Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Autoradiography yöntemi radioligands doku bölümlerine bağlama nitel veya nicel Farmakoloji belirlenmesi için incelemek için düzenli olarak kullanılır.

Özet

Vitro autoradiography deneysel hayvan hem de insan dokudan ilgi bir proteinin anatomik dağılımını görselleştirmenizi amaçlamaktadır. Bu yöntem bir radioligand biyolojik hedefine için belirli bağlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, donmuş doku bölümleri radioligand çözüm ile inkübe ve bağlama hedef için daha sonra radyoaktif bozunma, algılama tarafından Örneğin, ışığa duyarlı film ya da fosfor plakaları Imaging kullanarak yerelleştirilmiştir. Elde edilen dijital autoradiograms miktar ve yerelleştirme radioligand bağlama farklı anatomik yapılar sağlar olağanüstü Uzaysal çözünürlük görüntüler. Ayrıca, miktar ligand afinite farmakolojik karakterizasyonu için ayrılma sabitleri (Kd), inhibisyon sabitleri (Kben) yanı sıra bağlayıcı siteleri (Bmax) seçili dokularda yoğunluğu aracılığıyla izin verir. Böylece, belgili tanımlık yöntem hedef Yerelleştirme ve ligand seçicilik hakkında bilgi sağlar. Burada, teknik autoradiographic karakterizasyonu siteleri bağlama tahlil ile ilgili metodolojik konuları üzerinde durularak memeli beyin dokusu içinde bağlama yüksek afinite γ-hidroksibütrik asit (GHB) örneği Parametreler, radioligand ve algılama yöntemi seçimi.

Giriş

Autoradiography radyoaktif bozunma görüntüleri sağlayan bir yöntemdir. Tekniği rutin bir protein radiolabelled bir bileşik ve hedefine arasında belirli bir farmakolojik etkileşim temel faiz vitro doku dağılımı incelemek için kullanılır. Bu hedef için ligand selectivity hakkında doğrudan bilgi sağlar. Vitro autoradiography de radioligands, bağlayıcı siteleri (Bmax), yoğunluğu ve ayrışma sabiti (Kd) gibi parametrelerin farmakolojik bağlama kantitatif tayin yanı sıra belirlemek için kullanılabilir rakip ligandlar1,2inhibisyon sabiti (Ki). Geleneksel homogenate radioligand bağlama için karşılaştırıldığında, autoradiography kayma anatomi görselleştirmek için güçlü olmak ve bölgesel ifade kalıpları3özlü ayrıntılarını veren avantajına sahiptir. Autoradiography yöntemi bu nedenle özellikle doğrulanmış bir antikor yokluğunda immunocytochemistry ilgili bir alternatiftir. Autoradiography kolayca uygun bir radioligand durumu ile gerekli farmakolojik özgüllüğü, doku bölümleri ve uygun bir görüntüleme hazırlanması için bir microtome cryostat erişim verilen bir standart Radyoizotop laboratuvar uygulanır radyoaktivite kendi doku bölümlerde dağıtım analiz yapabiliyor aygıt. Özellikle, bir önemli seçim radioligand için sınırlı bağlama hedef olmayan sitelere bir kriterdir. Bu diğer proteinler, membran veya plastik veya filtreler gibi maddeler olabilir ve toplu non-spesifik bağlama olarak anılacaktır. Genellikle, non-spesifik bağlama saturable olmayan ama belirli bir hedef kapalı protein içeriyorsa saturable olabilir. Doğru belirli bağlama doğrulama için en iyi yolu (knock-out) doku4hedef örneğin, genetik olarak eksik dokuların karşılaştırmak için tasarlanmış olduğunu.

Burada, metodoloji γ-hidroksibütrik asit (GHB) memeli beyinde yüksek afinite bağlama sitesine autoradiographic karakterizasyonu gösterilmektedir. GHB hem klinik olarak yararlı bir ilaç tedavisi Narkolepsi ve alkolizm5, aynı zamanda doğal bir kurucu memeli beyin ve bir eğlence olduğu gibi farmakolojik etkileşim GHB ve bağlama sitesi arasında alaka en önemli noktadır uyuşturucu6. Yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri ilk [3H] GHB bağlama sıçan beyin homogenate7kullanarak açıklanan. Yıllar içinde autoradiography çalışmaları [3H] ile daha fazla GHB ve analog [3H] NCS-382 siteler fare8,9,10, fare9 ön bölgelerinde bağlama yüksek yoğunluklu gösterdi ,11ve maymun/insan beyin12domuz. Ancak, bu bağlama sitelerin tam işlevsel alaka ve moleküler kimlik zor kalmıştır.

