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要約

オートラジオグラフィー法は質的または量的薬理学による組織切片にイメージングに関する基礎的バインディングを研究する使用します。

要約

体外放射線写真法は、実験動物として人間から組織の興味の蛋白質の解剖学的分布を可視化を目指しています。メソッドは、その生物学的対象放射性リガンドの特定の結合に基づいています。したがって、凍結するティッシュ セクションはリガンド溶液で培養した、ターゲットへのバインドはその後ローカライズ放射性崩壊の検出によってたとえば、感光性フィルムまたは蛍光イメージング プレートを使用しています。結果として得られるデジタル autoradiograms は、定量化と明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の局在化を可能にする顕著な空間分解能を表示します。また、定量化できます親和性リガンドの薬理学的解析による結合部位 (B最大) 選択した組織の密度と同様、酸解離定数 (Kd)、阻害定数 (K私)。したがって、メソッドは、ターゲットの局在と性についての情報を提供します。高親和性 γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 結合の試金に関する方法論的考察に特別な重点を置いて、哺乳類の脳組織内のサイトを結合のオートラジオ グラフの特性と技術を例示するここでは、パラメーター、リガンドと検出方法の選択。

概要

放射線は、放射性崩壊の画像を提供する方法です。テクニックは、日常的に関心体外に基づく放射性標識化合物とそのターゲットの特定の薬理学的相互作用の蛋白質の組織分布を調査する使用されます。これは、ターゲットのリガンドの選択性について直接的な情報を提供します。体外放射線写真法は、決定するだけでなく、解離定数 (Kd) などの結合部位 (B最大)、密度イメージングに関する基礎的薬理学的バインディング パラメーターの定量のためにまた使用されるかもしれません競合するリガンド1,2の阻害定数 (Ki) です。オートラジオグラフィーによる伝統的な磨砕液放射性リガンド結合と比較して、空間の解剖学を視覚化することができるという、地域性の表現パターン3の簡潔な詳細を与えることの利点があります。したがって、放射線写真法のメソッドは検証された抗体の有無を中心に、各種の関連する代替です。ミクロトーム クライオスタット切片、および適切なイメージングを準備するために、必要な薬理学的特異性と適切なリガンドの可用性を与えられる標準的なラジオ アイソトープ実験室の放射線写真法を簡単に実装します。それぞれティッシュ セクションの放射能の分布を分析することができるデバイス。特に、リガンドの重要な選択基準は、非ターゲット サイトへのバインドの限られた量です。これは他の蛋白質、膜やプラスチックやフィルターなどの材料にすることができ、総称して非固有のバインドと呼びます。通常非特異的結合非飽和ですが特定のオフのターゲット蛋白質を含む場合は飽和することができます。True 特定のバインドを検証する最良の方法は、組織の遺伝子、例えばターゲットを欠けていると比較する設計 (ノックアウト) 組織4です。

ここでは、方法論は、γ-ヒドロキシ酪酸 (GHB) 哺乳類の脳の高親和性結合部位のオートラジオ グラフの特性で示されています。GHB は両方臨床的に有用な薬剤アルコール依存症5ナルコレプシーの治療だけでなく、哺乳類の脳とレクリエーションの天然成分で、関連性は GHB とその結合部位の薬理学的相互作用を理解すること薬6。高親和性 GHB 結合部位は、ラット脳ホモジネート7[3H] GHB のバインディングを使用して記述されていた最初。年間、[3H] を用いたオートラジオグラフィーによる研究をさらに GHB とアナログ [3H] NCS 382 結合ラット8,9,10, マウスの9の領域を脳の部位の高密度を示しました、11、猿と人間の脳の12の豚。ただし、分子のアイデンティティおよびこれらの結合部位の機能的関連性正確なは、とらえどころのない残っています。

異なる親和性に恵まれている異なる同位体を組み込んだ複数イメージングに関する基礎的、さらに結合部位を特徴付けると生理的ガンマヒドロキシ酪酸の役割に関する研究を容易にする意図で開発されている ([3H] GHB、[3H] NCS-382、[3H] HOCPCA および [125私] BnOPh GHB)13,14,15,16(文献17) (図 1)。選択的な高親和性イメージングに関する基礎的およびイメージング技術9,11蛍光体を用いた高品質画像の生産のためのサイトが認められているバインディングの非常に高い組織密度の組み合わせ。オートラジオグラフィーによる実験とイラストの設定詳細を実証するための実践的なポイントの概要、と一緒にディスカッション セクション i) 放射性核種の選択、ii) アッセイ条件の選択および iii) 蛍光体の使用を強調します。対 x 線フィルム イメージング プレート。本稿の全体的な目標は、組織分布と標的タンパク質の薬理学的解析について知らせるためオートラジオグラフィー技術に関する技術、方法論的、科学的な詳細を提供することです。

プロトコル

デンマーク動物実験の検査官からのガイドラインに準拠したすべての動物取扱を行った。

注: ここで説明したプロトコルをカバー ティッシュの準備 (すなわちマウス脳組織)、新しいラボ内のメソッド、蛍光イメージング プレートへの露出を設定するための十分な詳細で体外オートラジオグラフィーによるアッセイと同様その後デンシトメトリー分析 autoradiograms (図 2) のローカライズおよび明確な解剖学的構造の放射性リガンドの結合の定量化を目的と。病理組織学的比較クレシル バイオレットの汚損のためのプロトコルが含まれます。また、競合するリガンド非特異的結合の決定はプロトコルの中で含まれています。B最大Kdまたは K は私を確認する方法の詳細については、前の文書4を参照してください。

1. 組織作製セクショニング

  1. 頚部転位によってマウスを安楽死させるし、すぐにハサミ、鉗子を使用して脳を解剖します。直接組織の損傷を避けるために次の手順に進みます。
  2. スナップ-凍結組織による粉末ドライアイス、ガスの CO2イソペンタン。クライオスタットに-20 ° C 設定温度、凍結するティッシュを直接転送します。また、処理まで-80 ° C で組織を格納します。
    注: 組織の損傷を減らすために繰り返し融解/冷凍は避けて下さい。
  3. 組織を粉砕しないように処理をさらに-20 ° C 20 分用クライオスタットに慣らして組織ができます。
  4. クリオスタット外埋め込み中ティッシュ ホルダーをカバーし、すばやく希望する方向で埋め込む媒体はまだ液体凍結組織標本を配置します。例えば、吻側のコロナ セクションを達成するために小脳の上に垂直方向にマウスの脳を配置します。ティッシュ ホルダーをクリオスタットに転送し、硬化の-10 ° C の温度下に埋め込む媒体を公開します。
    注: 壊れやすい組織標本は、取り付ける前に組織金型内でメディアを埋め込みでコーティングする必要があります。
  5. クリオスタット ミクロトームのティッシュ ホルダーを配置します。傾斜セクションを避けるために組織の方向を調整します。
  6. 所望の厚さのセクションで定位アトラス18の指導と組織をカット (12 μ m [3H] の推奨配位子のラベル)。慎重にまっすぐと必要であれば小さいサイズのブラシでセクションを展開、雪解け-マウント顕微鏡スライド上にセクション。技術的なレプリケーションの目的 (例えば、4 セクションごとにスライド) 興味の地域からセクションを順番に収集します。
  7. 処理する前に 1 時間風乾するスライド上のセクションを許可します。
    注: スライド ボックスに乾燥剤の物質の添加は, 切片中の水分蓄積を最小限に抑えます。プロトコルは-80 ° C でスライド ボックスで長期のセクションを格納することによってここで一時停止できます。

2体外放射線写真法。

注意: 放射能。現地の規則に従って認定研究室で作業します。防護服を着用します。産業廃棄物放射性崩壊または認定会社に委託します。

  1. 部屋の温度 (RT) で少なくとも 30 分のセクションを解凍します。実験条件とスライドのラベルを付けます。鉛筆は使用スライド エタノールその後染色中に浴びることに。
  2. プラスチック トレーのスライドを水平方向に配置します。
    注: プラスチック トレー内高架のプラットフォームにスライドを配置の取り扱いが容易になります。
  3. 事前 incubate アッセイバッファーでスライドに取付けたセクション用に調整問題のターゲットに (GHB プロトコル、50 mM KHPO4バッファー pH 6.0 を使用すると) (3-4 齧歯動物のコロナ セクションの 700 μ L) のスライドに適切なボリュームを慎重に適用することによって。
    注: すべてのセクションが液体で完全に覆われていることを確認します。
    1. 蒸発を避けるために、事前プレート シェーカーで振って一定の穏やかな (20 rpm) の下 (常温 30 分事前 incubate GHB のプロトコル) の関連する温孵化するためにふた付きプラスチック トレーをカバーします。
    2. 非特異的結合の決定 (GHB プロトコル、1 mM GHB) のラベルのない化合物の濃度が関連するアッセイバッファーを補足します。
      注: 前培養は必要ない場合があります。
  4. 各スライドの前培養液を注ぐし、スライドをプラスチック製のトレイに転送します。
  5. 脱水症状を避けるためには、すぐにアッセイバッファー目的条件下で放射性リガンドの濃度の関連するセクションを孵化させなさい (GHB プロトコル、1 nM [3H] 常温 1 時間 HOCPCA) リガンドと完全にセクションをカバーでソリューション (3-4 齧歯動物のコロナ セクションの 700 μ L)。
    1. 穏やかな定数 (20 rpm) 揺れ閉じた蓋付きプラスチック トレーの下の下でインキュベートします。
      注: 放射性リガンド濃度は液体シンチレーション カウンターの因数を数えることで検証できます。
  6. 液体を注ぐことによって孵化ソリューションを取り外し、顕微鏡スライド ラックにスライド。すぐにセクション脱水症状を避けるために次のステップに進みます。
  7. スライドを洗います。GHB プロトコルの塩を削除する冷たい蒸留水を満たしたトレイにスライド ラックを浸すことによって二度 20 の s と、すすぎの 2 回冷たいアッセイバッファーで洗浄します。RT で少なくとも 1 時間常温乾燥用ラックに垂直にスライドを配置または乾燥送風機で 5 分用のスライドを低温に設定します。
    注: 洗濯を最適化する必要があります、例えば、広範な洗浄は、非特異的結合を減少させるため役に立つかもしれません。
  8. スライドをターゲット リガンド複合体の整合性を保護するために RT で PFA 蒸気で一晩固定用パラホルムアルデヒド (PFA) 粉末を含む創固定器に転送します。
    注意: PFA は有毒です。ポジションを創固定器ドラフトチャンバーし、PFA と皮膚/眼との接触を避けます。
  9. 次の日は、スライドを含む水分を除去するために RT で 3 h 用シリカゲル デシケータ ボックスに転送します。

