Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Methode der Autoradiographie wird routinemäßig zur Bindung von Radioligands an Gewebeschnitten zur Bestimmung der qualitativen oder quantitativen Pharmakologie zu studieren.

Zusammenfassung

In-vitro- Autoradiographie zielt darauf ab, die anatomische Verteilung eines Proteins des Interesses an Gewebe von Versuchstieren sowie Menschen zu visualisieren. Die Methode basiert auf die spezifische Bindung von Radioligand zu seinem biologischen Ziel. Daher sind gefrorene Gewebeschnitte mit Radioligand Lösung inkubiert und die Bindung an das Ziel später lokalisiert ist durch den Nachweis des radioaktiven Zerfalls, z. B. mithilfe von lichtempfindlichen Film oder Phosphor imaging-Platten. Daraus resultierende digitale Autoradiograms zeigen bemerkenswerte räumlichen Auflösung, der Quantifizierung und Lokalisierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen ermöglicht. Darüber hinaus erlaubt die Quantifizierung für die pharmakologische Charakterisierung von Liganden Affinität durch Dissoziation konstanten (K-d), Hemmung konstanten (Kich) sowie die Dichte der Bindungsstellen (Bmax) in ausgewählten Geweben. So bietet die Methode Informationen über Ziel Lokalisierung und Liganden Selektivität. Hier ist die Technik mit autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) Bindungsstellen im Gehirn von Säugetieren Gewebe, mit besonderem Schwerpunkt auf methodische Überlegungen bezüglich der verbindlichen Test beispielhaft dargestellt Parameter, die Wahl der Radioligand und das Nachweisverfahren.

Einleitung

Autoradiographie ist eine Methode, die Bilder des radioaktiven Zerfalls liefert. Die Technik wird routinemäßig eingesetzt, um die Gewebeverteilung eines Proteins des Interesses in Vitro basierend auf eine spezifische pharmakologische Interaktion zwischen einer radioaktiv Verbindung und ihr Ziel zu studieren. Dies bietet direkte Informationen über die Selektivität des Liganden für das Ziel. In-vitro- Autoradiographie kann auch verwendet werden, für die quantitative Bestimmung der pharmakologischen Bindungsparameter von Radioligands, wie z. B. die Dissoziationskonstante (K-d) und die Dichte der Bindungsstellen (Bmax), sowie für die Bestimmung die Hemmung-Konstante (Ki) von konkurrierenden Liganden1,2. Im Vergleich zu traditionellen Homogenat Radioligand Bindung, hat Autoradiographie den Vorteil des Seins in der Lage, räumliche Anatomie zu visualisieren und prägnante Angabe der regionalen Ausdruck Muster3. Die Methode der Autoradiographie ist daher eine entsprechende Alternative zu Immunocytochemistry, insbesondere in der Abwesenheit eines validierten Antikörpers. Autoradiographie ist in einem standard Radioisotop Labor angesichts der Verfügbarkeit von geeigneten Radioligand mit der erforderlichen pharmakologischen Spezifität, Zugriff auf ein Mikrotom Kryostat für die Zubereitung von Gewebeschnitten und eine geeignete Imaging einfach umsetzen. Gerät, das die Verteilung der Radioaktivität in den jeweiligen Gewebeschnitten analysieren kann. Bemerkenswert ist, ist ein wichtiges Auswahlkriterium für die Radioligand eine begrenzte Menge an Bindung an Nichtziel-Seiten. Dies kann an andere Proteine, Membranen oder Materialien wie Kunststoff oder Filter, und ist gemeinsam als unspezifische Bindung bezeichnet. In der Regel kann unspezifische Bindung ist nicht Humanserumproteine aber Humanserumproteine wenn es handelt sich um ein bestimmtes Ziel-Protein. Der beste Weg der Validierung wahre spezifische Bindung ist vergleichbar zu den Geweben fehlt das Ziel, z.B.genetisch (Knock-out) Gewebe4entwickelt.

