 사용 하 여 셀의 개수:
    1. 문화 후드 부드럽게 trypan 블루와 결합 하기 전에 철저 하 게 혼합 하기 위하여 세포 현 탁 액 3 배 아래로 플라스틱. 1.5 ml에서 튜브 준비 세포 현 탁 액, 1:2 (trypan 블루 솔루션의 결합 20 μ)과 20 μ decidual 세포 현 탁 액의 희석. 조심 스럽게 몇 번 (이 솔루션은 불 임) 위아래로 pipetting으로 trypan 블루 셀 솔루션을 혼합.
    2. 위에 유리 coverslip와 현미경의 스테이지는 hemocytometer를 놓습니다.
       참고: Hemocytometer 트리플 라인에 의해 분할의 큰 사각형 9 개에 게 그것에 격자와 현미경 슬라이드입니다. 각 큰 광장 1 m m²의 면적을가지고 그리고 챔버에 액체의 깊이 0.1 m m. 따라서, 각 큰 사각형을 채울 수 있는 액체의 볼륨은 1mm * 1mm * 0.1 m m = 0.1 m m³= 10^-4 mL.
    3. 천천히 전체 슬라이드 (정지 전에 혼합 잘 채우고) 동안 셀 혼합 분산을 모 세관 행동을 수 있도록 hemocytometer의 홈으로 trypan 블루 셀 혼합물의 10 μ를 추가 합니다.
    4. (10 배 확대)에서 현미경으로 세포를 확인 하 고 trypan 블루 (이들은 실행 가능한 세포)는 hemocytometer의 4 개의 큰 외부 사각형에 제외 된 모든 화이트/그린 셀. 라인을 터치 하는 셀을 계산 하는 경우 그 터치 오른쪽 및 위쪽 라인 하지만 왼쪽 및 아래쪽 라인을 만지고 그 들만 계산 합니다. 어두운 파란색 셀;를 계산 하지 않음 파란색 셀이 죽은 trypan blue 염료 관통할 수 있다 쉽게 플라즈마 세포 막을 통해 세포질으로 나타냅니다.
    5. 세포 현 탁 액 (X)의 1 mL에 가능한 셀의 수 계산:
       
       2 = 희석 비율
       10000 변환 계수 = (1 mL = 1 c m³ = 10, 000 * 0.1 m m³)
12. Decidual 셀 RPMI + 10%에서 바람직한 최종 농도를 희석 FBS (성장 매체).
    참고: 조직 문화 도금, 플라스틱 2 * 10⁶ 셀/잘 플라스틱 6 잘 플레이트, 10 cm 플라스틱 격판덮개로 10 * 10⁶ 세포 또는 유리 coverslip 75000 셀.

결과

효율성과 격리 된 셀의 유효성을 검사, 그들은 두 가지 방법으로 특징 했다: cytometry와 immunocytochemistry (ICC). 4 세포 인구를 표적으로 했다; 팬 백혈구 마커 CD45 decidual 면역 세포를 식별 하는 데 사용 되었다, cytokeratin 상피/내 피 세포를 감지 하는 데 사용 했다 및 cytokeratin 7 어떤 감지 하는 데 사용 되었다 마지막으로, decidualized stromal 세포 안티 vimentin 항 체에 의해 발견 된 잠?...

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 비용은 매우 간단 하 기본 decidual 세포를 고립 시키기를 위한 효과적인 방법 전체 인간의 용어 placentae의 태아 세포 막에서 수집 하는 시간을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 두 가지 중요 한 요소, (1) 태아 막 및 (2) 치료는 decidual 세포 프로토콜 통해 처리의 chorion 계층에서 근 근이 살아가고 decidual의 효율에 따라 달라 집니다. 그것은 중요 한 chorion 조직 오염 보장 하 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Diaper pads	Sigma-Aldrich	D9542
Large surgical scissors	AL Medical	2018-12-20.
Large surgical forceps	Fine Science Tools	11000-18
Plastic disposable cell scraper (25 cm)	Sarstedt	83.183
250 mm (size 60 mesh) metal sieve	Sigma-Aldrich	S1020-5EA
Disposable scalpel with plastic handle (#21)	Fisher Scientific	08-927-5D
Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)	Sarstedt	82.1473.001
Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)	VWR	25384-146
Nylon filter (70 mm)	VWR/Corning	21008-952
Erythrocyte lysis buffer	Qiagen	79217
Trypan blue, 0.4% solution	Lonza	17-942E
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Hemocytometer	Reichert	1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media	Invitrogen	11835-055
Fetal bovine serum	Wisent	080-150
Normocin (50mg/ mL)	Invivogen	ant-nr-1
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)	Millipore	SCGPT05RE
Collagenase 2, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	C6885
Soy bean trypsin inhibitor, powder	Sigma-Aldrich	T9003-250mg
DNase powder	Roche	10104159001
Bovine serum albumin (BSA powder)	Fisher Scientific	BP1600-100
Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B	Leica
Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2	Amnis
IDEA software	Millipore Sigma
APC-conjugated Vimentin antibody	R&D Systems	IC2105A
APC H7-conjugated CD45 antibody	BD	641399
FITC-conjugated Cytokeratin antibody	MACs Miltenyi Biotec	130-080-101
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody	Novus	NBP2-47941PCP
eFluor450 Fixable Viability dye	Thermo Fisher Scientific	65-0863-14
Vimentin primary antibody	Santa Cruz	sc-7558
CD45 primary antibody	Dako	M0701
Cytokeratin primary antibody	Dako	M0821
Cytokeratin 7 primary antibody	Dako	M7018
Mouse IgG	Santa Cruz	sc-2025
Goat IgG	Santa Cruz	sc-2028
Alexa Fluor 546 secondary antibody	Invitrogen	A10036
Alexa Fluor 594 secondary antibody	Fisher Scientific	A-11058
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542