Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

Riepilogo

Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l'associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.

Abstract

In vitro l'autoradiografia ha lo scopo di visualizzare la distribuzione anatomica di una proteina di interesse nel tessuto da animali da esperimento come pure gli esseri umani. Il metodo si basa sul legame specifico di un radioligand al suo target biologico. Pertanto, le sezioni di tessuto congelato sono incubate con radioligandi soluzione e l'associazione alla destinazione è successivamente localizzata tramite la rilevazione del decadimento radioattivo, ad esempio, utilizzando la pellicola fotosensibile o fosforo piastre di imaging. Autoradiogrammi digitale risultante visualizzare notevole risoluzione spaziale, che consente la quantificazione e la localizzazione di radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Inoltre, quantificazione consente la caratterizzazione farmacologica di affinità ligando mediante costanti di dissociazione (K_d), costanti di inibizione (K_io) così come la densità di siti di legame (B_max) in determinati tessuti. Così, il metodo fornisce informazioni sulla localizzazione di destinazione sia selettività ligando. Qui, la tecnica è esemplificata con autoradiografico caratterizzazione dell'acido ad alta affinità γ-idrossibutirrico (GHB) siti nel tessuto di cervello dei mammiferi, con speciale enfasi su considerazioni metodologiche per quanto riguarda l'analisi obbligatoria di legame parametri, la scelta del radioligand e il metodo di rilevamento.

Introduzione

Autoradiografia è un metodo che fornisce immagini di decadimento radioattivo. La tecnica è usata ordinariamente per studiare la distribuzione tissutale di una proteina di interesse in vitro basato su una specifica interazione farmacologica tra un composto radiomarcato e l'obiettivo. Questo fornisce informazioni dirette circa la selettività del ligando per la destinazione. Autoradiografia in vitro può essere utilizzato anche per la determinazione quantitativa di parametri di associazione farmacologica di radioligands, come la costante di dissociazione (K_d) e densità di siti di legame (B_max), nonché per la determinazione la costante di inibizione (K_i) delle concorrenti ligandi^1,2. Rispetto al tradizionale omogeneato radioligand binding, autoradiografia ha il vantaggio di essere in grado di visualizzare anatomia spaziale e con l'indicazione succinte della espressione regionale modelli³. Il metodo di autoradiografia è quindi un'alternativa pertinente per immunocitochimica, soprattutto in assenza di un anticorpo convalidato. Autoradiografia viene implementata facilmente in un laboratorio del radioisotopo standard dato la disponibilità di un radioligand adatto con la necessaria specificità farmacologica, ad un criostato microtomo per la preparazione di sezioni di tessuto e un imaging adatto dispositivo che è in grado di analizzare la distribuzione della radioattività nelle sezioni rispettive del tessuto. In particolare, un importante criterio di selezione per il radioligando è una quantità limitata di associazione ai siti non-bersaglio. Questo può essere ad altre proteine, membrane o materiali quali plastica o filtri ed è collettivamente come legame non specifico. Solitamente, il legame non specifico è non saturabile ma può essere saturabile se si tratta di una specifica proteina fuori bersaglio. Il modo migliore di convalida vero legame specifico è da confrontare con tessuti manca il bersaglio, per esempio, geneticamente ingegnerizzati (knock-out) del tessuto⁴.

Qui, la metodologia è illustrata con la caratterizzazione autoradiografica del sito di legame ad alta affinità per l'acido γ-idrossibutirrico (GHB) nel cervello dei mammiferi. Comprendere l'interazione farmacologica tra GHB e il suo sito di legame è di pertinenza come GHB è una droga sia clinicamente utile nel trattamento della narcolessia e alcolismo⁵, ma anche un costituente naturale del cervello dei mammiferi e un'area di divertimento droga⁶. Siti di legame ad alta affinità GHB in primo luogo sono stati descritti utilizzando [³H] associazione di GHB a ratto cervello omogeneato⁷. Nel corso degli anni, ulteriori studi di autoradiografia con [³H] GHB e l'analogo [³H] NCS-382 ha mostrato un'alta densità di siti nelle regioni del forebrain del ratto^8,9,10, mouse⁹ di legame ,¹¹e scimmia/umano cervello¹²del maiale. Tuttavia, l'identità molecolare ed esatta rilevanza funzionale di questi siti di legame sono rimasti sfuggente.

Con l'intenzione di caratterizzare ulteriormente i siti di legame e per facilitare gli studi sul ruolo fisiologico di GHB, sono state sviluppate più radioligands incorporando isotopi diversi dotati di diverse affinità ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA e [¹²⁵I] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(rivisto in¹⁷) (Figura 1). La combinazione di selettivo ad alta affinità radioligands e una densità molto elevata del tessuto dell'associazione siti hanno permesso per la produzione di immagini di alta qualità utilizzando il fosforo imaging tecnica^9,11. Insieme con un contorno dei punti pratici nella creazione di un esperimento autoradiografico e un'illustrazione per esemplificare i dettagli, la sezione di discussione metterà in risalto i) la scelta di radionuclide, ii) la scelta delle condizioni di dosaggio e iii) l'uso del fosforo Imaging piastre contro pellicola di raggi x. L'obiettivo generale di questa carta è quello di fornire dettagli tecnici, metodologici e scientifici sulla tecnica autoradiografia per informare sulla distribuzione tissutale e analisi farmacologica di bersagli proteici.

Protocollo

Tutti gli animali gestione è stata eseguita in conformità con le linee guida da The ispettorato danese di sperimentazione animale.

Nota: Il protocollo descritto qui copre (cioè, tessuto di cervello di topo), preparazione di tessuti in vitro autoradiografico dosaggio in modo sufficientemente dettagliato per l'impostazione del metodo in un nuovo laboratorio, l'esposizione al fosforo piastre di imaging come pure successiva analisi densitometrica di autoradiogrammi (Figura 2) con lo scopo di localizzare e quantificare radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Per il confronto istologico, un protocollo per la macchiatura di cresyl violet è incluso. Inoltre, la determinazione del legame non specifico con un ligando concorrente è inclusa all'interno del protocollo. Per una descrizione dettagliata su come determinare K_d, B_max o K_io, vedere precedente pubblicazione⁴.

1. preparazione di Cryosectioning

1. Eutanasia il mouse di dislocazione cervicale e scomporre immediatamente fuori il cervello con delle forbici, pinze. Procedere direttamente al passaggio successivo per evitare danni ai tessuti.
2. Snap-congelare il tessuto da immersione in ghiaccio secco in polvere, gassosi CO₂ o isopentano. Trasferire direttamente il tessuto congelato per un criostato con temperatura impostata a-20 ° C. In alternativa, è possibile memorizzare il tessuto a-80 ° C fino al trattamento.
   Nota: Evitare lo scongelamento/congelamento ripetuto per ridurre il danno tissutale.
3. Lasciare che il tessuto acclimatare a-20 ° C a criostato per 20 min prima del successivo trattamento per evitare la rottura del tessuto.
4. Coprire il Portarotolo con mezzo di inclusione di fuori del criostato e posizionare rapidamente il campione di tessuto congelato l'orientamento desiderato, mentre il mezzo di inclusione è ancora liquido. Per esempio, mettere il cervello di topo verticalmente sul cervelletto al fine di ottenere sezioni coronali rostrale. Trasferire il portarotolo del criostato ed esporre il mezzo di inclusione a temperature inferiori a-10 ° C per l'indurimento.
   Nota: Esemplare Fragile tessuto deve essere spalmati in mezzo all'interno degli stampi di tessuto prima del montaggio di inclusione.
5. Posizionare il supporto di tessuto nel microtomo del criostato. Regolare l'orientamento del tessuto per evitare tratti inclinati.
6. Tagliare il tessuto con la Guida di un Atlante stereotassiche¹⁸ nelle sezioni di spessore desiderato (12 µm consigliato per [³H] etichettati ligandi). Attentamente raddrizzare e aprire la sezione con un pennello di piccole dimensioni, se necessario e disgelo-Monte la sezione su un vetrino da microscopio. Raccogliere in sequenza le sezioni dalla regione di interesse per replica tecnica desiderato (ad esempio, 4 sezioni per ogni diapositiva).
7. Consentire le sezioni sui vetrini asciugare all'aria per 1 h prima di ulteriore gestione.
   Nota: Aggiunta di materiale essiccante per scatole di diapositiva riduce al minimo l'umidità accumulo su sezioni di tessuto. Procotol può essere messo in pausa qui memorizzando sezioni a lungo termine nelle caselle di diapositiva a-80 ° C.

2. in vitro autoradiografia

Attenzione: radioattività. Lavorare in un laboratorio certificato secondo le normative locali. Indossare indumenti protettivi. Smaltire secondo decadimento radioattivo o in outsourcing ad una società certificata.

1. Scongelare le sezioni per almeno 30 min a temperatura ambiente (TA). Marcare i vetrini con condizioni sperimentali. Utilizzare una matita perché le diapositive verranno essere inondate di etanolo durante la successiva colorazione.
2. Porre i vetrini in posizione orizzontale in vassoi di plastica.
   Nota: Posizionamento di diapositive su una piattaforma elevata all'interno di vassoi in plastica facilita la loro manipolazione.
3. Pre-incubate le sezioni montate su slitte nel tampone adeguato al target in questione (per il protocollo di GHB, tampone 50 mM a pH 6.0 KHPO₄ è usato) applicando accuratamente un volume adeguato sulla diapositiva (700 µ l per 3-4 sezioni coronali roditore).
   Nota: Assicurarsi che ogni sezione è coperto completamente di liquido.
   1. Coprire i vassoi in plastica con un coperchio per evitare l'evaporazione e pre-Incubare a temperatura rilevanti (per protocollo GHB pre-incubata per 30 min a RT) sotto costante brezza (20 giri) agitazione su un agitatore per piastre.
   2. Per la determinazione del legame non specifico, supplemento di tampone con concentrazione rilevante di adenoida composto (per protocollo di GHB, 1mm GHB).
      Nota: Pre-incubazione può non essere necessario.
4. Versare liquido di pre-incubazione da ogni diapositiva e trasferire le diapositive indietro il vassoio di plastica.
5. Per evitare la disidratazione, immediatamente Incubare le sezioni con concentrazione rilevante di radioligand nel tampone sotto condizioni desiderate (per il protocollo GHB, 1 nM [³H] HOCPCA per 1h a RT) coprendo le sezioni completamente con il radioligando soluzione (700 µ l per 3-4 sezioni coronali roditore).
   1. Incubare sotto sotto agitazione costante brezza (20 giri) di vassoi in plastica con coperchio chiuso.
      Nota: La concentrazione radioligand può essere convalidata da contando un'aliquota in un contatore a scintillazione liquida.
6. Rimuovere la soluzione di incubazione versando il liquido e trasferire i vetrini in un rack di vetrino del microscopio. Procedere immediatamente alla fase successiva per evitare la disidratazione di sezione.
7. Lavare i vetrini. Per il protocollo GHB, lavare con tampone ghiacciata due volte per 20 s e poi risciacquare due volte immergendo il portavetrini nei vassoi riempiti con acqua ghiacciata distillata per rimuovere sali. Posizionare i vetrini verticalmente in rack per essiccamento all'aria per almeno 1 h a RT o asciugare i vetrini per 5 min con un soffiatore impostato su temperatura fredda.
   Nota: Il lavaggio deve essere ottimizzato, ad esempio, vasto lavaggio può essere utile per diminuire il legame non specifico.
8. Trasferire i vetrini di un fixator contenenti polvere di paraformaldeide (PFA) per la fissazione durante la notte con vapori PFA a RT al fine di proteggere l'integrità del complesso ligando-target.
   Attenzione: PFA è tossico. Sene fixator nel cappuccio del vapore ed evitare il contatto con pelle e occhi con PFA.
9. Il giorno seguente, trasferire i vetrini in una scatola di un essiccatore contenente gel di silice per 3 h a RT per eliminare l'umidità.

3. esposizione al fosforo Imaging piastre e scansione

1. Inserire le sezioni in una schermatura radiazioni imaging Piastra mangianastri con il tessuto rivolto verso l'alto. Per la successiva quantificazione del grippaggio radioligand, includono un Microscala [³H] in ogni cassetta. Organizzare le sezioni in modo casuale ed esporre le sezioni per confronto diretto nella stessa cassetta.
2. Cancellare il fosforo di trizio-sensibile imaging piastra immediatamente prima dell'uso, al fine di rimuovere segnali accumulati dal deposito e per eliminare i segnali di sfondo. Pertanto, la piastra di carico in macchina imaging fosforo ed esporlo visibile/infrarosso luce secondo le istruzioni del produttore.
3. Rimuovere la piastra dalla macchina imaging fosforo e posizionatelo immediatamente sopra le sezioni nella cassetta. Assicurarsi che la cassetta è chiusa completamente. Esporre le sezioni per la piastra di imaging di fosforo per 3 giorni a temperatura ambiente al riparo da luce.
4. Perché luce Cancella segnale dalla piastra di imaging, attentamente aprire la cassetta al buio e immediatamente trasferire la piastra imaging nella casella scura di un imager di fosforo o posizionare il dispositivo di imaging di fosforo in una stanza buia.
   Nota: Assicurarsi di annotare la disposizione spaziale delle diapositive durante l'esposizione al fine di identificare singoli esemplare sull'immagine digitale dopo l'analisi. Pertanto, imaging piastre al fosforo visualizzano anche un angolo tagliato in un angolo di distinto al fine di individuare il corretto orientamento della piastra sull'immagine digitale.
5. Scansione la piastra alla massima risoluzione possibile ottenere un'immagine digitale.

4. facoltativo: Cresile viola colorazione di sezioni di tessuto

1. Preparare 1% cresyl violet soluzione miscelando 5 g di cresile viola in 500 mL di acqua deionizzata (dH₂O) fino a completa dissoluzione (circa 2 h). Filtrare attraverso un filtro di carta utilizzando un imbuto in una nuova bottiglia di 500 mL. Regolare il pH a 3.5-3.8.
2. La colorazione del vetrino e arretrata sotto cappa. Preparare i vassoi con le seguenti soluzioni in vassoi in polipropilene bianchi (ad eccezione di xilene):
   a. 50% ethanol/50% dH₂O
   b. 70% ethanol/30% dH₂O
   c. 100% etanolo
   d. 100% etanolo
   e. 100% dH₂O
   f. viola di cresyl 1%
   g. 0.07% di acido acetico (aggiungere 175 µ l di acido acetico in 250 mL di dH₂O).
   h. 100% xilene in verde vassoi resistenti ai solventi
   i. 100% xilene in verde vassoi resistenti ai solventi
3. Trasferire i vetrini per la cappa e metterli in un portavetrini.
4. Sciogliere i lipidi attraverso la serie graduata crescente di etanolo in dH₂O in etanolo al 100% (vassoio a-d) immergendo i vetrini per 1 min.
5. Reidratare gli esemplari di dH₂O attraverso decrescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d in ordine inverso, seguita dalla vaschetta e) immergendo i vetrini per 1 min.
6. Immergere gli esemplari in soluzione di cresile viola per 10 min.
7. Sciacquare gli esemplari in 0.07% di acido acetico sollevando le diapositive su e giù dolcemente per 4-8 s. lavare i vetrini mediante immersione in dH₂O per 1 min.
8. Disidratare gli esemplari per immersione delle diapositive per 30 s in crescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d).
9. Trasferire gli esemplari attraverso due vassoi di xilene 100% (vassoio h e i) per placare l'etanolo.
10. Reidratare gli esemplari di dH₂O attraverso decrescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d in ordine inverso, seguita dalla vaschetta e) immergendo i vetrini per 1 min.
11. Rimuovere le diapositive da saline con le pinzette. Aggiungere poche gocce di solvente organico montaggio supporti per ogni diapositiva e un vetrino coprioggetto 24 x 60 mm sulla parte superiore per proteggere gli esemplari. Rimuovere le bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti premendo delicatamente sul vetrino coprioggetti.
    Nota: Tenere le rimanenti diapositive in xilene durante il montaggio per evitare l'essiccazione.
12. A secco le diapositive durante la notte in una cappa a TA.
13. Ottenere una foto del campione con un microscopio e 1,25 X obiettivo.

5. densitometrica analisi di immagine digitale

1. Misurare la relativa densità ottica (barre) di ogni standard da Microscala [³H] con un software di analisi di immagine di calibrazione.
   1. Selezionare un'area di dimensioni uguali per ogni punto di Microscala [³H] utilizzando un tool per la creazione della regione dalla voce di menu determinazione regione. Assegnare un numero ad ogni area selezionata cliccando sul numero sotto la voce di menu Label.
   2. Esportare valori OD per ogni punto standard di calibrazione facendo clic File | E sporta | relazione regione 2D. Trasferire i valori ROD in un foglio di calcolo e normalizzare dalla dimensione dell'area selezionata. Eseguire la regressione lineare per ottenere una curva standard per ulteriore analisi densitometrica.
      Nota: Assicurarsi che le aree selezionate siano etichettate al fine di identificare i corrispondenti valori ROD e campioni.
2. Eseguire la quantificazione di autoradiogrammi utilizzando i propri software di imaging selezionando la regione di interesse (ROI) utilizzando uno strumento di creazione della regione in ogni sezione e misura relativo ODs. Selezionare la regione stessa in ogni sezione creando un modello per la regione di interesse, che viene copiato e regolata manualmente variazioni minori nell'anatomia del cervello per ogni autoradiogram. Identificare l'anatomia del ROI di confronto di autoradiogrammi con un cervello Atlante¹⁸. Quando vengono confrontati i trattamenti multipli, eseguire l'analisi in cieco e randomizzato al fine di evitare la selezione parziale di ROIs.
3. Esportare valori ROD e delle dimensioni delle aree selezionate in un foglio di calcolo facendo clic File | E sporta | relazione regione 2D.
4. Dividere l'asta di misura del ROI selezionato dalla relativa zona per ottenere la densità per l'area specifica.
5. Misurare l'asta dello sfondo della piastra ed esportare i valori corrispondenti di ROD e dimensioni dell'area in un foglio di calcolo. Sottrarre il segnale di fondo medio da ogni valore ROD di ogni ROI.
6. Media le aste dei replicati tecnici, vale a dire, sezione replica usando il tessuto dall'animale stesso.
7. Utilizzare la curva standard per convertire canne in unità di radioligand binding, vale a dire., equivalenti di nCi/mg del tessuto (TE).
   Nota: Il termine TE viene utilizzato perché gli standard sono generati con materiali che simula il tessuto.
8. Rapidi di associazione di conversione di nCi/mg di nmol/mg TE secondo l'attività specifica del radioligand (equazione 1).
   (1)
9. Per ottenere valori di legame specifico, sottrarre il legame non specifico dall'associazione totale.
10. Media il legame di ogni replica biologico utilizzando la media del tecnico replica di ogni animale (ottenuto nel passo 5.6).

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto, la distribuzione anatomica di siti di legame ad alta affinità GHB è stata visualizzata con l'analogo GHB radiomarcato [³H] HOCPCA nel cervello di topo, che è stato tagliato in sezioni coronale, sagittali e orizzontale (Figura 3 ). Alti livelli di associazione sono stati osservati nell'ippocampo e nella corteccia, inferiore nel corpo striato e l'associazione non è state rilevate nel cervelletto, corrispondent...

Discussione

La qualità di un'analisi autoradiografica viene determinata dalla sensibilità del radioligand. Un fattore di contributo importante è il radioisotopo selezionato, che è dato dalla disponibilità di ligandi noti o dalla fattibilità di specifiche tecniche di etichettatura per produrre ligandi con appropriata attività specifica (cioè, la quantità di radioattività per mole unità un radioligando)²³e con limitate quantità di degradazione chimica. Un gran numero di radioligands di liga...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597