Hier ist die Methode mit der autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität Bindungsstelle für γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) in das Gehirn von Säugetieren illustriert. Verständnis der pharmakologischen Wechselwirkung zwischen GHB und seine Bindungsstelle ist von Bedeutung, da GHB sowohl ein klinisch nützlich Medikament in der Behandlung von Narkolepsie und Alkoholismus5, sondern auch ein natürlicher Bestandteil der das Gehirn von Säugetieren und ein Erholungs-ist Droge-6. Hohe Affinität GHB Bindungsstellen wurden erstmals über [3H] GHB Bindung an Ratte Gehirn Homogenat7beschrieben. Im Laufe der Jahre weitere Autoradiographie Studien mit [3H] GHB und die analoge [3H] NCS-382 zeigte eine hohe Dichte an Bindungsstellen im Vorderhirn Regionen Ratte8,9,10, Maus9 ,11und Affe/Mensch Gehirn12Schwein. Jedoch blieben die molekulare Identität und genaue funktionelle Relevanz der diese Bindungsstellen schwer fassbaren.

Mit der Absicht, weiter die Bindungsstellen charakterisieren, und Studien über die physiologische Rolle von GHB zu erleichtern, wurden mehrere Radioligands mit verschiedenen Isotopen, ausgestattet mit verschiedenen Affinitäten entwickelt ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA und [125ich] BnOPh GHB)13,14,15,16(rezensiert in17) (Abbildung 1). Die Kombination von selektiven High-Affinity Radioligands und eine sehr hohe Gewebe Dichte der Bindung, die Standorte für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Bilder mit den Phosphor imaging Technik9,11erlaubt haben. Zusammen mit einen Überblick über die praktischen Punkte bei der Einrichtung ein autoradiographischen Experiment und eine Illustration zu Details zu veranschaulichen wird die Diskussion Abschnitt (i) die Wahl des Radionuklids, (Ii) die Wahl der Assay-Bedingungen und (Iii) die Verwendung von Phosphor betonen. Bildplatten versus Röntgenfilm. Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, die wissenschaftlichen, technischen und methodischen Details auf die Autoradiographie Technik zur Verfügung, für die Information über Gewebeverteilung und pharmakologische Analyse von Protein-Targets.

Protokoll

Alle Tier Handhabung wurde nach den Richtlinien von der dänischen Tier Experimente Inspektion durchgeführt.

Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll deckt Gewebe Vorbereitung (d.h.Maus Hirngewebe), die in-vitro- autoradiographischen Assay ausreichend detailliert für den Aufbau der Methode in ein neues Labor, die Exposition gegenüber Phosphor imaging-Platten sowie anschließenden densitometrischen Analyse der Autoradiograms (Abbildung 2) mit dem Ziel der Lokalisierung und Quantifizierung von Radioligand Bindung in unterschiedlichen anatomischen Strukturen. Bei histologischen dagegen ist ein Protokoll für Cresyl violette Färbung enthalten. Darüber hinaus ist die Bestimmung der unspezifischen Bindung mit einer konkurrierenden Liganden in das Protokoll aufgenommen. Für eine detaillierte Beschreibung zur Bestimmung von K-d, Bmax oder Kichsiehe vorherige Veröffentlichung4.