3. 蛍光イメージング プレートとスキャンへの暴露

  1. 放射線シールド イメージング プレート カセット上を向いてティッシュでセクションに配置します。放射性リガンドの結合の後の定量化, すべてのカセットに [3H] マイクロを含めます。セクションをランダムに配置し、同じカセットに直接の比較のためのセクションを公開します。
  2. 蓄積された信号をストレージから削除するために、バック グラウンド信号を除去するために使用の直前にプレートをイメージング トリチウム敏感な蛍光体を消去します。したがって、蛍光イメージング マシンにプレートを読み込み、可視光・赤外光の製造元の指示に従ってを公開します。
  3. 蛍光イメージング マシンからプレートを削除し、すぐにカセットの各セクションに配置します。カセットが完全に閉じていることを確認します。光からシールド RT で 3 日間の蛍光イメージング プレートにセクションを公開します。
  4. 光イメージング プレートからの信号を消去、ので慎重に暗闇の中でカセットを開きます。 すぐに蛍光イメージャの暗いボックスにイメージング プレートを転送や暗い部屋で蛍光イメージャを配置します。
    注: 解析後のデジタル画像を個々 の標本を識別するために露光中にスライドの空間的配置を記録しておきます。したがって、蛍光イメージング プレートは、デジタル画像のプレートの正しい方向を識別するために異なる角度でカット 1 つのコーナーを表示もできます。
  5. 最高解像度のデジタル画像を得ることが可能でプレートをスキャンします。

4. 省略可能: クレシル バイオレット染色組織切片

  1. 500 mL の脱イオン水 (dH2O) 酢酸クレシル バイオレットの 5 g を混合することによって 1% クレシル バイオレット溶液を準備 (約 2 h) を溶解するまで。新しい 500 mL ペットボトルに漏斗を使用してフィルター ペーパーを通してフィルターします。3.5 3.8 に pH を調整します。
  2. ヒューム フードの下でスライド染色の位置を設定します。トレイ (キシレン) を除いて白色ポリプロピレン トレイに以下のソリューションを準備します。
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% エタノール
    + 100% エタノール
    e. 100% dH2O
    f. 1% クレシル バイオレット
    g. 0.07% 酢酸 (dH2O の 250 mL に酢酸の 175 μ L を追加)。
    h. 100% キシレン耐溶剤性緑色のトレイ
    i. 100% キシレン耐溶剤性緑色のトレイ
  3. ヒューム フードにスライドを転送し、スライド ラックに配置します。
  4. 100% エタノール (トレイ a ~ d) dH2O 中のエタノールの増加の傾斜シリーズを通して脂質 1 分のスライドを浸すことによって溶解します。
  5. DH2O エタノール (トレイの a ~ d トレイ e が続く逆の順序) の濃度を 1 分間スライドを浸すことによって降順で標本を水分補給します。
  6. クレシル バイオレット溶液中 10 分間で標本を浸します。
  7. DH2O に 1 分浸漬による 4-8 米洗う優しく上下スライド スライドを持ち上げることによって 0.07% 酢酸で標本をすすいでください。
  8. 30 のスライドの浸漬による試料を脱水エタノール (トレイ a ~ d) の濃度を昇順で s。
  9. キシレン 100% エタノールをクエンチする (トレイ h と私) の 2 つのトレイを標本を転送します。
  10. DH2O エタノール (トレイの a ~ d トレイ e が続く逆の順序) の濃度を 1 分間スライドを浸すことによって降順で標本を水分補給します。
  11. 生理食塩水からピンセットでスライドを削除します。有機溶剤のスライドあたりのメディアのマウントを数滴、供試体を保護するために上に 24 × 60 mm coverslip を追加します。優しく、coverslip の上に押すことによって標本と coverslip の間の空気の泡を削除します。
    注: は、乾燥を防ぐために実装時キシレンで残りのスライドを保持します。
  12. ドライ スライドは、室温の発煙のフードの一夜します。
  13. 顕微鏡と 1.25 × 対物標本の画像を取得します。

5 デジタル画像のデンシトメトリーの分析

  1. 各校正画像解析ソフトウェアの [3H] ミクロ スケールから標準的な相対密度 (棒) を測定します。
    1. メニュー項目の領域決定から地域を作成するためのツールを使用して [3H] マイクロ スケールの各ポイントのための同じサイズの領域を選択します。メニュー アイテムのラベルの下の番号をクリック、各選択範囲に番号を割り当てます。
    2. クリックして標準の校正の各ポイントの OD 値をエクスポートファイル |Export | 2D リージョン レポート。ロッド値をスプレッドシートに転送し、選択した領域のサイズによって正規化します。さらに薄層クロマトグラフィー分析の標準曲線を取得する線形回帰を実行します。
      注: 選択した領域は一致するロッド値およびサンプルを識別するためにラベル付けされていることを確認します。
  2. 独自の地域を選択してイメージング ソフトウェアを使用して autoradiograms の定量化を行うの利益 (率 ROI)地域作成ツールを使用して各セクションとその ODs を測定します。コピーして手動で調整し各ゲノムスキャニングの脳の解剖学のマイナーな変化の関心の領域のテンプレートを作成してすべてのセクションで同じ領域を選択します。脳アトラス18と autoradiograms の比較による ROI の解剖学を識別します。複数の治療法を比較すると、盲目し、Roi の偏った選択を避けるためにランダム化された分析を実行します。
  3. ロッド値と選択した領域のサイズをクリックしてスプレッドシートにエクスポートファイル |Export | 2D リージョン レポート。
  4. その地域で特定の面積あたりの密度を得るための選択した投資収益率の測定棒を分割します。
  5. プレートの背景の棒を測定し、対応するロッド値と領域のサイズをスプレッドシートにエクスポートします。それぞれの投資収益率のすべてのロッドの値から平均バック グラウンド信号を減算します。
  6. 平均技術的複製、すなわちセクションの棒は、同じ動物からのティッシュを使用してレプリケートします。
  7. 標準曲線を使用して棒をリガンド結合、すなわち単位に変換します。、nCi/mg 組織同等物 (TE)。
    注: 標準材料組織をシミュレートすることで生成されるため長期テが使用されます。
  8. リガンド (式 1) の特定の活動に応じて nCi/mg の nmol/mg TE への変換によってバインディングを表現します。
    figure-protocol-6837(1)
  9. 特定のバインディング値を取得するには、非特異的合計バインディングからバインディングを減算します。
  10. 平均 (ステップ 5.6 で得られた) それぞれの動物の技術的な平均を使用して、すべての生物の複製のバインドをレプリケートします。

結果

記述のプロトコルを使用して、高親和性 GHB 結合部位の解剖学的分布は放射性標識された GHB アナログ [3H] 可視化したマウスの脳は、コロナ、矢状面、水平方向のセクション (図 3 にカットされた HOCPCA).バインドの高レベルは、海馬と皮質で観察された、線条体下部のバインドとバインドがありませんが小脳で検出された高親和性 GHB サイ...

ディスカッション

オートラジオグラフィーによるアッセイの品質よく、リガンドの感度によって決定されます。主要な貢献の要因は適切な特定活動 (すなわち放射能の量を持つ配位子を生成する知られている配位子の可用性または特定のラベリング技術の可能性に与えられる選択したラジオ アイソトープ放射性リガンドの単位モル) あたり23と化学的な劣化の限られた量。イメージング...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

仕事は、ルンドベック財団 (グラント R133 A12270) とノボ ノルディスク財団 (グラント NNF0C0028664) によって支持されました。著者は、[3H] 放射性リガンドの供給のための博士 Aleš マレクをありがとうございます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore107017
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mLSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus slidesVWR631-9483microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura Finetek Denmark ApS4451
Tritium Standard on GlasAmerican Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
Xylene substituteSigma-AldrichA5597

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