시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

요약

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

초록

Autoradiography 생체 외에서 인간 뿐만 아니라 실험 동물에서 조직에 관심사의 단백질의 해부학 적 분포를 시각화 하는 것을 목표로. 메서드를 생물 학적 대상 radioligand의 특정 바인딩을 기반으로 합니다. 따라서, 언된 조직 단면도 radioligand 솔루션, 알을 품는 그리고 대상 바인딩 이후 지역화 방사성 붕괴의 탐지에 의해 예를 들어 감광 필름 또는 인광 체 격판덮개를 이미징 사용 하 여. 결과 디지털 autoradiograms 정량화 및 지역화 radioligand 바인딩 다른 해 부 구조에서의 놀라운 공간 해상도 표시 합니다. 또한, 정량화 바인딩 사이트 (B_최대) 선택 된 조직에서의 밀도 뿐만 아니라 분리 상수 (K_d), (K_나) 저해 상수에 의하여 ligand 선호도 약리 특성에 대 한 수 있습니다. 따라서, 메서드는 대상 지역화 및 리간드 선택에 대 한 정보를 제공합니다. 여기, 기술은 높은 선호도 γ-hydroxybutyric 산 (GHB) 바인딩 바인딩 분석 결과 관한 방법론 고려 사항에 특별 한 강조와 포유류 뇌 조직에서 사이트의 autoradiographic 묘사와 궁 행 매개 변수는 radioligand 및 검출 방법의 선택.

서문

Autoradiography는 방사성 붕괴의 이미지를 제공 하는 방법입니다. 기술은은 정기적으로 관심 생체 외에서 기반 radiolabelled 화합물과 그 대상 간의 특정 약물 상호 작용에의 한 단백질의 조직 분포를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 대상에 대 한는 리간드의 선택도 대 한 직접적인 정보를 제공합니다. 생체 외에서 autoradiography도 사용할 수 있습니다 결정 뿐만 아니라 약리 바인딩 매개 변수 분리 상수 (K_d) 및 (B_최대), 바인딩 사이트의 밀도 같은 radioligands의 양적 결정 경쟁 ligands^1,2의 저해 상수 (K_i). 전통적인 homogenate radioligand 바인딩에 비해 autoradiography 공간 해부학을 시각화 수 있는 그리고 지역 식 패턴³의 간결 상세히의 이점이 있다. Autoradiography 방법 따라서 검증 된 항 체의 부재에 (서) 특히 immunocytochemistry에 관련 대안입니다. Autoradiography 쉽게 필요한 약리학 특이성, 톰 cryostat 준비 조직 단면도, 및 적합 한 이미징에 대 한 액세스와 함께 적합 한 radioligand의 가용성을 주어진 표준 방사성 동위 원소 실험실에서 구현 각 조직 섹션에서 방사능의 분포를 분석할 수 있는 장치. 특히,는 radioligand에 대 한 중요 한 선택 기준이 아닌 대상 사이트에 바인딩 제한 금액입니다. 이 다른 단백질, 세포 막 또는 플라스틱 또는 필터, 등 자료 수 있으며 일반적인 바인딩 통칭. 일반적으로, 비 특정 바인딩 비 있는 하지만 있는 특정 오프 대상 단백질을 포함 될 수 있습니다. 사실 특정 바인딩 유효성을 검사 하는 가장 좋은 방법은 조직 부족 대상, 예를 들면, 유전자를 비교 (녹아웃) 조직⁴설계 된다.

여기, 방법론은 포유류 두뇌에서 γ-hydroxybutyric acid (GHB)의 높은 친 화력 바인딩 사이트의 autoradiographic 묘사와 그림입니다. GHB는 narcolepsy 및 알코올 중독⁵, 치료 뿐만 아니라 포유류 두뇌와는 레크리에이션의 자연 구성 모두 임상적으로 유용한 약물 관련성의 이다 GHB와 그것의 바인딩 사이트 간의 약리 상호 작용 이해 약⁶. 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트 처음 쥐 뇌 homogenate⁷[³H] GHB 바인딩을 사용 하 여 설명 했다. 년 동안, 더 autoradiography 연구 [³H] GHB와 아날로그 [³H] NCS 382 바인딩 사이트 쥐^8,,910, 마우스⁹ 개 지역에서의 높은 밀도 보였다는 ¹¹와 원숭이/인간 두뇌¹²돼지. 그러나, 분자 정체성과 이러한 바인딩 사이트의 정확한 기능 관련성은 애매 남아 있다.

의도 바인딩 사이트 추가 하 고 GHB의 생리 적 역할에 대 한 연구를 촉진 하기 위하여, 다른 동위 원소 다른 선호도 부여를 통합 하는 여러 radioligands 개발 되었습니다 ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA와 [¹²⁵나] BnOPh GHB)^13,,1415,16(¹⁷에서 검토) (그림 1). 선택적인 높은 선호도 radioligands와 바인딩 사이트 이미징 기술^9,11형광체를 사용 하 여 높은-품질 이미지의 생산에 대 한 허용의 매우 높은 조직 밀도의 조합. 세부를 예증 하는 autoradiographic 실험 및 그림 설정에 실용적인 포인트의 개요, 함께 토론 섹션의 방사성 핵 종 i) 선택, ii) 분석 결과 조건, 선택 및 iii) 형광체의 사용을 강조 합니다. x 선 필름 대 이미징 접시입니다. 이 종이의 전반적인 목표는 조직 분포 및 단백질 목표의 약리학 분석에 대 한 알리는 autoradiography 기술에 기술, 방법론 및 과학적인 세부 사항을 제공.

프로토콜

모든 동물 처리 덴마크어 동물 실험 검사자에서 지침에 따라 수행 되었다.

참고: 여기에 설명 된 프로토콜 커버 조직 준비 (즉, 마우스 뇌 조직), 생체 외에서 autoradiographic 분석 결과 새로운 실험실에서 메서드, 인광 체 격판덮개를 이미징에 노출 설정에 대 한 충분 한 세부 사항에서 뿐만 아니라 지역화 및 다른 해 부 구조에 radioligand 바인딩 측정의 목적으로 autoradiograms (그림 2)의 후속 densitometric 분석. 비교를 위해 조직학, cresyl 보라색 얼룩이 지는 프로토콜 포함 되어 있습니다. 또한, 일반적인 경쟁 ligand 바인딩 결정 프로토콜 내에서 포함 되어 있습니다. K_d, B_최대 또는 K_나확인 하는 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 이전 게시⁴를 참조 하십시오.

1. 조직 준비 Cryosectioning

1. 자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사 하 고 즉시가 위와 집게를 사용 하 여 뇌를 해 부. 직접 조직 손상을 방지 하려면 다음 단계를 진행 합니다.
2. 스냅-동결 조직 침수에 의해 가루 드라이 아이스, 기체 CO₂ 또는 isopentane. 직접-20 ° c.에 설정 온도와 냉동된 조직 한 cryostat에 전송 또는 처리까지 조직-80 ° C에 저장 합니다.
   참고: 반복된 녹고/동결 조직 손상을 줄이기 위해 피하십시오.
3. 추가 조직 산 산 조각 방지 하기 처리 하기 전에 20 분 동안 cryostat에-20 ° C에 적응 하는 조직 하자.
4. 포함 매체는 cryostat 외부 조직 홀더를 커버 하 고 포함 매체는 여전히 액체 동안 신속 하 게 원하는 방향에서 동결된 조직 표본을 장소. 예를 들어, rostral 코로나 섹션을 달성 하기 위하여 수직으로 소 뇌에 쥐의 뇌를 놓습니다. 조직 홀더는 cryostat 다시 전송 하 고 노출 온도 아래에 포함 매체 강화-10 ° C.
   참고: 연약한 조직 표본 장착 전에 조직 금형 내에서 매체를 포함에 코팅 한다.
5. 조직 홀더는 cryostat의 톰에 위치. 경사 부분을 피하기 위해 조직의 방향을 조정 합니다.
6. 잘라 원하는 두께의 섹션에서 stereotaxic 아틀라스¹⁸ 의 지도 함께 조직 (12 µ m [³H]에 대 한 권장 ligands를 표시). 신중 하 게 제대로 필요한 경우 작은 크기의 브러시와 섹션을 펼쳐 고 해 동 실장 현미경 슬라이드에 섹션. 순차적으로 원하는 기술 복제 (예를 들어, 슬라이드 당 4 섹션)에 대 한 관심의 영역에서 섹션을 수집 합니다.
7. 1 시간에 대 한 추가 처리 하기 전에 건조를 슬라이드에 섹션 수 있습니다.
   참고: 슬라이드 상자를 건조 시키는 물자의 추가 습기 직물 단면도에 구축을 최소화합니다. Procotol 일시 중지 할 수 여기 섹션 장기-80 ° c.에 슬라이드 상자에 저장 하 여

2. 생체 외에서 Autoradiography

주의: 방사능. 지역 규정에 따라 인증 된 실험실에서 작동 합니다. 보호복을 착용 하십시오. 되거나 방사성 붕괴에 따라 삭제 인증된 회사에 아웃소싱.

1. 실 온 (RT)에서 적어도 30 분 동안 섹션 녹여 실험 조건으로 슬라이드를 레이블을 지정 합니다. 연필을 사용 하 여 슬라이드 후속 얼룩 동안 에탄올에 목욕 것입니다 때문에.
2. 플라스틱 쟁반에 슬라이드를 가로로 놓습니다.
   참고: 슬라이드 플라스틱 트레이 내 상승 된 플랫폼에 위치 그들의 처리를 촉진 한다.
3. 미리 incubate 섹션 분석 결과 버퍼에서 슬라이드에 조정 문제의 대상 (GHB 프로토콜, 50mm KHPO₄ 버퍼 pH 6.0 사용)에 대 한 슬라이드 (3-4 설치류 코로나 섹션에 대 한 700 µ L)에 적절 한 볼륨을 신중 하 게 적용 하 여.
   참고: 모든 섹션 액체와 완전히 덮여 있는지 확인 합니다.
   1. 증발을 방지 하 고 지속적인 부드러운 (20 rpm) 판 통에 떨고 (GHB 프로토콜 사전 incubate RT에서 30 분)에 대 한 관련 온도에서 미리 품 어 뚜껑을 가진 플라스틱 쟁반을 커버.
   2. 일반적인 바인딩 결정에 대 한 분석 결과 버퍼 (GHB 프로토콜, 1mm GHB)에 대 한 unlabelled 화합물의 관련 농도를 보충.
      참고: 사전 부 화 필요 없을 수 있습니다.
4. 각 슬라이드에서 사전 부 화 액체를 부 어와 슬라이드를 다시 플라스틱 쟁반에 전송.
5. 탈수를 피하기 위해, 즉시 원하는 조건에서 분석 결과 버퍼에서 radioligand의 관련 농도 단면도 품 어 (GHB 프로토콜, 1 nM [³H] RT에서 1 h HOCPCA)는 radioligand로 섹션을 취재 하 여 솔루션 (3-4 설치류 코로나 섹션에 대 한 700 µ L).
   1. 닫힌된 뚜껑을 가진 플라스틱 쟁반의 지속적인 부드러운 (20 rpm) 떨고 아래에서 품 어.
      참고: radioligand 농도 액체 섬광 카운터에서 약 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다.
6. 액체를 붓는 의해 부 화 솔루션을 제거 하 고 현미경 슬라이드 랙 슬라이드를 전송. 즉시 섹션 탈수를 피하기 위해 다음 단계를 진행 합니다.
7. 슬라이드를 씻어. GHB 프로토콜에 대 일 분을 제거 하는 방법에 얼음 처럼 차가운 증류수로 가득 쟁반으로 슬라이드 랙 찍기로 두 번 차가운 분석 결과 버퍼 두 번 20 s와 다음 린스 세척. RT에 적어도 1 시간에 대 한 공기에 대 한 선반에서 슬라이드를 수직으로 위치 또는 차가운 온도를 설정 하는 송풍기와 5 분에 대 한 슬라이드를 건조.
   참고: 세척 최적화 해야 합니다, 예를 들어, 광범위 한 세척 비 특정 바인딩 감소에 도움이 될 수 있습니다.
8. 슬라이드 fixator paraformaldehyde (PFA) 파우더 PFA RT에서 수증기와 함께 하룻밤 고정을 위한 ligand 대상 단지의 무결성을 보호 하기 위해 포함 된 전송.
   주의: PFA 독성이 있다. 에 위치 fixator 후드를 연기 하 고 PFA와 피부/눈 접촉을 피하기 위해.
9. 다음 날, desiccator 상자 습기를 제거 하는 RT에 3 h에 대 한 실리 카 젤을 포함 하는 슬라이드를 전송 합니다.

3. 형광 이미징 접시와 검색에 노출

1. 향하도록 하는 조직으로 방사선 차폐 이미징 플레이트 카세트에 섹션을 배치 합니다. Radioligand 바인딩의 후속 정량화에 대 한 모든 카세트 [³H] 미 포함. 섹션을 무작위로 정렬 하 고 같은 카세트에 직접적인 비교에 대 한 섹션을 노출.
2. 축적 된 신호 저장에서 제거 배경 신호를 제거 하 고 사용 직전 접시를 이미징 움 민감한 형광체를 지웁니다. 따라서, 형광 이미징 시스템으로 접시를 로드 하 고 표시/적외선 제조업체의 지침에 따라 빛에 노출.
3. 형광 이미징 시스템에서 접시를 제거 하 고 즉시 카세트에 섹션에 놓습니다. 카세트 완전히 닫혀 있는지 확인 합니다. 빛 으로부터 차폐 된 RT에서 3 일 동안 형광 이미징 접시에 섹션을 노출 합니다.
4. 빛 지웁니다 이미징 접시에서 신호, 때문에 신중 하 게 카세트 어둠 속에서 및 즉시 이미징 접시 인 영상의 어둠 상자에 전송 열거나 형광체 영상 어두운 공간에 둡니다.
   참고: 분석 후 디지털 이미지에서 개별 견본을 식별 하기 위해 노출 하는 동안 슬라이드의 공간 배열 notate 있는지 확인 합니다. 따라서 형광 이미징 접시는 또한 디지털 사진에 있는 접시의 정확한 방향을 확인 하기 위해 고유한 각도에서 잘라 한 구석에 표시.
5. 높은 해상도 디지털 이미지를 얻을 수에 접시를 검사 합니다.

4. 선택 사항: Cresyl 조직 단면도의 보라색 얼룩

1. Cresyl 바이올렛 아세테이트 이온된 수 (dH₂O)의 500 ml의 5 g을 혼합 하 여 1 %cresyl 바이올렛 솔루션 준비 (약 2 시간) 녹아 때까지. 새로운 500 mL 병으로 깔때기를 사용 하 여 필터 종이 통해 필터링. PH 3.5-3.8를 조정 합니다.
2. 위치 슬라이드 얼룩 증기 두건에서 설정합니다. 트레이 (크 실 렌)을 제외 하 고 백색 폴 리 프로필 렌 쟁반에서 다음 솔루션으로 준비:
   a. 50% ethanol/50% dH₂O
   b. 70% ethanol/30% dH₂O
   c. 100% 에탄올
   d. 100% 에탄올
   e. 100% dH₂O
   f. 1 %cresyl 바이올렛
   g. 0.07% 초 산 (dH₂O의 250 mL에 아세트산의 175 µ L 추가).
   헤 녹색 용 매 저항 트레이 자일 렌 100%
   i. 100% 녹색 용 매 저항 쟁반에 크 실 렌
3. 증기 두건에 슬라이드를 이동 하 고 슬라이드 선반에 넣어.
4. 1 분에 대 한 슬라이드를 담거 서 100% 에탄올 (트레이 a-d)로 dH₂O에서에서 에탄올의 증가 등급된 시리즈를 통해 지질을 분해.
5. DH₂O 1 분에 대 한 슬라이드를 찍기로 에탄올 (트레이 a-d 트레이 e 뒤에 반대 방향에서)의 농도 내림차순으로 통해 표본 리하이드레이션
6. Cresyl 보라색 10 분 솔루션에서 표본 담가.
7. 린스는 표본 0.07% 아세트산에 dH₂O 1 분 동안에 담거 서 4-8 미 세척에 대 한 부드럽게 위아래로 슬라이드 슬라이드를 해제 하 여.
8. 표본 30에 대 한 슬라이드의 침수로 탈수 에탄올 (트레이 a-d)의 농도 오름차순에서 s.
9. 100% 크 실 렌 (트레이 h와 나) 에탄올을 끄다의 두 쟁반을 통해 표본 전송.
10. DH₂O 1 분에 대 한 슬라이드를 찍기로 에탄올 (트레이 a-d 트레이 e 뒤에 반대 방향에서)의 농도 내림차순으로 통해 표본 리하이드레이션
11. 집게와 염 분에서 슬라이드를 제거 합니다. 슬라이드 당 미디어를 장착 하는 유기 용 매를 몇 방울을 추가 하 고 24 x 60 m m coverslip 견본을 보호 하기 위해 상단에 추가. coverslip에 부드럽게 눌러 견본 coverslip 사이의 기포를 제거 합니다.
    참고: 크 실 렌 건조 방지 하기 위해 설치 하는 동안 나머지 슬라이드 하십시오.
12. 건조 슬라이드 실시간에 증기 두건에서 하룻밤
13. 현미경 및 1.25 X 목표 표본 그림을 가져옵니다.

5. densitometric 디지털 이미지 분석

1. 각 교정 이미지 분석 소프트웨어와 함께 [³H] 눈금에서 표준의 상대 광학 밀도 (막대)를 측정 합니다.
   1. 메뉴 항목 지역 결정 지역 창조 를 위한 도구를 사용 하 여 [³H] 눈금의 각 지점에 대해 동일한 크기의 영역을 선택 합니다. 메뉴 항목 레이블아래 번호 를 클릭 하 여 각 선택된 영역에 번호를 할당 합니다.
   2. 클릭 하 여 표준 교정의 각 지점에 대 한 OD 값을 내보내기 파일 | E 내보내기 | 2D 지역 보고서. 스프레드시트를 로드 값을 전송 하 고 선택 된 영역의 크기에 의해 정상화. 추가 densitometric 분석에 대 한 표준 곡선을 얻기 위해 선형 회귀를 수행 합니다.
      참고: 선택된 영역 일치 막대 값과 샘플 식별 표시는 다는 것을 확인 하십시오.
2. 독자적인 영역을 선택 하 여 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 autoradiograms의 정량화를 수행의 (수익 ROI) 모든 섹션 영역 생성 도구를 사용 하 고 그것의 ODs를 측정. 복사 하 고 각 autoradiogram에 대 한 뇌 해부학에서 사소한 변화에 수동으로 조정 관심 영역에 대 한 템플릿을 만들어 모든 섹션에 동일한 영역을 선택 합니다. 뇌 아틀라스¹⁸와 autoradiograms의 비교 하 여 투자 수익의 해부학을 식별 합니다. 여러 치료법을 비교 하면 눈을 멀게 하 고 편견된 다양 ROIs 피하기 위하여 무작위로 분석을 수행 합니다.
3. 수출 막대 값 및 선택 된 영역의 크기를 클릭 하 여 스프레드시트에 파일 | E 내보내기 | 2D 지역 보고서.
4. 특정 지역 당 밀도 얻기 위해 그것의 지역에 의해 선택 된 ROI의 측정된 막대를 나눕니다.
5. 접시의 백그라운드의 로드를 측정 하 고 스프레드시트에 해당 하는 막대 값 영역 크기를 수출. 각 투자 수익의 모든 막대 값에서 평균 배경 신호를 뺍니다.
6. 평균 기술 복제, 즉, 섹션의 봉 같은 동물에서 직물을 사용 하 여 복제 합니다.
7. 표준 곡선을 사용 하 여 봉 radioligand 바인딩, 즉의 단위로 변환., nCi/mg 조직 등가물 (테).
   참고: 용어 테 표준 조직 시뮬레이션 자료로 생성 되 있기 때문에 사용 됩니다.
8. Radioligand (식 1)의 특정 활동에 따라 바인딩 nmol/mg 테 nCi/mg의 변환 하 여 표현 한다.
   (1)
9. 특정 바인딩 값을 얻기 위해 일반적인 바인딩을 총 바인딩에서 뺍니다.
10. 평균 기술의 평균을 사용 하 여 모든 생물 복제의 바인딩 (단계 5.6에서 얻은) 각 동물의 복제 합니다.

결과

설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트의 해부학 적 분포 radiolabelled GHB 아날로그 [³H] 함께 가시화 했다 코로나, 화살 및 수평 섹션 (그림 3으로 잘 렸는 쥐의 뇌에 HOCPCA ). 높은 수준의 바인딩 해 마와 대뇌 피 질에서 관찰 되었다가 낮은 바인딩 및 바인딩 없음 검색 되었습니다, 소 뇌에 해당 하는 높은 선호도 GHB 사이트<...

토론

Autoradiographic 분석 결과의 품질은 가장 자주는 radioligand의 감도 의해 결정 됩니다. 주요 기여 하는 요소는 적절 한 특정 활동 (즉, 방사능의 양을 ligands를 알려진된 ligands의 가용성에 의해 또는 특정 라벨 기술의 타당성에 의해 주어진 선택 된 방사성 동위 원소 단위는 radioligand의 두더지) 당²³와 화학 저하의 제한 금액. 알려진된 ligands의 radioligands의 많은 수는 움^...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597