(1) Gewebe Vorbereitung von Kryoschneiden

  1. Einschläfern der Maus durch zervikale Dislokation und sofort das Gehirn mit Schere und Pinzette zu sezieren. Gehen Sie direkt zum nächsten Schritt, um Gewebeschäden zu vermeiden.
  2. Snap-Einfrieren des Gewebes durch Untertauchen in Pulverform Trockeneis, gasförmigen CO2 oder Isopentane. Direkt transfer gefrorene Gewebe nach einem Kryostaten mit Temperatur bis-20 ° C. Alternativ lagern Sie das Gewebe bei-80 ° C bis zur Verarbeitung.
    Hinweis: Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen/Einfrieren um Gewebeschäden zu reduzieren.
  3. Lassen Sie das Gewebe auf-20 ° C in den Kryostaten für 20 min zu akklimatisieren, vor der Weiterverarbeitung um erschütternde Gewebe zu vermeiden.
  4. Decken Sie die Gewebe-Halter mit einbetten Medium außerhalb des Kryostaten ab und platzieren Sie die gefrorenen Gewebeprobe schnell in der gewünschten Richtung zu, während das einbettende Medium noch flüssig ist. Platzieren Sie zum Beispiel das Gehirn der Maus vertikal auf Kleinhirn um rostral koronalen Abschnitte zu erreichen. Transfer des Gewebe-Halters zurück zu den Kryostaten und entlarven einbetten Mittel-und Temperaturen unter-10 ° C zum Härten.
    Hinweis: Fragile Gewebeprobe sollte bei Einbettung Medium innerhalb der Gewebe Formen vor der Montage beschichtet werden.
  5. Position der Gewebe-Inhaber im Mikrotom des Kryostaten. Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes, schräge Abschnitte zu vermeiden.
  6. Schneiden Sie das Gewebe mit der Leitung einer stereotaktischen Atlas18 in Abschnitten der gewünschten Stärke (12 µm empfohlen für [3H] gekennzeichnet Liganden). Sorgfältig zu begradigen Sie und entfalten Sie Abschnitt mit einer Bürste von kleiner Größe zu, wenn nötig und Tauwetter-Mount Abschnitt auf einen Objektträger. Sammeln Sie nacheinander in den Abschnitten aus der Region von Interesse für die gewünschte technische Replikation (z.B. 4 Abschnitte pro Folie).
  7. Die Abschnitte auf den Folien für 1 h an der Luft trocknen vor der weiteren Bearbeitung zu ermöglichen.
    Hinweis: Zugabe von Trockenmittel, Dia Boxen minimiert Feuchtigkeit auf die Gewebeschnitte aufbauen. Alternativprodukt kann hier angehalten werden, durch die Speicherung Abschnitte langfristige in Folie Boxen bei-80 ° C.

2. in-vitro- Autoradiographie

Vorsicht: Radioaktivität. Arbeiten Sie in einem zertifizierten Labor gemäß den örtlichen Bestimmungen. Tragen Sie Schutzkleidung. Gemäß den radioaktiven Zerfall entsorgen oder an ein zertifiziertes Unternehmen auslagern.

  1. Tauen Sie die Abschnitte für mindestens 30 min bei Raumtemperatur (RT). Beschriften Sie die Folien mit experimentellen Bedingungen. Benutzen Sie einen Bleistift, da die Folien in Ethanol während der anschließenden Färbung gebadet werden.
  2. Legen Sie die Folien horizontal in Kunststoffschalen.
    Hinweis: Dias auf einer erhöhten Plattform in Kunststoffschalen Positionierung erleichtert ihre Handhabung.
  3. Pre-incubate bereinigt die Abschnitte auf den Folien in Testpuffer montiert zum Ziel in Frage (GHB Protokoll, 50 mM KHPO4 Puffer pH 6.0 verwendet wird) durch sorgfältige Anwendung eine angemessene Lautstärke auf der Folie (700 µL für Nagetier koronalen Abschnitte 3 und 4).
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt vollständig mit Flüssigkeit bedeckt ist.
    1. Decken Sie die Kunststoff-Schalen mit Deckel zur Vermeidung von Verdampfung und inkubieren Sie vorab bei relevanten Temperatur (für GHB Protokoll Pre incubate für 30 min bei RT) unter ständige sanfte (20 u/min) auf einem Teller Shaker schütteln.
    2. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung ergänzen Sie Testpuffer mit entsprechenden Konzentration von ungekennzeichnete Compound (für GHB Protokoll, 1 mM GHB).
      Hinweis: Vorinkubation möglicherweise nicht erforderlich sein.
  4. Gießen Sie Vorinkubation Flüssigkeit aus jeder Folie und übertragen Sie die Folien an der Plastikschale zurück.
  5. Um Austrocknung zu vermeiden, sofort inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Konzentration von Radioligand in Testpuffer gewünschten Bedingungen (für GHB-Protokoll, 1 nM [3H] HOCPCA für 1 h bei RT) durch Abdecken der Abschnitte komplett mit der Radioligand Lösung (700 µL für Nagetier koronalen Abschnitte 3 und 4).
    1. Inkubieren Sie unter unter ständige sanfte (20 u/min) Schütteln der Kunststoffschalen mit geschlossenem Deckel.
      Hinweis: Die Radioligand Konzentration kann durch zählen ein Aliquot in einem flüssigen Szintillationszähler validiert werden.
  6. Die Inkubation Lösung durch Gießen die Flüssigkeit entfernen und die Folien Folie einbauen möchten Mikroskop zu übertragen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt zu Abschnitt Austrocknung zu vermeiden.
  7. Waschen Sie die Folien. Für die GHB-Protokoll mit eiskalten Testpuffer zweimal für 20 s und dann spülen waschen Sie zweimal durch Eintauchen der Folie Rack in die Schalen gefüllt mit eiskaltem destilliertes Wasser, Salze zu entfernen. Positionieren Sie die Folien vertikal in Racks für mindestens 1 h bei RT Lufttrocknung oder trocknen Sie die Folien für 5 min mit einem Gebläse auf kalten Temperatur einstellen.
    Hinweis: Waschen muss optimiert werden, z.B.umfangreiche waschen kann zur Verringerung der unspezifischen Bindung nützlich sein.
  8. Übertragen Sie die Folien auf einem Fixateur mit Paraformaldehyd (PFA) Pulver für Übernachtung Fixierung mit PFA-Dämpfen bei RT zum Schutz die Integrität des Komplexes Liganden-Ziel.
    Achtung: PFA ist giftig. Positionthe Fixateur in Rauch Haube und Haut/Augenkontakt mit PFA vermeiden.
  9. Übertragen Sie am Folgetag die Folien auf einen Exsikkator Karton mit Silica-Gel für 3 h bei RT, Feuchtigkeit zu beseitigen.

3. Belastung durch Phosphor-Imaging-Platten und Scannen

  1. Legen Sie die Abschnitte in einer Strahlung abgeschirmt bildgebenden Platte Kassette mit dem Gewebe nach oben. Gehören Sie für nachfolgende Quantifizierung von Radioligand Bindung eine [3H] Microscale in jede Kassette. Ordnen Sie die Abschnitte nach dem Zufallsprinzip und setzen Sie in den Abschnitten zum direkten Vergleich in der gleichen Kassette.
  2. Löschen Sie die Tritium-Sensitive Phosphor imaging Platte unmittelbar vor Gebrauch, um angesammelte Signale aus dem Speicher zu entfernen und Hintergrund Signale zu beseitigen. Daher laden Sie die Platte in Phosphor bildgebenden Gerät und setzen Sie es sichtbar/Infrarot Licht entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
  3. Entfernen Sie die Platte aus Phosphor bildgebenden Gerät und legen Sie es sofort auf die Abschnitte in der Kassette. Stellen Sie sicher, dass die Kassette komplett geschlossen ist. Setzen Sie in den Abschnitten, die Phosphor-Bildplatte für 3 Tage bei RT vor Licht geschützt.
  4. Da Licht Signal die Speicherfolie löscht, sorgfältig öffnen der Kassette im Dunkeln und sofort übertragen die Bildplatte in den dunklen Kasten von einem Phosphor Imager oder Phosphor Imager in einem dunklen Raum zu platzieren.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, die räumliche Anordnung der Folien während der Belichtung um einzelne Probe auf das digitale Bild nach Analyse identifizieren zu notieren. Phosphor Bildplatten zeigen daher auch eine Ecke in einem deutlichen Winkel zu senken, um die korrekte Ausrichtung der Platte auf dem digitalen Bild zu identifizieren.
  5. Scannen Sie die Platte mit der höchsten Auflösung möglich, ein digitales Bild zu erhalten.

4. optional: Cresyl violette Färbung der Gewebeschnitte

  1. Bereiten Sie 1 % Cresyl violette Lösung durch Mischen von 5 g Cresyl violett-Acetat in 500 mL entionisiertem Wasser (dH2O) bis (ca. 2 h) aufgelöst. Filtern Sie durch ein Filterpapier mit einem Trichter in eine neue 500 mL Flasche. Stellen Sie ein pH-Wert 3,5-3,8.
  2. Positionieren Sie die Folie Färbung Satz unter Abzug. Bereiten Sie Tabletts mit den folgenden Lösungen in weißen Polypropylen Schalen (mit Ausnahme von Xylol):
    a. 50 % ethanol/50% dH2O
    b. 70 % ethanol/30% dH2O
    c. 100 % ethanol
    d. 100 % ethanol
    e. 100 % dH2O
    f. 1 % Cresyl violett
    g. 0,07 % Essigsäure (250 mL dH2O 175 µL Essigsäure hinzufügen).
    h. 100 % Xylol in grünen lösemittelbeständig Tabletts
    i. 100 % Xylol in grünen lösemittelbeständig Tabletts
  3. Übertragen Sie die Folien auf der Dunstabzugshaube und legen Sie sie in einem Dia-Rack.
  4. Lösen Sie die Lipide durch zunehmende abgestuften Reihe von Ethanol in dH2O durch Eintauchen der Folien für 1 min in 100 % igem Ethanol (Fach a-d auf).
  5. Rehydrieren Sie die Proben, dH2O durch absteigende Konzentrationen von Ethanol (Fach a-d in umgekehrter Reihenfolge, gefolgt von Fach e) durch Eintauchen der Folien für 1 min.
  6. Tauchen Sie die Exemplare in Cresyl violette Lösung für 10 Minuten.
  7. Spülen Sie die Exemplare mit 0,07 % Essigsäure durch Anheben der Folien oben und unten für 4-8 s. Waschen sanft die Folien durch Eintauchen in dH2O für 1 min.
  8. Austrocknen der Proben durch Eintauchen der Folien für 30 s in aufsteigender Konzentration von Ethanol (Fach a-d).
  9. Übertragen Sie die Proben durch zwei Schalen mit 100 % Xylol (Fach h und ich) das Ethanol zu stillen.
  10. Rehydrieren Sie die Proben, dH2O durch absteigende Konzentrationen von Ethanol (Fach a-d in umgekehrter Reihenfolge, gefolgt von Fach e) durch Eintauchen der Folien für 1 min.
  11. Entfernen Sie die Folien aus Kochsalzlösung mit der Pinzette. Tropfen Sie ein paar der organischen Lösungsmittel Montage Medien pro Folie und fügen Sie ein Deckglas 24 x 60 mm nach oben, um Proben zu schützen. Entfernen Sie durch leichtes Drücken auf das Deckglas Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas.
    Hinweis: Halten Sie die verbleibenden Folien in Xylol bei der Montage um Austrocknen zu verhindern.
  12. Trocknen über Nacht die Folien in einer Dampfhaube bei RT
  13. Ein Bild der Probe mit einem Mikroskop und 1,25 X Objektiv zu erhalten.

5. densitometrische Analyse des digitalen Bildes

  1. Messen Sie die relative optische dichten (Stangen) von jedem Kalibrierstandard von [3H] Microscale mit einer Bildanalyse-Software.
    1. Wählen Sie einen Bereich von gleicher Größe für jeden Punkt der [3H] Microscale mithilfe eines Tools für die Erstellung der Region über den Menüpunkt Region Entschlossenheit. Weisen Sie eine Nummer zu jedem ausgewählten Bereich durch Klicken auf Nummer unter dem Menüpunkt Etikett.
    2. OD-Werte für jeden Punkt des Kalibrierstandards zu exportieren, indem Sie auf Datei | E Xport | 2D-Region Bericht. ROD-Werte in eine Tabelle übertragen und durch die Größe des ausgewählten Bereichs zu normalisieren. Führen Sie die lineare Regression um eine Standardkurve für weitere densitometrische Analysen zu erhalten.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Bereiche gekennzeichnet sind, um passende Rute Werte und Muster zu identifizieren.
  2. Quantifizierung der Autoradiograms mit der eigenen imaging-Software durch Auswahl der Region durchführen von Interesse (ROI) verwenden ein Tool zur Erstellung der Region in jedem Abschnitt und Messung der ODs. Wählen Sie aus derselben Region in jedem Abschnitt durch Erstellen einer Vorlage für die Region von Interesse, die kopiert und manuell eingestellt, geringfügige Abweichungen in der Gehirn-Anatomie für jedes Autoradiogram. Identifizieren Sie die Anatomie des ROI durch Vergleich der Autoradiograms mit einem Gehirn-Atlas-18. Wenn mehrere Behandlungen verglichen werden, führen Sie die Analyse blind und randomisiert um einseitige Auswahl des ROIs zu vermeiden.
  3. Exportieren ROD Werte und Größen der ausgewählten Bereiche in einer Tabelle durch Klicken auf Datei | E Xport | 2D-Region Bericht.
  4. Teilen Sie die gemessene Rute des ausgewählten ROI durch seine Fläche um die Dichte pro bestimmte Fläche zu erhalten.
  5. Den Stab des Hintergrunds der Platte zu messen und entsprechende ROD Werte und Flächengröße in eine Tabellenkalkulation exportieren. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hintergrundsignal aus jeder Stab Wert jedes ROI.
  6. Durchschnitt der Stäbe der technischen Wiederholungen, d.h., Abschnitt repliziert mit Gewebe vom selben Tier.
  7. Verwenden die Standardkurve Stäbe in Einheiten von Radioligand Bindung, d.h.umwandeln., nCi/mg Gewebe Äquivalente (TE).
    Hinweis: Der Begriff TE wird verwendet, da Normen mit Materialien simulieren Gewebe erzeugt werden.
  8. Drücken Sie Bindung durch Umwandlung des nCi/mg und Nmol/mg TE entsprechend der spezifischen Aktivität von Radioligand (Gleichung 1).
    figure-protocol-14321(1)
  9. Um bestimmte verbindliche Werte zu erhalten, subtrahieren Sie unspezifischen Bindung aus insgesamt Bindung.
  10. Durchschnittliche repliziert die Bindung von jedem biologischen replizieren mithilfe des Durchschnitts der technischen jedes Tieres (erhältlich im Schritt 5.6).

Ergebnisse

Mit der beschriebenen Protokoll, die anatomische Verteilung der hohen Affinität GHB verbindliche Aufstellungsorte wurde visualisiert mit radioaktiv GHB analog [3H] HOCPCA im Gehirn der Maus, die in koronalen, sagittalen und horizontalen Abschnitte (Abbildung 3 geschnitten wurde ). Hohes Maß an Bindung im Hippocampus und Cortex beobachtet wurden, geringere Bindung im Striatum und keine Bindung war im Kleinhirn, entspricht früheren gemeldeten Expr...

Diskussion

Die Qualität einer autoradiographischen Assay wird am häufigsten durch die Empfindlichkeit der Radioligand bestimmt. Ein wichtiger Faktor ist die ausgewählte Radioisotop, die durch die Verfügbarkeit von bekannten Liganden oder durch die Machbarkeit von spezifischen Kennzeichnung Techniken Liganden mit entsprechenden spezifischen Aktivität (d. h., die Menge an Radioaktivität Ausbeute gegeben ist pro Einheit Mol ein Radioligand)23und mit begrenzten Mengen an chemischen Abbau. Eine gro...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Arbeit wurde von Lundbeck Stiftung (Grant R133-A12270) und der Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Aleš Marek für die Lieferung von [3H] Radioligand.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore107017
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mLSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus slidesVWR631-9483microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura Finetek Denmark ApS4451
Tritium Standard on GlasAmerican Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
Xylene substituteSigma-AldrichA5597

Referenzen

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. . Handbook of Radioactivity Analysis. , 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. . Receptor Binding Techniques. 897, (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. . Receptor-ligand interactions: a practical approach. , (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -. T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

NeurowissenschaftenAusgabe 145RadioligandradioaktivAutoradiographieAffinit tAusdruckPhosphor BildgebungHOCPCAHydroxybutyric S ureGHBNCS 382quantitative Pharmakologie

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten