Autorradiografía como un método sencillo y potente para la visualización y caracterización de dianas farmacológicas

Resumen

El método de autorradiografía se utiliza habitualmente para estudiar atascamiento de radioligands para las secciones de tejido para la determinación de la farmacología cuantitativa o cualitativa.

Resumen

Autorradiografía in vitro tiene como objetivo visualizar la distribución anatómica de una proteína de interés en tejidos de animales experimentales como en seres humanos. El método se basa en la unión específica de un radioligando a su destino biológico. Por lo tanto, las secciones de tejido congelado se incuban con la solución así, y el atascamiento al objetivo posteriormente se localiza por la detección de radiactividad, por ejemplo, mediante el uso de película fotosensible o las placas de la proyección de imagen de fósforo. Autoradiograms digitales resultantes muestran notable resolución espacial, que permite la cuantificación y localización de unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Por otra parte, la cuantificación permite la caracterización farmacológica de la afinidad del ligando por medio de constantes de disociación (K_d), constantes de inhibición (K), así como la densidad de sitios de unión (B_max) en los tejidos seleccionados. Así, el método proporciona información sobre la localización del objetivo y la selectividad del ligando. Aquí se ejemplifica la técnica autorradiográfica caracterización del ácido alta afinidad γ-hidroxibutírico (GHB) sitios en tejido fino del cerebro mamífero, con especial énfasis en consideraciones metodológicas sobre el análisis de enlace de Unión parámetros, la elección de la radioligand y el método de detección.

Introducción

Autorradiografía es un método que proporciona imágenes de decaimiento radiactivo. La técnica se utiliza habitualmente para el estudio de la distribución en los tejidos de una proteína de interés en vitro basada en una interacción farmacológica específica entre un compuesto radiomarcado y su objetivo. Esto proporciona información directa acerca de la selectividad del ligando el destino. Autorradiografía in vitro también se puede utilizar para la determinación cuantitativa de parámetros de enlace farmacológico de radioligands, tales como la constante de disociación (K_d) y la densidad de sitios de unión (B_max), así como para determinar la constante de inhibición (K_i) de competencia ligandos^1,2. Comparado con el tradicional homogeneizado así vinculante, autorradiografía tiene la ventaja de ser capaces de visualizar la anatomía espacial y sucintos datos de patrones de expresión regional³. El método de autorradiografía es por lo tanto una alternativa relevante para inmunocitoquímica, especialmente en la ausencia de un anticuerpo validado. Autorradiografía se implementa fácilmente en un laboratorio de radioisótopos estándar dado la disponibilidad de un radioligando apropiado con la especificidad farmacológica necesaria, acceso a un criostato para Microtomo para preparación de tejido y una adecuada proyección de imagen dispositivo que es capaz de analizar la distribución de la radioactividad en las secciones de tejido respectivo. En particular, un criterio de selección importante para el así es una cantidad limitada de enlace a sitios de destino no. Esto puede ser a otras proteínas, las membranas o materiales como plástico o filtros y colectivamente se conoce como fijación no específica. Generalmente, fijación no específica es no saturable, pero puede ser saturable si se trata de una proteína específica del objetivo. La mejor manera de validar la verdadera unión específica es comparar a tejidos que carecen el objetivo, por ejemplo, genéticamente diseñados (knock-out) tejido⁴.

Aquí, la metodología se ilustra con la caracterización autorradiográfica del sitio de unión de alta afinidad para el ácido γ-hidroxibutírico (GHB) en el cerebro mamífero. Comprensión de la interacción farmacológica entre el GHB y su sitio de Unión es de relevancia como el GHB es una droga tanto clínicamente útil en el tratamiento de la narcolepsia y alcoholismo⁵, pero también un componente natural del cerebro mamífero y un recreo drogas⁶. Sitios de unión de alta afinidad GHB primero fueron descritos usando Unión de GHB de [³H] a de homogeneizado de cerebro de rata⁷. Con los años, nuevos estudios de autorradiografía con [³H] GHB y el análogo [³H] NCS-382 ha demostrado una alta densidad de sitios en regiones del cerebro anterior de rata^8,9,10, ratón⁹ de Unión ,¹¹y mono humano cerebro¹²del cerdo. Sin embargo, la identidad molecular y relevancia funcional exacta de estos sitios de Unión se han mantenido esquivos.

Con la intención de caracterizar los sitios de Unión y facilitar los estudios sobre el papel fisiológico de GHB, se han desarrollado múltiples radioligands incorporando diferentes isótopos con afinidades diferentes ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA y [¹²⁵I] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(revisado en¹⁷) (figura 1). La combinación de radioligands selectivo de alta afinidad y una densidad muy alta del tejido del enlace sitios han permitido la producción de imágenes de alta calidad usando el fósforo imagen técnica^9,11. Junto con un resumen de los puntos prácticos en establecer un experimento autorradiográfica y una ilustración para ejemplificar detalles, hará hincapié en la sección discusión i) la elección de los radionucleidos, ii) la elección de las condiciones analíticas y iii) el uso de fósforo placas de imagen frente a la película de radiografía. El objetivo general de este trabajo es aportar detalles técnicos, metodológicos y científicos en la técnica de autorradiografía para informar sobre la distribución del tejido y análisis farmacológico de dianas de la proteína.

Protocolo

Manejo de los animales fue realizado cumpliendo con las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés.

Nota: El protocolo descrito aquí cubre preparación de tejido (es decir, tejido de cerebro de ratón), el ensayo autorradiográfica en vitro en suficiente detalle para configurar el método en un nuevo laboratorio, la exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo así como posterior análisis densitométrico de autoradiograms (figura 2) con el objetivo de localizar y cuantificar la Unión de radioligando en distintas estructuras anatómicas. Comparación histológica, se incluye un protocolo para la tinción violeta de cresilo. Por otra parte, la determinación de la fijación no específica con un ligando que compiten está incluida en el protocolo. Para una descripción detallada sobre cómo determinar K_d, B_máximo o K, ver publicación anterior⁴.

1. tejido preparación por Cryosectioning

1. Eutanasia el ratón por dislocación cervical y diseccionar inmediatamente hacia fuera el cerebro usando tijeras y pinzas. Proceder directamente al paso siguiente para evitar daño a los tejidos.
2. Rápido-congele el tejido por inmersión en hielo seco en polvo, gases CO₂ o isopentano. Transferir directamente el tejido congelado a un criostato con la temperatura a-20 ° C. Alternativamente, guarde el tejido a-80 ° C hasta el procesamiento.
   Nota: Evite congelación descongelación repetida para reducir el daño tisular.
3. Que el tejido aclimatar a-20 ° C en el criostato para 20 minutos antes de proseguir para evitar el destruyendo tejido.
4. Cubrir el soporte de tejido con incrustación medio fuera el criostato y rápidamente Coloque al espécimen de tejido congelado en la orientación deseada, mientras que el medio de inclusión es líquido inmóvil. Por ejemplo, coloque el cerebro de ratón verticalmente sobre el cerebelo para lograr secciones coronales rostrales. Transferir el portapapel higiénico a criostato y exponer el medio de inclusión a temperaturas abajo de-10 ° C para endurecer.
   Nota: Muestra de tejido frágil debe ser cubierto en la encajadura medio dentro de los moldes de tejido antes del montaje.
5. Posición el portapapel higiénico en el microtomo de criostato. Ajustar la orientación del tejido para evitar secciones inclinadas.
6. Cortar el tejido con la dirección de un atlas estereotáxicas¹⁸ en secciones de espesor deseado (μm 12 recomendado para [³H] con ligandos). Cuidadosamente enderezar y desplegar la sección con un cepillo de tamaño pequeño si es necesario y deshielo-Monte la sección sobre un portaobjetos de microscopio. Recoger secuencialmente las secciones de la región de interés para la replicación técnica deseada (por ejemplo, 4 secciones por diapositiva).
7. Permiten que las secciones de los portaobjetos se seque al aire durante 1 hora antes de manipular otros.
   Nota: Además de material desecante para deslizamiento de cajas reduce al mínimo la acumulación de humedad en las secciones de tejido. Procotol puede hacer una pausa aquí por almacenar secciones a largo plazo en las cajas de diapositivas a-80 ° C.

2. autorradiografía in vitro

PRECAUCIÓN: radiactividad. Trabajo en un laboratorio certificado según las normas locales. Usar ropa protectora. Deséchelo conforme a decaimiento radiactivo o subcontratar a una empresa certificada.

1. Descongele las secciones por lo menos 30 min a temperatura ambiente (RT). Etiquete los portaobjetos con las condiciones experimentales. Utilice un lápiz porque las diapositivas serán bañadas en etanol durante la coloración posterior.
2. Coloque las correderas horizontalmente en bandejas de plástico.
   Nota: Diapositivas sobre una plataforma elevada en bandejas plásticas de posicionamiento facilita su manejo.
3. Incubate previamente las secciones montadas en las diapositivas en tampon de ensayo ajustan al objetivo en cuestión (se utiliza el protocolo de GHB, 50 mM KHPO₄ buffer pH 6.0) aplicando cuidadosamente a un volumen adecuado en la diapositiva (700 μL para roedores secciones coronales de 3-4).
   Nota: Asegúrese de que cada sección se cubre totalmente con el líquido.
   1. Cubrir las bandejas de plástico con tapa para evitar evaporación y Pre-incubar a temperatura relevante (para protocolo GHB previamente incubate por 30 min a temperatura ambiente) bajo constante suave (20 rpm) agitación en un agitador de placa.
   2. Para la determinación de la Unión no-específica, suplemento tampón de ensayo con concentración relevante de compuesto sin etiqueta (para protocolo GHB, 1 mM GHB).
      Nota: Pre incubación puede no ser necesario.
4. Vierta el líquido de preincubación de cada diapositiva y transfiera los portaobjetos a la bandeja de plástico.
5. Para evitar la deshidratación, inmediatamente incubar las secciones con concentración relevante de radioligando en tampon de ensayo bajo condiciones deseadas (Protocolo de GHB, 1 nM [³H] HOCPCA por 1 h a temperatura ambiente) cubriendo las secciones completamente con el radioligando solución (700 μL para roedores secciones coronales de 3-4).
   1. Incubar bajo bajo agitación suave constante (20 rpm) de bandejas de plástico con tapa cerrada.
      Nota: La concentración radioligand puede validarse contando una alícuota en un contador de centelleo líquido.
6. Retirar la solución de incubación vertiendo el líquido y transfiera los portaobjetos a un rack de portaobjetos de microscopio. Inmediatamente proceder con el siguiente paso para evitar la deshidratación de la sección.
7. Lave los portaobjetos. Para el protocolo GHB, lavado con tampón de ensayo helado dos veces para 20 s y luego enjuague dos veces por inmersión de la parrilla en las bandejas lleno de agua destilada helada para eliminar las sales. Ponga las diapositivas verticalmente en racks de secado al aire durante al menos 1 h a temperatura ambiente o secar los portaobjetos durante 5 minutos con un soplador a baja temperatura.
   Nota: El lavado debe optimizarse, p. ej., lavado extenso puede ser útil para disminuir la fijación no específica.
8. Transfiera los portaobjetos a un fijador que contiene polvo paraformaldehido (PFA) para la fijación con vapores de PFA en RT para proteger la integridad del complejo ligando-objetivo.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Fixator positionthe en campana de humo y evitar el contacto de la piel, ojo con PFA.
9. Al día siguiente, transfiera los portaobjetos a un cuadro de desecador con gel de sílice durante 3 horas a temperatura ambiente para eliminar la humedad.

3. exposición a las placas de la proyección de imagen de fósforo y exploración

1. Coloque las secciones en un cassette de placa de blindaje de radiación con el tejido hacia arriba. Para la cuantificación posterior de unión de radioligando, incluyen una microescala de [³H] en cada cassette. Organizar las secciones al azar y exponer las secciones de comparación directa en el mismo cartucho.
2. Borrar el fósforo de tritio-sensible a la placa inmediatamente antes de su uso para la proyección de imagen para quitar señales acumuladas desde almacenamiento de información y eliminar señales de fondo. Por lo tanto, la placa de carga en la máquina de proyección de imagen de fósforo y exponerlo a la visible/infrarrojo de luz según las instrucciones del fabricante.
3. Retire la placa de la máquina de proyección de imagen de fósforo y colóquelo inmediatamente en las secciones en el cassette. Asegúrese de que el cartucho está completamente cerrado. Exponga las secciones a la placa de la proyección de imagen de fósforo por 3 días a temperatura ambiente protegido de la luz.
4. Porque la luz borra la señal de la placa de imagen, cuidadosamente abrir el casete en la oscuridad e inmediatamente transferir la placa de imagen en la caja oscura de un sensor de fósforo o colocar al toner de fósforo en un cuarto oscuro.
   Nota: Asegúrese de anotar el arreglo espacial de las diapositivas durante la exposición para identificar a cada muestra en la imagen digital después de análisis. Por lo tanto, las placas de fósforo también mostrarán una de las esquinas cortada en un ángulo distinto para identificar la orientación correcta de la placa en la fotografía digital.
5. Escanear la placa a la máxima resolución posible obtener una imagen digital.

4. opcional: Cresil violeta tinción de secciones de tejido

1. Preparar solución de violeta de cresilo 1% mezclando 5 g de acetato violeta de cresilo en 500 mL de agua desionizada (dH₂O) hasta que se disuelva (aproximadamente 2 h). Filtrar con un papel de filtro con un embudo en una nueva botella de 500 mL. Ajustar el pH a 3.5-3.8.
2. La tinción de la diapositiva en la posición bajo campana. Preparar las bandejas con las siguientes soluciones en bandejas de polipropileno blanco (excepto xileno):
   a. 50% ethanol/50% dH₂O
   b. 70% ethanol/30% dH₂O
   c. el 100% de etanol
   d. 100% etanol
   e. 100% dH₂O
   f. violeta de cresilo 1%
   g. 0.07% de ácido acético (Añadir 175 μl de ácido acético a 250 mL de dH₂O).
   h. 100% xileno en bandejas resistentes a los disolventes verdes
   i. 100% de xileno en bandejas resistentes a los disolventes verdes
3. Transfiera los portaobjetos a la campana y colocarlos en un estante de la diapositiva.
4. Se disuelven los lípidos a través de la creciente serie gradual de etanol en dH₂O en etanol al 100% (bandeja a-d) sumergiendo los portaobjetos durante 1 minuto.
5. Rehidratar a las muestras dH₂O al bajar las concentraciones de etanol (bandeja a-d en orden inverso, seguido de bandeja e) sumergiendo los portaobjetos durante 1 minuto.
6. Sumergir a los especímenes en la solución de violeta de cresilo en 10 minutos.
7. Enjuagar a los especímenes en 0.07% de ácido acético levantando las diapositivas las diapositivas hacia arriba y hacia abajo suavemente para 4-8 s. lavado por inmersión en dH₂O por 1 minuto.
8. Deshidratar los especímenes por inmersión de los portaobjetos durante 30 s en ascendente concentraciones de etanol (bandeja a-d).
9. Transferir a las muestras a través de dos bandejas de 100% xileno (bandeja h e i) para calmar el etanol.
10. Rehidratar a las muestras dH₂O al bajar las concentraciones de etanol (bandeja a-d en orden inverso, seguido de bandeja e) sumergiendo los portaobjetos durante 1 minuto.
11. Quite las diapositivas de solución salina con el fórceps. Añadir unas gotas de solvente orgánico montaje medios por diapositiva y agregar un cubreobjetos de 24 x 60 mm en la parte superior para proteger a los especímenes. Eliminar burbujas de aire entre la muestra y cubreobjetos presionando suavemente sobre el cubreobjetos.
    Nota: Mantenga las diapositivas restantes en xileno durante el montaje para prevenir la resequedad.
12. Seco el portaobjetos durante la noche en una capilla del humo a TA.
13. Obtener una imagen de muestra con un microscopio y 1.25 X objetivo.

5. densitométricos análisis de imagen Digital

1. Medir densidades ópticas relativa (barras) de cada calibración estándar de la microescala de [³H] con un software de análisis de imagen.
   1. Seleccione un área de igual tamaño para cada punto de la microescala de [³H] usando una herramienta para la creación de la región desde el menú de determinación de la región. Asignar a un número a cada área seleccionada haciendo clic en número en el menú etiqueta.
   2. Valores de OD para cada punto de la calibración estándar de la exportación haciendo clic en archivo | E xport | Informe región 2D. Valores de barra de transferencia a una hoja de cálculo y normalizar por el tamaño del área seleccionada. Realice regresión lineal para obtener una curva estándar para su posterior análisis densitométrico.
      Nota: Asegúrese de que las áreas seleccionadas están etiquetadas para la identificación de muestras y valores de la barra.
2. Realizar cuantificación de autoradiograms usando el propietario software de imágenes mediante la selección de la región de interés (ROI) mediante una herramienta de creación de la región en cada sección y medición de la Sao. Seleccione la misma región en cada sección mediante la creación de una plantilla para la región de interés, que se copia y se ajustan manualmente a pequeñas variaciones en la anatomía del cerebro para cada autoradiogram. Identificar la anatomía del ROI por comparación de autoradiograms con un cerebro atlas¹⁸. Cuando se comparan tratamientos múltiples, realizar el análisis aleatorios para evitar selección sesgada de ROIs y cegado.
3. Exportar valores de barra y los tamaños de las áreas seleccionadas en una hoja de cálculo haciendo clic en archivo | E xport | Informe región 2D.
4. Dividir la varilla de medición del ROI seleccionada por su área para obtener la densidad por área específica.
5. Medir la barra del fondo de la placa y los valores correspondientes de la barra y el tamaño del área de exportación en una hoja de cálculo. Restar la señal de fondo promedio de cada valor de la barra de cada retorno de la inversión.
6. Medio de las barras de repeticiones técnicas, es decir, sección Replica utilizando tejido del mismo animal.
7. Utilizar la curva estándar para convertir las barras en unidades de atascamiento radioligand, es decir., equivalentes de tejido nCi/mg (TE).
   Nota: Se utiliza el TE de término porque las normas son generadas con materiales que simulan tejido.
8. Expreso vinculante por la conversión de nCi/mg nmol/mg TE según la actividad específica de radioligando (ecuación 1).
   (1)
9. Para obtener los valores de unión específica, reste el atascamiento no específico de Unión total.
10. Media la Unión de cada repetición biológica utilizando el medio de la técnica replica de cada animal (obtenido en paso 5.6).

Resultados

Utilizando el protocolo descrito, la distribución anatómica de los sitios de unión de alta afinidad GHB se visualizó con el análogo radiolabelled de GHB [³H] HOCPCA en cerebro de ratón, que fue cortado en secciones coronales, sagitales y horizontales (figura 3 ). Se observaron altos niveles de enlace en el hipocampo y la corteza, enlace inferior en striatum y no vinculante fue detectados en cerebelo, correspondiente a los patrones de expresi?...

Discusión

La calidad de un ensayo autorradiográfica más a menudo se determina por la sensibilidad del radioligando. Un factor que contribuye es el radioisótopo seleccionado, que es dado por la disponibilidad de los ligandos conocidos o por la viabilidad de técnicas específicas de etiquetado para ligandos con actividad específica adecuada(es decir, la cantidad de radiactividad por la mole de la unidad de un radioligando)²³y con cantidades limitadas de degradación química. Un gran número de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597