Daha fazla bağlayıcı siteleri niteleyen ve GHB fizyolojik rolü üzerinde çalışmalar kolaylaştırmak için niyeti ile birden çok radioligands farklı benzeşim ile donatılmış farklı izotoplar birleşmeyle geliştirilmiştir ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA ve [125ben] BnOPh-GHB)13,14,15,16(17' gözden) (şekil 1). Siteleri görüntüleme tekniği9,11fosfor kullanarak yüksek kaliteli görüntüleri üretimi için izin bağlama çok yüksek doku yoğunluğu ve seçmeli yüksek benzeşme radioligands birleşimi. Autoradiographic deney ve bir örnek ayrıntıları örneklemek için ayarlama içinde pratik noktaları bir taslağını ile birlikte, i) radyonüklid seçimi, ii) tahlil koşullar seçimi ve III) fosfor kullanımı tartışma bölümünde vurgulamak olacaktır Röntgen film karşı plakaları görüntüleme. Bu yazıda genel amacı autoradiography tekniğine doku dağıtım ve protein hedeflerin farmakolojik analizleri hakkında bilgilendirmek için teknik, metodolojik, bilimsel bilgileri sağlamaktır.

Protokol

Tüm hayvan işleme Danimarka hayvan deney Müfettişliği yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

Not: Burada açıklanan protokol doku hazırlık (Yani, fare beyin dokusu), vitro autoradiographic tahlil kurma yöntemi yeni bir laboratuvarda, tabak Imaging fosfor maruz için yeterli ayrıntılı kapsar yanı sıra autoradiograms (Şekil 2) sonraki densitometric analizi Yerelleştirme ve farklı anatomik yapıları bağlamasında radioligand miktarının amacı ile. Histolojik karşılaştırma için Kresil Menekşe boyama için bir protokol dahil edilir. Ayrıca, non-spesifik bağlama rakip bir ligand ile belirlenmesi protokolde yer alır. Kd, Bmax veya Kbenbelirleme hakkında ayrıntılı bir açıklama için bkz: önceki yayın4.

1. doku hazırlık Cryosectioning tarafından

  1. Fare tarafından servikal çıkığı ötenazi ve hemen makas ve forseps kullanarak beyin incelemek. Doğrudan doku hasarı önlemek için bir sonraki adıma geçin.
  2. Ek-doku batma tarafından toz kuru buz, gaz halinde olan yakıtlar CO2 veya isopentane donma. Doğrudan transfer donmuş doku bir cryostat ile sıcaklığı-20 ° c için ayarla Alternatif olarak,-80 ° C'de doku işleme kadar saklayın.
    Not: tekrarlanan çözdürme/doku hasarı azaltmak için dondurma kaçının.
  3. Doku doku yıkıcı önlemek için daha fazla alay önce 20 min cryostat-20 ° C'de alışmana izin.
  4. Cryostat dışında gömme orta ile doku tutucu kapak ve gömme orta hala sıvı ise hızlı bir şekilde istenen yönde donmuş doku örneği yerleştirin. Örneğin, dikey olarak beyincik üzerine fare beyin rostral koronal bölümler elde etmek için koyun. Geri cryostat için doku tutucu aktarmak ve sıcaklığa aşağıdaki gömme orta-10 ° C sertleştirme için maruz.
    Not: Kırılgan doku örneği orta montaj önce doku kalıpları içinde katıştırma kaplı olması.
  5. Doku tutucu cryostat microtome içinde konumlandırın. Eğimli bölümlerde önlemek için doku yönünü ayarlayın.
  6. İstediğiniz kalınlıkta bölümlerini stereotaksik atlas18 rehberliğinde doku kesmek (12 µm [3için H] tavsiye ligandlar etiketli). Dikkatli bir şekilde düzeltmek ve küçük boyutlu bir fırçayla bölümünü gerekirse açılmak ve tezcan-bölüm bir mikroskop slayt üzerine monte. Ardışık olarak istenen teknik çoğaltma (örneğin, slayt başına 4 bölüm) için ilgi bölgesinden bölümleri toplamak.
  7. 1 h için daha fazla tutmadan önce kurumasını slaytlardaki bölümler de olanak sağlar.
    Not: Ek slayt kutularına nem alıcı malzemenin doku bölümlerinde nem inşa en aza indirir. Alınırken burada-80 ° C'de slayt kutularındaki bölümleri uzun vadeli depolayarak duraklatılmış

2. vitro Autoradiography

Dikkat: radyoaktivite. Yerel düzenlemelere göre sertifikalı bir laboratuarda çalışmak. Koruyucu giysi giyin. Radyoaktif bozunma uygun olarak imha etme veya sertifikalı bir şirkete dış kaynak.

  1. Bölümler için en az 30 dk (RT) oda sıcaklığında erimek. Slaytlar deneysel koşullar ile etiketleyin. Slaytları etanol sonraki boyama sırasında banyo çünkü bir kalem kullanın.
  2. Slaytları yatay olarak plastik tepsilerde yerleştirin.
    Not: slaytlar plastik tepsi içinde yükseltilmiş platformda konumlandırma kullandıklarında daha kolaylaştırır.
  3. (GHB protokolü, 50 mM KHPO4 tampon pH 6.0 kullanılan için) önceden incubate tahlil arabellek slaytları monte bölümleri hedef söz konusu dikkatle slayt (3-4 kemirgen koronal bölümleri için 700 µL) uygun bir birimi uygulayarak ayarlanabilir.
    Not: her bölüm tamamen sıvı ile kaplıdır emin olun.
    1. Plastik tepsi buharlaşma önlemek ve sürekli hafif (20 devir/dakika) bir tabak shaker sallayarak altında (GHB protokolü için RT, 30 dk önceden incubate için) ilgili sıcaklığında önceden kuluçkaya için bir kapak ile kapak.
    2. Non-spesifik bağlama belirlenmesi için tahlil arabellek etiketsiz bileşik (için GHB protokolü, 1 mM GHB) ilgili konsantrasyonu ile ek.
      Not: Ön kuluçka gerekli olmayabilir.
  4. Her slayt sıvıdan ön kuluçka kapalı dökün ve slaytları plastik tepsiyi aktarın.
  5. Kurutma önlemek için hemen radioligand tahlil arabelleği istenen koşullar altında ilgili konsantrasyonu bölümlerle kuluçkaya (GHB protokolü, 1 nM [3H] HOCPCA RT, 1 h için) radioligand tamamen bölümlerle kapsayan tarafından çözüm (3-4 kemirgen koronal bölümleri için 700 µL).
    1. Altında kapalı Kapaklı plastik tepsilerinin sürekli hafif (20 devir/dakika) sallayarak altında kuluçkaya.
      Not: Bir aliquot bir sıvı mercek Counter sayarak radioligand konsantrasyon doğrulanabilir.
  6. Ve slaytlar mikroskop slayt raf transfer kuluçka çözüm sıvı dökerek çıkarın. Hemen bölüm kurutma önlemek için sonraki adıma geçin.
  7. Slaytları yıkayın. GHB iletişim kuralı için buz gibi tahlil arabellek 20 s ve sonra durulama için iki kez iki kez slayt raf tuzları kaldırmak için buz gibi soğuk distile su kanalları içine daldırma tarafından yıkayın. Slaytları dikey olarak en az 1 h RT için air-drying için raflar yerleştirin veya kuru bir üfleyici ile 5 min için slaytlar için soğuk sıcaklık ayarlayın.
    Not: Çamaşır optimize edilmiş olması gerekir, örneğin, geniş çamaşır non-spesifik bağlama azaltmak için yararlı olabilir.
  8. Slaytları ligand-hedef karmaşık bütünlüğünü korumak için paraformaldehyde (PFA) toz ile İngiltere'de yılın buharları RT adlı gecede fiksasyon için içeren bir fiksatör aktarın.
    Dikkat: PFA zehirlidir. Positionthe fiksatör hood duman ve İngiltere'de yılın cilt/göz temasından kaçının.
  9. Ertesi gün, slaytları RT nem ortadan kaldırmak için 3 h için silika jel içeren bir desiccator kutusu aktarın.

3. fosfor görüntüleme plakaları ve tarama maruz

  1. Bölümleri görüntüleme plaka radyasyon korumalı kaset içinde bir doku yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. İçin sonraki miktar radioligand bağlama [3H] microscale her kasete içerir. Rasgele bölümleri düzenlemek ve doğrudan karşılaştırma aynı kaset için bölümleri bulaşmasına neden.
  2. Birikmiş sinyalleri deposundan kaldırmak için plaka kullanımdan hemen önce Imaging trityum duyarlı fosfor silmek ve arka plan ortadan kaldırmak için sinyal gönderir. Bu nedenle, plaka fosfor görüntüleme makineye yüklemek ve görünür/kızılötesi üreticinin yönergelerine göre ışık için maruz kalmaktadır.
  3. Fosfor görüntüleme plaka çıkarın ve hemen kaset bölümlerde üzerine yerleştirin. Kaset tamamen kapalı olduğundan emin olun. Fosfor görüntüleme plaka bölümlerine gelen ışık korumalı RT 3 gün için ortaya çıkarmak.
  4. Işık sinyal görüntüleme plaka siler çünkü dikkatle kaset karanlıkta açın ve hemen görüntüleme plaka fosfor Imager koyu kutu aktarmak veya fosfor Imager karanlık bir odaya yerleştirin.
    Not: dijital görüntü üzerinde bireysel numune analiz sonra tanımlamak için mekansal düzenleme slaytları pozlama sırasında notate emin olun. Bu nedenle, fosfor görüntüleme tabaklar da bir köşe amacıyla dijital resim tabağa doğru yönünü belirlemek için farklı bir açı kesmek görüntüleyin.
  5. Plaka dijital bir görüntü elde etmek olası en yüksek çözünürlükte tarama.

4. isteğe bağlı: Kresil doku bölümlerini Menekşe boyama

  1. Kresil Menekşe asetat 500 mL deiyonize su (dH2O) içinde 5 g karıştırılarak % 1 Kresil Menekşe çözüm hazırlamak (yaklaşık 2 h) eriyene kadar. Bir huni yeni bir 500 mL şişe kullanarak bir filtre kağıdı ile filtre. PH 3.5-3,8 için ayarlayın.
  2. Duman başlık altında slayt boyama konumunu belirleyin. Tepsiler beyaz Polipropilen tepsiler (Ksilen dışında) aşağıdaki çözümleri ile hazırlayın:
    a. %50 ethanol/50% dH2O
    b. %70 ethanol/30% dH2O
    c. %100 etanol
    ö. %100 etanol
    e. %100 dH2O
    f. %1 Kresil Menekşe
    g. %0,07 Asetik asit (dH2O için 250 mL asetik asitin 175 µL ekleyin).
    h. %100 Ksilen yeşil solvent dayanıklı kasetlerine
    Ben %100 Ksilen yeşil solvent dayanıklı kasetlerine
  3. Duman başlık slaytları aktarmak ve bir slayt rafa koyun.
  4. Lipidler dH2O etanol artan kademeli dizi 1 dk slaytlarını daldırma tarafından % 100 etanol (tepsi a-d) geçiyoruz.
  5. Numuneler için 1 dk slaytlarını daldırma tarafından etanol (tepsi a-d tepsi e tarafından takip ters sırada) konsantrasyonları azalan aracılığıyla dH2O suyla temasa.
  6. Numunelerin Kresil Menekşe çözüm için 10 dk içinde bırakın.
  7. Örnek slaytlar dH2O için 1 dk içinde daldırma tarafından yukarı ve aşağı slayt 4-8 s. yıkama için hafifçe kaldırarak % 0.07 Asetik asit durulayın.
  8. 30 slaytlarını daldırma tarafından numuneler kurutmak etanol (tepsi a-d) konsantrasyonları artan s.
  9. Numunelerin % 100 Ksilen (tepsi h ve ben) etanol gidermek için sahip iki kanalları aracılığıyla aktarın.
  10. Numuneler için 1 dk slaytlarını daldırma tarafından etanol (tepsi a-d tepsi e tarafından takip ters sırada) konsantrasyonları azalan aracılığıyla dH2O suyla temasa.
  11. Slaytları Forseps ile serum kaldırın. Organik çözücü slayt başına ortam takma birkaç damla ekleyin ve bir 24 x 60 mm coverslip numuneler korumak için üstüne ekleyin. Hava kabarcıkları numune ve coverslip arasında yavaşça coverslip basarak kaldırın.
    Not: kalan slaytlar kurutma önlemek için montaj sırasında Ksilen içinde tutun.
  12. Slaytları bir duman başlıklı RT., Kuru gecede
  13. Örnek bir resmini elde etmek mikroskop ve 1,25 X amacı ile.

5. densitometric dijital görüntü analizi

  1. Her kalibrasyon standart [3H] microscale bir görüntü analiz yazılımı ile gelen göreli optik yoğunlukları (çubuklar) ölçmek.
    1. Menü öğesi Bölge belirlenmesiiçin Bölge oluşturma aracıyla [3H] microscale her noktası için eşit büyüklükte bir alan seçin. Bir sayı sayı üzerine Etiketmenü öðesi altýnda tıklayarak seçili her alanına atamak.
    2. Tıklatarak her nokta kalibrasyon standart OD değerleri verme dosya | E Dışa Aktar | 2D bölge raporu. ÇUBUK değerleri bir e-tabloya aktarmak ve seçili alanın büyüklüğüne göre normalize. Daha fazla densitometric çözümleme için standart bir eğri elde etmek için doğrusal regresyon gerçekleştirmek.
      Not: Seçilen alanları eşleşen ROD değerleri ve örnekleri belirlemek için etiketli emin olun.
  2. Özel bölge seçerek görüntüleme yazılımı kullanarak autoradiograms miktar gerçekleştirmek her bölümünde bir Bölge oluşturma aracını kullanarak ve onun ODs ölçme faiz (ROI). Aynı bölge için bölge ilgi hangi bol ve el ile beyin anatomisi her autoradiogram için küçük değişimler için ayarlanmış bir şablon oluşturarak her bölümünde seçin. ROI anatomisi ile bir beyin atlas18autoradiograms kıyasla tanımlayın. Birden çok tedavileri karşılaştırıldığında, kör ve önyargılı ROIs yelpazesi önlemek için randomize çözümlemesi gerçekleştirin.
  3. ÇUBUK değerlerini ve boyutlarını Seçilen alanların tıklatarak bir elektronik tabloya verme dosya | E Dışa Aktar | 2D bölge raporu.
  4. Belirli alan başına yoğunluğu elde etmek için seçilen Roi onun alanına göre ölçülen ROD bölün.
  5. Arka plaka çubuk ölçmek ve ilgili ROD değerleri ve alan boyutu bir elektronik tabloya dışa aktarın. Her yatırım Getirisi her çubuk değerinden ortalama arka plan sinyal çıkarma.
  6. Ortalama teknik çoğaltır, Yani, Bölüm başlıkları aynı hayvan dokudan kullanarak çoğaltır.
  7. Çubuklar radioligand bağlama, i.ebirimlerine dönüştürmek için standart eğri kullanın., ncı/mg doku eşdeğerleri (TE).
    Not: standartları doku simüle malzemelerle üretilen çünkü terim TE kullanılır.
  8. Bağlama nmol/mg TE ncı/mg dönüşüm tarafından radioligand (Denklem 1) özel faaliyetin göre hızlı.
    figure-protocol-12210(1)
  9. Belirli bağlama değerleri elde etmek için non-spesifik bağlama toplam bağlama çıkarma.
  10. Ortalama ortalama teknik kullanarak her biyolojik REPLICATE bağlama (Adım 5.6 elde edilen) her hayvan çoğaltır.

Sonuçlar

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, yüksek-benzeşme GHB bağlayıcı siteleri anatomik dağıtımını radiolabelled GHB analog [3H] ile görüntülenmiştir koronal, sagittal ve yatay bölüme (şekil 3 kesildi fare beynindeki HOCPCA ). Yüksek yüzey-in bağlama Hipokampus ve korteks gözlendi, alt striatum bağlamasında ve hiçbir bağlama beyincik içinde yüksek-benzeşme GHB siteleri9,

Tartışmalar

Autoradiographic bir tahlil kalitesini en sık radioligand duyarlılık tarafından belirlenir. Bilinen ligandlar kullanılabilirliğini veya özel etiketleme teknikler fizibilite ligandlar uygun belirli aktivite ile (Yani, radyoaktivite miktarı verim verilir seçili Radyoizotop önemli bir faktör olduğunu bir radioligand birimi mol) başına23ve sınırlı miktarda kimyasal bozulması. Çok sayıda bilinen ligandlar radioligands hangi çeşitli yararları infers trityum

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

İş Lundbeck Vakfı (Grant R133-A12270) ve Novo Nordisk Vakfı (Grant NNF0C0028664) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Aleš Marek [3H] radioligand temini için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore107017
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mLSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus slidesVWR631-9483microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura Finetek Denmark ApS4451
Tritium Standard on GlasAmerican Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
Xylene substituteSigma-AldrichA5597

Referanslar

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. . Handbook of Radioactivity Analysis. , 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. . Receptor Binding Techniques. 897, (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. . Receptor-ligand interactions: a practical approach. , (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -. T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 145Radioligandradyoaktifautoradiographybenze meifadefosfor g r nt lemeHOCPCAhidroksib trik asitGHBNCS 382nicel Farmakoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır