JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

Abstract

במבחנה autoradiography נועד להמחיש את התפלגות האנטומי של חלבון עניין ברקמות חיות ניסוי, כמו גם בני אדם. השיטה מבוססת על הכריכה ספציפי של radioligand למטרה הביולוגי שלו. לכן, מקטעי רקמת קפוא מודגרת עם פתרון radioligand, האיגוד אל המטרה הוא לאחר מכן מקומי על ידי הגילוי של דעיכה רדיואקטיבית, לדוגמה, באמצעות סרט פוטוסנסיטיבית או זרחן הדמיה צלחות. Autoradiograms דיגיטלי שנוצר להציג רזולוציה מרחבית יוצא דופן, אשר מאפשרת כימות ולוקליזציה של איגוד radioligand במבנים אנטומיים ברורים. יתר על כן, כימות מאפשרת אפיון ליגנד זיקה תרופתי באמצעות קבועי דיסוציאציה (דK), עיכוב קבועים (Kאני), כמו גם הצפיפות של אתרי קישור (Bmax) ברקמות שנבחרו. לכן, השיטה מספקת מידע אודות המטרה לוקליזציה והן ליגנד סלקטיביות. כאן, הטכניקה היא ביטוי עם אפיון autoradiographic של החומצה גבוה-זיקה γ-hydroxybutyric (אסיד) מחייב אתרי ברקמת המוח יונקים, תוך שימת דגש מיוחד על שיקולים מתודולוגי בנוגע וזמינותו מחייבת פרמטרים, הבחירה של radioligand ואת שיטת זיהוי.

Introduction

Autoradiography היא שיטה אשר מספק תמונות של דעיכה רדיואקטיבית. הטכניקה משמשת באופן שגרתי ללמוד התפלגות רקמת חלבון של עניין במבחנה המבוססת על אינטראקציה עם תרופתי ספציפי בין תרכובת radiolabelled המטרה שלו. זה מספק מידע ישיר על סלקטיביות ליגנד המטרה. במבחנה autoradiography עשוי לשמש גם קביעה כמותית של איגוד תרופתי הפרמטרים של radioligands, כגון קבוע דיסוציאציה (דK), צפיפות של אתרי קישור (Bmax), כמו גם לקביעת עיכוב הקבוע (Ki) של ליגנדים מתחרות1,2. בהשוואה לאיגוד radioligand homogenate מסורתיים, autoradiography יש את היתרון של מסוגל לדמיין אנטומיה המרחבי ולתת פרטים תמציתי של דפוסי ביטוי אזוריים3. השיטה של autoradiography לכן חלופה רלוונטי immunocytochemistry, במיוחד בהעדר נוגדן המאומת. Autoradiography מיושם בקלות בתוך מעבדה סטנדרטיים radioisotope קיבלו את הזמינות של radioligand מתאים עם יחודיות תרופתי הנדרש, גישה cryostat מיקרוטום עבור הכנת רקמות, ומקטעים של הדמיה מתאימים המכשיר כי הוא מסוגל לנתח את ההפצה של רדיואקטיביות בסעיפים המתאימים רקמות. ראוי לציין, קריטריון הבחירה חשובה עבור radioligand הוא כמות מוגבלת של איגוד לאתרים שאינם-יעד. זה יכול להיות חלבונים, ריריות או חומרים כגון פלסטיק או מסננים אחרים, הוא המכונות במקובץ מחייב שאינם ספציפיים. בדרך כלל, לא ספציפית מחייבת היא אי-saturable אבל יכול להיות saturable אם זה קשור חלבון חופש-יעד ספציפי. הדרך הטובה ביותר של אימות נכון מחייב ספציפית היא להשוות בין רקמות חסר המטרה, למשל, גנטית מהונדסים רקמות (הנוק-אאוט)4.

. הנה, המתודולוגיה מודגם עם אפיון האתר גבוהה-זיקה מחייב עבור חומצה γ-hydroxybutyric (אסיד) במוח של יונקים autoradiographic. הבנת האינטראקציה תרופתי בין אסיד לבין אתר איגוד שלו הוא מידת הרלוונטיות וכן אסיד שני תרופה שימושי קלינית לטיפול narcolepsy אלכוהוליזם5, אלא גם נתין הטבעי של המוח יונקים ו של פנאי סמים6. אתרי קישור אסיד גבוה-זיקה תוארו לראשונה באמצעות קשירה אסיד [3H] rat-המוח-homogenate-7. במהלך השנים, לקדם מחקרים autoradiography עם [3H] אסיד ופניות של [3H] רכיבי NC-382, הראה צפיפות גבוהה של איגוד אתרי באזורים הקדמי של עכברוש8,9,10, עכבר9 , חזיר המוח של11וקוף אדם-12. עם זאת, זהות מולקולרית והרלוונטיות המדויק פונקציונלי של אתרים אלה מחייב נשארו חמקמק.

עם כוונה לאפיין נוספת של אתרי קשירה, וכדי להקל על מחקרים על תפקיד פיזיולוגי של אסיד, פותחו מרובים radioligands שילוב איזוטופים שונים ניחן הזיקות השונות ([3H] GHB, [3 H] רכיבי NC-382 [3H] HOCPCA, [125אני] BnOPh-GHB)13,14,15,16(נבדקה17) (איור 1). השילוב של radioligands גבוהה-זיקה סלקטיבית, צפיפות רקמת גבוהה מאוד של האיגוד אתרי אפשרו לייצור של תמונות באיכות גבוהה באמצעות הזרחן הדמיה טכניקה9,11. יחד עם חלוקה לרמות של נקודות מעשיות בהגדרת ניסוי autoradiographic ואיור לצורך המחשה פרטים, המקטע לדיון ידגיש i) הבחירה של רדיונוקלידים ii) בחירה וזמינותו תנאי, iii) השימוש פוספור הדמיה צלחות לעומת לסרטי רנטגן. המטרה הכוללת של מאמר זה נועד לספק פרטים טכניים, מתודולוגי ומדעיים על טכניקת autoradiography בשביל לידע על רקמות הפצה וניתוח תרופתי של חלבון מטרות.

Protocol

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה בהתאם להנחיות של Inspectorate ניסויים בבעלי חיים דנית.

הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מכסה רקמות הכנה (קרי, רקמת מוח העכבר), במבחנה autoradiographic וזמינותו בפירוט מספיק עבור הגדרת השיטה במעבדה החדשה, את החשיפה פוספור הדמיה הצלחות כמו גם לאחר מכן ניתוח densitometric של autoradiograms (איור 2) עם המטרה של לוקליזציה וכימות radioligand מחייב במבנים אנטומיים ברורים. לשם השוואה היסטולוגית, עבור cresyl, ויולט מכתים פרוטוקול הינה כלולה. יתר על כן, הקביעה של איגוד שאינם ספציפיים עם ליגנד מתחרות נכלל בתוך הפרוטוקול. לקבלת תיאור מפורט אודות אופן קביעת Kd, Bמקס או קייאני, ראה הפרסום הקודם4.

1. רקמות הכנה על ידי Cryosectioning

  1. המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומנתחים באופן מיידי את המוח באמצעות מלקחיים ומספריים. ישירות להמשיך לשלב הבא כדי למנוע נזק לרקמות.
  2. Snap-הקפאת הרקמה על ידי צלילה אבקת קרח יבש, גז CO2 או איזופנטאן. ישירות להעביר הרקמה קפוא cryostat עם הטמפרטורה מוגדר כ-20 ° C. לחלופין, לאחסן את הרקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד.
    הערה: להימנע חוזרות מפשיר הקפאה כדי להפחית נזק לרקמות.
  3. תן את הרקמה להתאקלם-20 ° C ב- cryostat למשך 20 דקות לפני עיבוד נוסף כדי למנוע ניפוץ רקמות.
  4. לכסות את קופסת הטישיו בינונית ההטבעה בחוץ cryostat ולמקם במהירות את הדגימה רקמות קפוא הכיוון הרצוי אמנם המדיום ההטבעה עדיין נוזלי. למשל, מקום במוח העכבר אנכית אל המוח על מנת להשיג חלקים הילתית rostral. להעביר את קופסת הטישיו בחזרה cryostat ולחשוף את המדיום ההטבעה לטמפרטורות מתחת-10 ° C עבור טרשת.
    הערה: דגימות רקמה שברירית צריך להיות מצופה הטבעה בינוני בתוך התבניות רקמות לפני הרכבה.
  5. בעמדה בעל רקמת האזמל הקטן cryostat. התאם את הכיוון של הרקמה כדי להימנע מקטעים משופע.
  6. לחתוך את הרקמה בעזרת הדרכתו של אטלס stereotaxic18 בסעיפים של עובי הרצוי (12 מיקרומטר מומלצת [3H] מתויג ליגנדים). בזהירות ליישר לגולל את המקטע עם מברשת בגודל קטן במידת הצורך, הפשרה-הר המקטע לשקופית מיקרוסקופ. ברצף לאסוף את הסעיפים מאזור עניין לשכפול טכני הרצוי (למשל, 4 סעיפים לכל שקופית).
  7. לאפשר את המקטעים של השקופיות כדי מילה נהדרת עבור 1 h לפני טיפול נוסף.
    הערה: תוספת של חומר? סופג לחות לתיבות שקופית ממזער הצטברות לחות על הסעיפים רקמות. Procotol יכול להיות עצר כאן על-ידי אחסון לטווח ארוך מקטעים בתיבות שקופיות ב-80 מעלות צלזיוס.

2. במבחנה Autoradiography

זהירות: רדיואקטיביות. עובד מעבדה מוסמכת על פי תקנות מקומיות. ללבוש ביגוד מגן. . היפטר בהתאם דעיכה רדיואקטיבית או מיקור חוץ לחברה מוסמך.

  1. להפשיר את המקטעים במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תווית של השקופיות עם תנאים ניסיוני. השתמשי בעיפרון כי השקופיות שאתה רוחץ אתנול במהלך צביעת עוקבות.
  2. מקם את השקופיות אופקית מגשי פלסטיק.
    הערה: מיקום השקופיות על פלטפורמה מוגבהת בתוך מגשי פלסטיק מקלה על הטיפול שלהם.
  3. Incubate מראש הסעיפים רכוב על השקופיות במאגר assay מותאם למטרה המדובר (עבור פרוטוקול אסיד, 50 מ מ KHPO4 מאגר pH 6.0 משמש) על-ידי החלת בקפידה אמצעי אחסון המתאים על גבי השקופית (700 µL למקטעי הילתית מכרסמים 3-4).
    הערה: ודא כי כל קטע מכוסה לגמרי נוזלי.
    1. מכסים את מגשי פלסטיק עם מכסה על מנת למנוע אידוי, דגירה מראש בטמפרטורה הרלוונטיים (עבור פרוטוקול אסיד incubate מראש למשך 30 דקות ב- RT) תחת עדין קבוע (20 סל ד) לוחץ על צלחת מטרף.
    2. מצפני מחייב שאינם ספציפיים, תוספת assay מאגר עם ריכוז הרלוונטיים של המתחם unlabelled (עבור פרוטוקול אסיד, 1 מ"מ אסיד).
      הערה: ייתכן הדגירה מראש שלא יהיה צורך.
  4. יוצקים את נוזל טרום דגירה מכל שקופית ולאחר להעביר את השקופיות חזרה אל מגש פלסטיק.
  5. כדי למנוע התייבשות, מיד דגירה הסעיפים הרלוונטיים ריכוז של radioligand במאגר assay בתנאים הרצויים (עבור פרוטוקול אסיד, 1 ננומטר [3H] HOCPCA עבור 1 h RT) על ידי כיסוי הסעיפים לחלוטין עם radioligand פתרון (700 µL למקטעי הילתית מכרסמים 3-4).
    1. דגירה תחת תחת עדין קבוע (20 סל ד) רעד של מגשי פלסטיק עם מכסה סגור.
      הערה: ריכוז radioligand הניתנים לאימות על ידי ספירת של aliquot ב מונה נצנוץ נוזלי.
  6. להסיר את הפתרון דגירה על ידי לשפוך את הנוזל, להעביר את השקופיות לתוך ארון שקופיות מיקרוסקופ. מיד להמשיך לשלב הבא כדי למנוע התייבשות סעיף.
  7. לשטוף את השקופיות. עבור פרוטוקול אסיד, לשטוף עם מאגר assay כקרח פעמיים עבור 20 s ולאחר מכן לשטוף ואז פעמיים בטבילת המדף שקופית במגשים מלאים קרח מים מזוקקים להסרת מלחים. מקם את השקופיות אנכית בארונות תקשורת עבור air-drying לפחות שעה-RT או יבש השקופיות עבור 5 דקות עם מפוח להגדיר טמפרטורה קר.
    הערה: כביסה חייב להיות מותאם במיוחד, למשל, כביסה נרחב עשויה להיות שימושית עבור הפחתת מחייב שאינם ספציפיים.
  8. להעביר את השקופיות fixator המכילה אבקת paraformaldehyde (PFA) עבור קיבוע לילה עם כדורגלן האדים ב RT כדי להגן על היושר של המתחם ליגנד-יעד.
    התראה: PFA רעיל. למקם את fixator בתוך מנדף, להימנע ממגע עור/עיניים עם כדורגלן.
  9. למחרת, להעביר את השקופיות תיבת desiccator המכילה סיליקה ג'ל עבור h 3 RT לסלק לחות.

3. חשיפה פוספור הדמיה צלחות וסריקה

  1. מקום הסעיפים קלטת ממוגן קרינה צלחת הדמיה עם רקמת פונה כלפי מעלה. על כימות עוקבות של איגוד radioligand, לכלול microscale [3H] של כל קלטת. לארגן את הסעיפים באופן אקראי ולחשוף את הסעיפים להשוואה ישירה במגרה אותו.
  2. למחוק את הזרחן טריטיום רגיש הדמיה צלחת מיד לפני השימוש כדי להסיר שהצטברו. אותות אחסון וכדי לחסל את הרקע אותות. לכן, לטעון את הצלחת לתוך מכונת הדמיה פוספור, לחשוף אותם בפני גלוי/אינפרא אדום בהיר על פי ההוראות של היצרן.
  3. הסר את הלוחית של מכונת הדמיה פוספור והכנס אותו מיד בסעיפים בקלטת. ודא כי בקלטת סגורה לחלוטין. חושפים את הסעיפים לצלחת הדמיה פוספור במשך 3 ימים ב- RT מפני אור.
  4. כי אור מוחק אות מהצלחת הדמיה, בזהירות לפתוח את הקלטת בחושך מיד להעביר את הצלחת ההדמיה לתוך התיבה כהה imager פוספור או למקם םלצה פוספור בחדר חשוך.
    הערה: הקפד notate הסידור המרחבי של השקופיות במהלך החשיפה כדי לזהות הדגימה בודדים על התמונה הדיגיטלי לאחר ניתוח. לכן, צלחות הדמיה פוספור להציג גם פינה אחת חיתוך זווית ברורים על מנת לזהות את הכיוון הנכון של הצלחת על התמונה הדיגיטלית.
  5. סרוק את הצלחת לרזולוציה הגבוהה ביותר ניתן לקבל תמונות דיגיטליות.

4. אופציונלי: Cresyl מכתים סגול סעיפים רקמות

  1. להכין 1% cresyl, ויולט פתרון על ידי ערבוב 5 g אצטט cresyl סגול ב- 500 מ"ל מים יונים (dH2O) עד התפרקה (כ ח 2). לסנן באמצעות נייר סינון באמצעות משפך לתוך בקבוק 500 מ"ל חדש. להתאים את ה-pH ל 3.5-3.8.
  2. מיקום ההכתמה שקופית להגדיר תחת fume המנוע. להכין מגשים עם הפתרונות הבאים לפי לבן מגשי פוליפרופילן (למעט קסילן):
    א 50% ethanol/50% dH2O
    נולד ב 70% ethanol/30% dH2O
    ג. 100% אתנול
    ד 100% אתנול
    אי 100% dH2O
    פ 1% cresyl סגול
    ג 0.07% חומצה אצטית (להוסיף µL 175 של חומצה אצטית 250 מ של dH2O).
    ה 100% קסילן במגשים עמידים הממיס הירוק
    אני 100% קסילן במגשים עמידים הממיס הירוק
  3. להעביר את השקופיות למכסה fume ומניחים בארון תקשורת שקופית.
  4. יתמוסס ליפידים באמצעות הגדלת סדרת מדורגת של אתנול dH2O 100% אתנול (מגש-ד) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.
  5. נתרענן דגימות dH2O דרך יורד ריכוזי אתנול (מגש-d בסדר הפוך, ואחריו מגש e) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.
  6. לטבול את דגימות בפתרון cresyl, ויולט למשך 10 דקות.
  7. יש לשטוף את דגימות ב- 0.07% חומצה אצטית ע י הרמת את השקופיות מעלה מטה בעדינות על ס' 4-8 לשטוף את השקופיות בטבילת dH2O עבור 1 דקות.
  8. מייבשים את דגימות ע י השריית השקופיות ב-30 s בסדר עולה ריכוזי אתנול (מגש-ד).
  9. העברת דגימות דרך שני מגשים של קסילן 100% (מגש h ואני) כדי להרוות האתנול.
  10. נתרענן דגימות dH2O דרך יורד ריכוזי אתנול (מגש-d בסדר הפוך, ואחריו מגש e) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.
  11. הסר את השקופיות תמיסת מלח עם מלקחיים. הוסף מספר טיפות של הממס האורגני הרכבה מדיה לכל שקופית ולהוסיף coverslip 24 x 60 מ מ על גבי כדי להגן על דגימות. להסיר בועות אוויר בין הדגימה coverslip בהקשת בעדינות על גבי coverslip.
    הערה: שמור את השקופיות הנותרים קסילן במהלך ההרכבה כדי למנוע התייבשות.
  12. השקופיות יבש לילה בשכונה fume-RT.
  13. להשיג תמונה של הדגימה עם מיקרוסקופ, המטרה X 1.25.

5. densitometric ניתוח של תמונה דיגיטלית

  1. למדוד צפיפות אופטית היחסי (מוטות) של כל כיול סטנדרטי מ microscale [3H] עם תוכנת ניתוח התמונה.
    1. בחר אזור בגודל זהה עבור כל נקודה של microscale [3H] בעזרת כלי ליצירת אזור של פריט התפריט אזור נחישות. להקצות מספר בכל אזור שנבחר על ידי לחיצה על מספר תחת פריט התפריט תווית.
    2. ייצוא OD ערכים עבור כל נקודת הכיול סטנדרטי על ידי לחיצה על קובץ | E ייצוא | אזור 2D ח. להעביר ערכים רוד גיליון אלקטרוני, לנרמל לפי גודל האזור שנבחר. לבצע רגרסיה ליניארית כדי לקבל עיקול רגיל לצורך ניתוח densitometric נוסף.
      הערה: ודא כי האזורים שנבחרו לוחיות ההסבר על מנת לזהות התאמת ערכי רוד ודוגמאות.
  2. לבצע כימות של autoradiograms באמצעות קניינית imaging התוכנה על-ידי בחירת האזור עניין (ROI) באמצעות כלי יצירת אזור בכל מקטע ומדידת שלה מקרי מוות ממנת יתר. בחר באותו האזור בכל מקטע על-ידי יצירת תבנית עבור האזור של עניין, אשר הועתקו, שמותאם ידנית כדי הבדלים קלים באנטומיה המוח על כל autoradiogram. לזהות את האנטומיה של רועי על ידי השוואה של autoradiograms עם אטלס18המוח. כאשר טיפולים מרובים מושווים, לבצע את הניתוח עיוור ולא אקראי כדי להימנע משוחד מבחר ROIs.
  3. ייצוא ערכים רוד והגדלים של אזורים שנבחרו לתוך גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על קובץ | E ייצוא | אזור 2D ח.
  4. לחלק את המוט מדודה של רועי שנבחרו על ידי אזור שלו כדי להשיג הצפיפות לכל אזור מסוים.
  5. למדוד את המוט של הרקע של הצלחת ולייצא ערכים רוד מתאימים וגודל האזור לתוך גיליון אלקטרוני. להחסיר את האות רקע הממוצע של כל ערך רוד של כל רועי.
  6. ממוצע המוטות של משכפל טכניים, קרי, סעיף משכפל השימוש ברקמה מן אותה חיה.
  7. השתמש העקומה סטנדרטי כדי להמיר מוטות ליחידות של איגוד radioligand, כלומר., nCi/mg רקמות מקבילות (TE).
    הערה: TE המונח משמש כי הסטנדרטים נוצרים עם חומרים להדמיית רקמת.
  8. לבטא הכריכה על ידי המרה של nCi/mg nmol/mg טה בהתאם לפעילות ספציפית radioligand (משוואה 1).
    figure-protocol-10300(1)
  9. כדי לקבל ערכים ספציפיים מחייב, להחסיר שאינם ספציפיים איגוד מ מחייב הכולל.
  10. משכפל הכריכה של כל שכפול ביולוגי באמצעות הממוצע של הצד הטכני הממוצע של כל בעל חיים (להשיג ב- 5.6 שלב).

תוצאות

התפלגות האנטומי של האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה באמצעות פרוטוקול המתואר, היה דמיינו את אנלוגי אסיד radiolabelled [3H] HOCPCA במוח העכבר, אשר נקטעה למקטעים הילתית, הווריד, אופקי (איור 3 ). רמות גבוהות של איגוד נצפתה היפוקמפוס, קליפת המוח, איגוד נמוך ב סטריאטום ואיג?...

Discussion

איכות autoradiographic assay נקבעת בדרך כלל לפי הרגישות של radioligand. גורם תורם מרכזי הוא radioisotope הנבחר, אשר ניתנת על-ידי הזמינות של ליגנדים ידוע או את הכדאיות של טכניקות ספציפיות labelling להניב ליגנדים עם פעילות ספציפית המתאימה (קרי, את כמות הרדיואקטיביות לכל יחידת השומה של radioligand)23, עם כמו...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי קרן לונדבק (גרנט R133-A12270) ושל קרן נורדיסק Novo (גרנט NNF0C0028664). המחברים מודים ד ר עופר בר מארק על אספקת radioligand [3H].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore107017
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mLSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus slidesVWR631-9483microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura Finetek Denmark ApS4451
Tritium Standard on GlasAmerican Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
Xylene substituteSigma-AldrichA5597

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. . Handbook of Radioactivity Analysis. , 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. . Receptor Binding Techniques. 897, (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. . Receptor-ligand interactions: a practical approach. , (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -. T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145RadioligandautoradiographyHOCPCAhydroxybutyricGHBNC 382

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved