Изоляции первичных клеток человека децидуальной от плода мембраны термин Роль162

Резюме

Этот протокол демонстрирует метод для изоляции первичных клеток человека децидуальной, собранных от плода мембраны термин роль162, которые могут быть использованы для различных приложений (т.е. immunocytochemistry, проточной цитометрии и т.д.) направленных изучить роль различных клеточных популяций в осложнений беременности.

Аннотация

Европейская, также известный как беременные эндометрия, является критически важной репродуктивных тканей. Децидуальной клеток, в основном состоит из decidualized стромальных клеток и иммунных клеток, ответственных за секрецию гормональные и воспалительных факторов, которые имеют решающее значение для успешного бластоциста имплантации, плацентарной развития и сыграть роль в Начало труда на срок и недоношенных новорожденных. Многие осложнения беременности могут возникнуть от возмущения прекрасный баланс различных клеточных популяций, включающий decidua. Изменения доли типов конкретных децидуальной клеток может нарушить этих важнейших процессов и увеличить риск развития серьезных осложнений беременности, например отказ имплантации эмбриона, Внутриутробное ограничение роста, преэклампсией и преждевременные роды. Протокол, изложенные здесь показывает стоимость и время эффективный метод для изоляции первичных клеток человека децидуальной собранные от плода мембраны термин роль162. Объединив ферментативного пищеварения и нежный механическое нарушение децидуальной ткани, высокая доходность децидуальной клеток был получен с практически без загрязнения хориона. Главное, характеризовались изолированных децидуальной клеток (стромальные клетки (55-60%), лейкоциты (35%), эпителиальных (1%) или клеток трофобласта (0,01%)) и поддерживается высокой жизнеспособности (80%), который был подтвержден многоцветной визуализации потока цитометрии пробирного. Этот протокол для decidua parietalis и может быть адаптирована к роль162 первого и второго триместра. После того, как изолированные, децидуальной клетки могут использоваться для множества экспериментальных приложений, стремясь понять роль различных децидуальной клеток субпопуляциях в осложнений беременности.

Введение

Эндометрия, один из самых активных взрослых женщин тканей, претерпевает драматические ремоделирования каждого менструального цикла в ответ на стимуляцию яичников гормоны, эстрогены (E2) и прогестерона (P4). Европейская, также известный как беременные эндометрия, является критически важной репродуктивных ткани, которая сформирована к концу этапа postovulatory результате P4-driven дифференциация после E2-доминантный Пролиферативная фаза. Децидуальной клетки отвечают за секрецию гормональных факторов для успешного бластоциста имплантации и развития маточно плацентарный интерфейса для поддержания материнской толерантности к плода аллотрансплантатом.

Decidualization является обязательным для имплантации и последующей реконструкции децидуальной спиральных артерий. Эндометрия стромальные клетки проходят decidualization, под контролем P4 и лагерь, в конце лютеиновой фазы менструального цикла¹. Этот процесс инициируется вокруг кровеносных сосудов и распространяется по всему стромы, предлагая свою роль в реконструкции сосудистую и лейкоцитов, регулирование оборота. Этот сотовый трансформации характеризуется круговой морфологии, увеличение размера ядерных и расширение грубый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи². Decidualized стромальные клетки способны производить паракринными факторов поддержки имплантация бластоцисты и характеризуется секрецию многочисленных гормонов (то есть пролактина), ангиогенных факторов роста, инсулин фактор роста привязки белка-1 (IGFBP-1), простагландины (PG) E (стимулятором внутриклеточных лагеря), цитокины, компоненты внеклеточного матрикса и питательные вещества, необходимые для плацентарного имплантации и развития^3,4,5,6 .

Популяции децидуальной клеток не состоит исключительно из decidualized стромальные клетки, но также содержит большой, специфичные для беременности децидуальной лейкоцита населения. Decidualization включает в себя временные локализованные отеки и приток природного убийца (НК) клетки, Т-клеток, дендритные клетки и макрофаги. Самая большая субпопуляция лейкоцитов является матки НК-клеток, состоящий из примерно 50-70% всех матерей лейкоцитов, проникнув decidua, которые являются источником цитокинов и ангиогенных факторов, которые могут помочь в процессе decidualization и увеличение номер на протяжении беременности⁷. Макрофаги, будучи вторым по величине субпопуляция иммунных клеток, находятся вокруг места имплантации и увеличить во время беременности⁸. Они являются источником цитокинов и роста такие факторы, как колонии стимулирующий фактор (РСУ-1)⁹, фактора некроза опухоли альфа (TNFα)¹⁰ и простагландина (PG) E¹¹.

Во время беременности и до срока родов Европейская является основным источником цитокинов и chemokines ответственность за материнской лейкоцитов периферической активации и последующей миграции в маточных тканей начать труда. Исследования на животных показали, что многочисленные провоспалительных цитокинов вверх регулируются decidua мыши во время родов, такие как ФНО a, IL-6, Ил-12 и Ил 1b¹². В человеческой decidua провоспалительных цитокинов ИЛ 1b, IL-6 и IL-8 (основных нейтрофилов хемотаксического) экспонат выше выражение во время родов, по сравнению с не в труд¹³. Эти секретным cytokines результат активации и приток лейкоцитов в децидуальной ткани¹⁴; увеличение децидуальной макрофагов и нейтрофилов инфильтрации в как людские, так и крыса рассматривается во время срока родов, децидуальной инфильтрации предшествующих миометрия, 4 раза больше, указывающее каскад активации между этой двух прилегающих тканей матки ¹⁵. Эти проникновения лейкоциты производят PGs способны активации синхронных сокращения миометрия¹⁶, матрицы металлопротеиназ (равенству) инициировать мембраны разрыв^17,18, а также провоспалительных цитокинов усилить процесс активации матки («цитокинов шторм»).

Из-за многих важных функций децидуальной клеток, например, играет решающую роль в процессе имплантации, поддержание матери и плода терпимости в начале беременности и участвует в активации труда на срок различные патологии могут возникнуть во время беременности. Например (1) бесплодия из-за периодических имплантации неудачи и привычным невынашиванием может быть результатом сбоя децидуальной созревания; (2) Внутриутробное ограничение роста (IUGR) и преэклампсии из-за неправильного развития и дисфункции decidua/плаценты или скомпрометированных сосудистой преобразования на стыке децидуальной миометрия; а также (3) преждевременных родов, которая может быть результатом преждевременного децидуальной активации.

С учетом этих серьезных расстройств, в сочетании с этических и практических ограничениях человека в vivo исследований, создания линий первичной децидуальной клеток человека имеет важное значение для анализа в пробирке с целью лучшего понимания и Улучшение клинической управления осложнений беременности. Таким образом целью нашего исследования было разработать протокол, который позволяет для изоляции первичных децидуальной клеток человека с высоким клетки урожайность и жизнеспособности, собранных от плода мембраны термин роль162. Этот текущий протокол четко описывает время и экономичным метод для изоляции из конкретных подтипы децидуальной клетки которые использоваться для различных анализов в пробирке . Характеристика изобилия и фенотип децидуальной субпопуляциях в срок и сравнение на первом или втором триместре имеет решающее значение для определения их роли на протяжении беременности человека.

протокол

Роль162 собраны из здоровых термин, не в труд женщин проходит плановое кесарево сечение. Сбор, переработка и одноразовые человеческих образцов придерживаться руководящих принципов правления Маунт Синай Больница этики. Письменное согласие от каждого пациента. Это исследование утверждается Советом этики научных исследований на горе Синай.

1. Подготовка

Примечание: Все шаги должны проводиться под вытяжной шкаф и все хирургическое оборудование должны быть простерилизованы через автоклава до размещения в зонта. Все другие материалы (бутылки, 50 мл трубки и т.д.) должны быть простерилизованы с 70% этанола раствор. Всегда носить личного защитного снаряжения в любое время при работе с зараженные отходы (лаборатории пальто, перчатки, длинные волосы связаны обратно, и т.д.).

1. Раствор ферментативного пищеварения (окончательное решение: 200 мл)
   1. Пипетка 180 мл HBSS-/ - в 500 мл стакан, добавить стерильные перемешивания магнит и на перемешивание пластины при комнатной температуре.
   2. Весят и добавьте следующее решение HBSS-/-медленно и последовательно: 20 мл FBS, 400 мг коллагеназы 2 ([окончательного] = 2 мг/мл), 20 мг соевых бобов ингибитор трипсина ([окончательного] = 0,1 мг/мл), 30 мг DNase 1 ([окончательного] = 0,15 мг/мл) и 200 мг BSA ([окончательного] = 1 мг/мл)
   3. Значение средней скорости перемешивания и позволяют смесь размешать 10-20 мин (обложка с жестяной фольги или парафин фильм помешивая).
   4. Вылить смешанные решения в стеклянная бутылка 250 мл, используя пластиковые воронку и место в зонта.
   5. Передайте решение через пластиковые Топ фильтрующего блока (0.22 мкм мембранный фильтр, 500 мл), аликвота 20 мл в 50 мл трубки (всего 10 трубы) и хранить при температуре-20 ° C до использования.
2. RPMI 1640 СМИ (промывание решения и 10% полный рост среднего 2%)
   1. Объединить RPMI 1640 и FBS в стеклянной бутылке в зонта.
   2. 2% раствор FBS сочетают в себе 490 мл RPMI 1640 и 10 мл FBS.
   3. Для 10% раствор FBS объединить 450 мл RPMI 1640 и 50 мл FBS.
   4. Пипетка 500 мкл normocin в 500 мл флакон из предыдущего шага, содержащие, RPMI СМИ и FBS (50 мг/мл штока, рабочие концентрации 0,05 мг/мл).
   5. Передайте СМИ через 0,22 мкм мембранный фильтр и хранить в стеклянной бутылке 500 мл на 4 ° C до использования.
3. 30 мин до начала эксперимента, место 20 мл Алиготе из замороженных ферментативного пищеварения раствор в ванну шарик 37 ° C, место 2% FBS и 10% FBS RPMI 1640 СМИ в ванне шарик с 37 ° C, включите качания водяной бане и до 37 ° C , 2 g и набор центрифугу температуры на 4 ° C.

2. сбор децидуальной ткани от термин плацентарной мембраны

1. Место бутылки с HBSS +/ +, HBSS-/- и пять 50 мл трубки в стойку под зонт. Пипетка 25 мл HBSS +/ + в одной из труб.
2. С помощью перчатках, вывезти термин плаценты из контейнера для его перевозки от операционной комнате театра. Место плаценты на пеленку pad (материнской стороной вверх) и распространение плода мембраны с помощью ножниц и пинцет.
   1. Положите перекрывающихся пеленки колодки на зонта.
   2. Используйте отдельный пеленки для флип через плаценту, так с материнской стороны является лицом вверх.
   3. Найти точку разрыва мембраны и делать надрезы разрешить мембраны разворачиваться и заложить плашмя на fumehood поверхности.
      Примечание: После того, как мембрана вытащил обратно из плаценты, decidua будет лицом вверх отдыхает на слое Хорион, амнион слоем на спине.
3. Скребком пластиковые клетки, тщательно очистите децидуальной ткани хориона и место в Тюбик 50 мл, содержащие 25 мл HBSS +/ +.
4. Скрип мембраны с умеренным давлением. Не применять слишком много давления, как это может привести к загрязнению хориона. Соберите небольшие сгустки крови, так как они содержат некоторые децидуальной клетки.
   Предупреждение: После децидуальной коллекции, должны быть упакованы в пластиковые бен биологической и заморозить в морозильной камере-20 ° C до надлежащего удаления (согласно ваших организационных правил) плаценты. Кровавый пеленки колодки должны быть завернутый в печать плотный полиэтиленовый пакет и утилизировать в коробке биологической безопасности.

3. мытье и ферментативного пищеварения децидуальной ткани

1. Вымойте собранные тканей мягко встряхивания 50 мл трубки вручную и передавая его через 250 мкм металлическое сито (250 мкм, размер 60 сетка) наведении стерильные образца (моча) контейнер.
2. Повторите дважды промыть HBSS +/ + и дважды с HBSS-/ - в свежих трубы для каждой стирки. (финал моет с HBSS-/-позволяет для удаления кальция и магния в HBSS +/ +, которая бы в противном случае вмешиваться в следующих процесс ферментативного пищеварения).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Во время стирки шаги загрязнение ткани хориона будет очевидным, как децидуальной ткани светло-розовый цвет и аморфных, а хориона, белая, плотная и тягучий. Таким образом Хорион загрязнения могут быть легко удалены с щипцами.
3. При необходимости если децидуальной ткани толщиной, передача его в чашку Петри стерильные 10 см диаметр и приступить к фарш из ткани с двух противоположных Скальпели в блюдо.
4. Место промывают ткани в стерильных 50 мл трубки, содержащий 100 мг ткани/мл раствора ферментативного пищеварения (см. препаратов).
   1. Как точки отсчета убедитесь, что уровень децидуальной ткани достигает отметки 5-10 мл на 50 мл трубки.
   2. Используйте примерно 20 мл раствора ферментативного пищеварения (подготовлено на этапе 1.1) переваривать Общая европейская, собранные из всего срока плода мембраны.
5. Закрыть крышку трубки с парафином фильм (печать трубки плотно и обернуть парафин фильм вокруг крышки и верхней части трубки) под культуру капот и инкубировать децидуальной ткани при 37 ° C 20 мин в тряску водяной бане (145 об/мин 2 g).
6. После инкубации снимите пленку парафина и стерилизовать поверхности трубка, содержащая переваривается ткани с 70% этанола и под зонт. Встряхните трубки кратко вручную.
7. Соберите суспензию клеток через металлическое сито (250 мкм, размер 60 сетка) в новый контейнер стерильные образца. Развести с равным объемом (20 мл) RPMI + 10% FBS содержащих 0,1% normocin, чтобы остановить ферментативной реакции. Перейти непосредственно к шагу центрифугирования 4.1.
8. В случае необходимости, место оставшиеся непереваренных ткани обратно в новый Тюбик 50 мл с 20 мл раствора свежие ферментативного пищеварения и повторить пищеварения (20 мин., 37 ° C, пожимая водяная баня).
9. При необходимости второй пищеварение, место первой трубки с суспензию клеток на льду (обложка с парафином фильм держать стерильный). Повторите шаги с 3.5-3.6 и объединить две клетки суспензий.

4. Создание одной ячейки подвеска

1. Центрифуга суспензию клеток (420г, 4 ° C, 11 мин).
2. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 40 мл RPMI + 2% FBS содержащих 0,1% normocin («мыть буфера»).
   Примечание: Пелле ячейки будет свободно и желатиновых из-за загрязнения красных кровяных клеток, аспирационная супернатант с осторожностью. Может потребоваться удаление верхнего этапа с ручной дозатор.
3. Повторите центрифугирования 420г при температуре 4 ° C на 11 мин.
4. Тщательно удалить супернатант (как указано в записке шаг 4.2) и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера мытья и добавить 35 мл буфера lysis эритроцитов в том же трубе.
   Примечание: Если гранулы большие или очень кровавый, его можно разделить на две трубы для шага Лизис эритроцитов путем добавления 10 мл буфера мытья и одинаково разделить две трубы и затем добавив 35 мл буфера lysis эритроцитов к каждой трубе.
5. Инкубируйте на льду на 20 мин кратко вихревой трубки в начале и в конце инкубации лизируют красных кровяных клеток.
6. Центрифуга на 420г за 11 минут при 4 ° C.
7. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 40 мл буфера мытья.
8. Клетки проходят через 70 мкм Нейлоновый фильтр для удаления скопления клеток.
9. Центрифуга на 420 g 11 мин при 4 ° C.
10. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полного среднего (RPMI 10% + FBS, содержащие 0,1% normocin).
11. Подсчитать ячейки с помощью процедуры Горяева Трипановый синий краситель исключение как описано ниже:
    1. Под капотом культуры нежно Пипетка суспензию клеток вверх и вниз 3 x для того, чтобы тщательно перемешивают до объединения с Трипановый синий. В 1,5 мл трубки готовят суспензию клеток, разводят 1:2 (комбинат 20 мкл раствора Трипановый синий) и 20 мкл суспензии децидуальной клеток. Тщательно смешайте Трипановый синий клеточной решение закупорить вверх и вниз несколько раз (это решение не является стерильной).
    2. Место Горяева на сцене микроскоп с coverslip стекла на вершине.
       Примечание: Горяева является микроскопа с сетками на нем дать девять больших квадраты, разделенные тройной линий. Каждый большой квадрат имеет площадь 1 мм², и глубина жидкости в камере составляет 0,1 мм. Таким образом, объем жидкости, которая может заполнить каждый большой площади составляет 1 * 1 мм * 0.1 мм = 0,1 мм³= 10^-4 мл.
    3. Медленно добавьте 10 мкл Трипановый синий клеточной смеси в паз Горяева, позволяя капиллярность разойтись в ячейку смесь на весь слайд (остановка перед смесь хорошо заполняет).
    4. Просмотр клетки под микроскопом (при 10-кратном) и рассчитывать все белый/зеленый клеток, которые исключают Трипановый синий (это жизнеспособные клетки) в четырех крупных внешних квадратов Горяева. Когда подсчет клеток, которые касаются линии, граф только те, что прикосновение право и верхней линии, но не те, трогательно левой и нижней линии. Не учитываются темно синие клетки; синий цвет указывает, что ячейка мертв, как Трипановый синий краситель может легко проникнуть через плазматическую мембрану в цитоплазме.
    5. Чтобы вычислить количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии клеток (X):
       
       2 = коэффициент разрежения
       10000 = коэффициент конверсии (1 мл = 1 см³ = 10, 000 * 0.1 мм³)
12. Разбавить децидуальной клетки к желательным конечная концентрация в RPMI + 10% FBS (средний рост).
    Примечание: Для покрытия культуры ткани, Пипетка 2 * 10⁶ клеток/колодец в пластиковые пластины 6-а, 10 * 10⁶ клеток в 10 см пластиковые пластины или 75000 клеток к coverslip стекла.

Результаты

Чтобы проверить эффективность и жизнеспособность изолированных клеток, они характеризовались двумя методами: поток цитометрии и immunocytochemistry (ICC). были направлены 4 клеточных популяций; decidualized стромальные клетки были обнаружены антитела анти виментин, Пан лейкоцита мар...

Обсуждение

Протокол, описанные здесь демонстрирует стоимости и времени, эффективный метод для изоляции первичных децидуальной клетки собранные от плода мембраны всей человеческой термин роль162, который является очень доступным и простым. Успех этого протокола зависит от двух важнейших факторов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium	Prepared in facility (LTRI)
Diaper pads	Sigma-Aldrich	D9542
Large surgical scissors	AL Medical	2018-12-20.
Large surgical forceps	Fine Science Tools	11000-18
Plastic disposable cell scraper (25 cm)	Sarstedt	83.183
250 mm (size 60 mesh) metal sieve	Sigma-Aldrich	S1020-5EA
Disposable scalpel with plastic handle (#21)	Fisher Scientific	08-927-5D
Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm)	Sarstedt	82.1473.001
Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz)	VWR	25384-146
Nylon filter (70 mm)	VWR/Corning	21008-952
Erythrocyte lysis buffer	Qiagen	79217
Trypan blue, 0.4% solution	Lonza	17-942E
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Hemocytometer	Reichert	1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media	Invitrogen	11835-055
Fetal bovine serum	Wisent	080-150
Normocin (50mg/ mL)	Invivogen	ant-nr-1
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL)	Millipore	SCGPT05RE
Collagenase 2, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	C6885
Soy bean trypsin inhibitor, powder	Sigma-Aldrich	T9003-250mg
DNase powder	Roche	10104159001
Bovine serum albumin (BSA powder)	Fisher Scientific	BP1600-100
Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B	Leica
Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2	Amnis
IDEA software	Millipore Sigma
APC-conjugated Vimentin antibody	R&D Systems	IC2105A
APC H7-conjugated CD45 antibody	BD	641399
FITC-conjugated Cytokeratin antibody	MACs Miltenyi Biotec	130-080-101
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody	Novus	NBP2-47941PCP
eFluor450 Fixable Viability dye	Thermo Fisher Scientific	65-0863-14
Vimentin primary antibody	Santa Cruz	sc-7558
CD45 primary antibody	Dako	M0701
Cytokeratin primary antibody	Dako	M0821
Cytokeratin 7 primary antibody	Dako	M7018
Mouse IgG	Santa Cruz	sc-2025
Goat IgG	Santa Cruz	sc-2028
Alexa Fluor 546 secondary antibody	Invitrogen	A10036
Alexa Fluor 594 secondary antibody	Fisher Scientific	A-11058
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542