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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La méthode d’autoradiographie est systématiquement utilisée pour étudier la liaison des radioligands sections de tissu pour la détermination de la pharmacologie qualitative ou quantitative.

Résumé

In vitro autoradiographie a pour but de visualiser la répartition anatomique d’une protéine d’intérêt dans les tissus des animaux de laboratoire ainsi que les êtres humains. La méthode est basée sur la liaison spécifique d’un radioligand vers sa cible biologique. C’est pourquoi, coupes de tissus congelés sont incubés avec solution radioligand, et la liaison à la cible est ensuite localisée par la détection de la radioactivité, par exemple, en utilisant le film photosensible ou plaques-images au phosphore. Autoradiogrammes numériques qui en résulte affichent une résolution spatiale remarquable, ce qui permet la quantification et la localisation des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. En outre, quantification permet la caractérisation pharmacologique de l’affinité du ligand au moyen des constantes de dissociation (Kd), les constantes d’inhibition (Kj’ai) ainsi que la densité des sites de fixation (Bmax) dans les tissus choisis. Ainsi, la méthode fournit des informations sur la localisation de la cible tant de sélectivité de ligand. Ici, la technique est illustrée avec caractérisation autoradiographique de l’acide de haute affinité gamma-hydroxybutyrique (GHB) accepteurs dans le tissu de cerveau des mammifères, avec un accent particulier sur les considérations d’ordre méthodologiques concernant l’essai de liaison paramètres, le choix de la méthode de détection et de radioligand.

Introduction

Autoradiographie est une méthode qui fournit des images de désintégration radioactive. La technique est couramment utilisée pour étudier la distribution tissulaire d’une protéine d’intérêt en vitro basée sur une interaction pharmacologique spécifique entre un composé radiomarqué et sa cible. Ceci fournit des informations directes sur la sélectivité du ligand pour la cible. In vitro autoradiographie peut également être utilisé pour la détermination quantitative des paramètres de liaison pharmacologique des radioligands, tels que la constante de dissociation (Kd) et la densité des sites de fixation (Bmax), ainsi que pour déterminer la constante d’inhibition (Ki) concurrentes des ligands1,2. Par rapport aux traditionnels homogénat radioligands, autoradiographie a l’avantage d’être en mesure de visualiser l’anatomie du spatial et donnant des détails succincts sur expression régionale modèles3. La méthode d’autoradiographie est donc une alternative pertinente à l’immunocytochimie, surtout en l’absence d’un anticorps validé. Autoradiographie est facilement mis en œuvre dans un laboratoire de radio-isotope standard compte tenu de la disponibilité d’un radioligand adapté avec la spécificité pharmacologique requise, l’accès à un cryostat microtome servant à préparer des sections de tissu et une imagerie adaptée appareil qui est capable d’analyser la répartition de la radioactivité dans les sections respectives de tissu. Notamment, un critère de sélection important pour radioligand est une quantité limitée de liaison aux sites non ciblés. Ceci peut être à d’autres protéines, les membranes ou les matériaux comme le plastique ou les filtres et est collectivement dénommé non-spécifiques. Habituellement, non-spécifiques est non saturable mais peut être saturable si il s’agit d’une protéine spécifique de la cible. Le meilleur moyen de validation véritable fixation spécifique est à comparer aux tissus manque la cible, par exemple, génétiquement machiné des tissus (knock-out)4.

Ici, la méthode est illustrée par la caractérisation autoradiographique du site de liaison de haute affinité pour l’acide gamma-hydroxybutyrique (GHB) dans le cerveau des mammifères. Comprendre l’interaction pharmacologique du GHB et son site de liaison est pertinent que le GHB est une drogue tant cliniquement utile dans le traitement de la narcolepsie et l’alcoolisme5, mais aussi un constituant naturel du cerveau mammifère et un loisir 6de drogue. Sites de liaison de haute affinité GHB ont été les premiers décrits à l’aide de la [3H] liant de GHB au cerveau de rat homogénat7. Au cours des années, poursuivre des études d’autoradiographie [3H] GHB et l’analogue de la [3H] NCS-382 a montré une forte densité de sites dans les régions du cerveau de rat8,9,10, souris9 de liaison ,11et singe/homme cerveau12de porc. Cependant, l’identité moléculaire et la pertinence fonctionnelle exact de ces sites de liaison sont restés insaisissables.

Avec l’intention de mieux caractériser les sites de liaison et à faciliter les études sur le rôle physiologique du GHB, multiples radioligands incorporant différents isotopes dotés d’affinités différentes ont été développés ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA et [125j’ai] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revu en17) (Figure 1). La combinaison des radioligands de haute affinité sélective et une densité de tissu très élevée de la liaison de sites ont permis pour la production d’images de haute qualité en utilisant la technique9,11-images au phosphore. Ainsi qu’un aperçu des points pratiques à mettre en place une expérience autoradiographique et une illustration pour illustrer les détails, la section discussion mettra l’accent sur i) le choix du radionucléide, ii) le choix des conditions expérimentales et iii) l’utilisation de phosphore plaques d’imagerie contre le film radiographique. L’objectif général de ce document est de fournir des détails techniques, méthodologiques et scientifiques sur la technique d’autoradiographie pour informer la distribution tissulaire et analyse pharmacologique des protéines cibles.

Protocole

Tous les animaux de manutention a été réalisée en conformité avec les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois.

Remarque : Le protocole décrit ici couvre la préparation du tissu (c.-à-d., tissu de cerveau de souris), l’essai in vitro autoradiographique avec suffisamment de détails pour mettre en place la méthode dans un nouveau laboratoire, l’exposition aux images de plaques au phosphore ainsi que analyse densitométrique subséquente d’autoradiogrammes (Figure 2) dans le but de localiser et quantifier des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. Pour comparaison histologique, un protocole pour une coloration violet de crésyle est inclus. En outre, la détermination de la liaison non spécifique avec un ligand concurrent est incluse dans le protocole. Pour une description détaillée sur la façon de déterminer Kd, Bmax ou Kj’ai, voir précédente publication4.

1. tissu préparation par Cryosectioning

  1. Euthanasier la souris par dislocation cervicale et disséquer immédiatement sur le cerveau à l’aide de ciseaux et pinces. Passez directement à l’étape suivante pour éviter d’endommager les tissus.
  2. Clin d’oeil-gel le tissu par immersion dans la glace sèche en poudre, gaz CO2 ou isopentane. Transférer directement les tissus congelés sur un cryostat avec la température réglée à-20 ° C. Vous pouvez également stocker les tissus à-80 ° C jusqu’au traitement.
    Remarque : Évitez de dégel/gel répété pour réduire les lésions tissulaires.
  3. Laisser le tissu s’acclimater à-20 ° C dans le cryostat pendant 20 min avant la poursuite de la procédure afin d’éviter l’éclatement du tissu.
  4. Couvrir le support papier avec le milieu d’inclusion hors du cryostat et rapidement placer l’échantillon de tissus congelés dans l’orientation désirée tandis que le milieu d’enrobage est encore liquid. Par exemple, placer le cerveau de souris verticalement sur le cervelet afin d’atteindre les sections coronales rostrales. Transférer le porte-papier hygiénique à cryostat et exposer le milieu d’enrobage aux températures inférieures à-10 ° C pour la trempe.
    NOTE : Spécimen de tissu Fragile devrait être enduit en enrobage moyen dans les moules de tissu avant le montage.
  5. Positionner le support de tissu dans le microtome du cryostat. Ajustez l’orientation du tissu pour éviter les sections inclinées.
  6. Couper le tissu avec les conseils d’un atlas stéréotaxiques18 dans les sections de l’épaisseur désirée (12 µm recommandé pour la [3H] étiqueté ligands). Redresser et dépliez soigneusement la section avec une brosse de petite taille si nécessaire et dégel-Mont la section sur une lame de microscope. Séquentiellement, recueillir les sections de la région d’intérêt pour la réplication technique souhaitée (par exemple, 4 sections par lame).
  7. Laisser les sections sur les diapositives pour sécher à l’air pendant 1 h avant la manipulation de la friteuse.
    NOTE : Ajout de dessiccant à glissière boîtes minimise l’accumulation d’humidité sur les coupes de tissus. Protocole peut être suspendue ici en stockant des sections à long terme dans des boîtes de diapositive à-80 ° C.

2. in vitro autoradiographie

Attention : la radioactivité. Travailler dans un laboratoire certifié conformément aux réglementations locales. Portez des vêtements protecteurs. Éliminer conformément à la désintégration radioactive ou sous-traiter à une entreprise certifiée.

  1. Décongeler les sections pendant au moins 30 min à température ambiante (RT). Étiqueter les lames avec des conditions expérimentales. Utiliser un crayon car les diapositives seront être baignées dans l’éthanol pendant la coloration ultérieure.
  2. Déposer les lames horizontalement dans des plateaux en plastique.
    NOTE : Positionnement des diapositives sur une plate-forme surélevée dans des plateaux en plastique facilite leur manipulation.
  3. Pré incubate les sections montées sur les diapositives de tampon ajusté à cible en question (pour le protocole de GHB, 50 mM KHPO4 tampon pH 6.0 est utilisé) en appliquant soigneusement un volume approprié sur le toboggan (700 µL pour sections coronales rongeurs 3-4).
    Remarque : S’assurer que chaque article est complètement recouverte de liquide.
    1. Couvrir les bacs en plastique avec un couvercle pour éviter l’évaporation et pré incuber à une température correspondante (pour le protocole GHB pré incubate pendant 30 min à ta) sous la douce constante (20 tr/min), agiter dans un agitateur de plaque.
    2. Pour la détermination de non-spécifiques, supplément du tampon avec la concentration pertinente d’un composé non étiqueté (pour le protocole GHB, 1 mM GHB).
      NOTE : Pré-incubation n’est peut-être pas nécessaire.
  4. Décanter la pré-incubation liquide de chaque diapositive et transférer les lames vers le plateau en plastique.
  5. Pour éviter la déshydratation, immédiatement incuber les sections avec concentration pertinente du radioligand dans du tampon dans conditions souhaitées (protocole de GHB, 1 nM [3H] HOCPCA pendant 1 h à RT) en couvrant les sections complètement avec le radioligand solution (700 µL pour sections coronales rongeurs 3-4).
    1. Incuber en vertu douce constante (20 tr/min) secouant des plateaux en plastique avec couvercle fermé.
      Remarque : La concentration de radioligand peut être validée en comptant une partie aliquote dans un compteur à scintillation liquide.
  6. Enlever la solution de l’incubation de décanter le liquide et transférer les lames dans un rack de lames de microscope. Procéder immédiatement à l’étape suivante pour éviter la déshydratation de la section.
  7. Laver les diapositives. Pour le protocole GHB, laver avec tampon glacee deux fois pour 20 s et puis rincez deux fois en plongeant la grille coulissante dans les bacs remplis avec de l’eau distillée glacée pour enlever les sels. Placez les diapositives verticalement dans les racks pour séchage à l’air pendant au moins 1 h à RT ou sécher les lames pendant 5 min avec un souffleur à température froide.
    Remarque : Le lavage doit être optimisé, par exemple, un lavage peut être utile pour diminuer les liaisons non spécifiques.
  8. Transférer les lames d’un fixateur contenant de la poudre de paraformaldéhyde (PFA) pour la fixation au jour le jour avec des vapeurs de PFA à RT afin de protéger l’intégrité du complexe ligand-cible.
    Attention : PFA est toxique. Fixateur de la position de hotte des fumées et évitez tout contact de la peau/visuel avec IFP.
  9. Le lendemain, transférer les lames dans une boîte de dessiccateur contenant du gel de silice pendant 3 h à RT pour éliminer l’humidité.

3. exposition au phosphore plaques d’imagerie et analyse

  1. Placez les sections dans une cassette blindé radiation de plaque d’imagerie avec le tissu vers le haut. Pour la quantification ultérieure des radioligands, inclure une microéchelle [3H] dans chaque cassette. Organiser les sections au hasard et exposer les sections pour comparaison directe dans la même cassette.
  2. Effacer l’images plaque immédiatement avant son utilisation afin d’éliminer les signaux accumulés de stockage et d’éliminer les signaux de fond au phosphore sensibles au tritium. Par conséquent, charger la plaque dans la machine d’imagerie de phosphore et exposez-le au visible/infrarouge lumière selon les instructions du fabricant.
  3. Retirez la plaque de la machine d’imagerie de phosphore et placer immédiatement sur les sections de la cassette. Assurez-vous que la cassette est complètement fermée. Exposer les sections à la plaque d’imagerie de phosphore pendant 3 jours à ta protégée de la lumière.
  4. Parce que la lumière efface le signal de la plaque d’imagerie, soigneusement ouvrir la cassette dans l’obscurité et immédiatement transférer la plaque d’imagerie dans la boîte noire d’un imageur de phosphore ou placez l’imageur de phosphore dans une pièce sombre.
    Remarque : Veillez à noter l’arrangement spatial des lames pendant l’exposition afin d’identifier le spécimen individuel sur l’image numérique après analyse. Par conséquent, les plaques d’imagerie de phosphore également affichent un coin coupé dans un angle distinct afin d’identifier la bonne orientation de la plaque sur la photo numérique.
  5. Scannez la plaque avec la meilleure résolution possible d’obtenir une image numérique.

4. facultatif : Cresyl Violet la coloration des coupes de tissus

  1. Préparer la solution de violet de crésyle de 1 % par le mélange de 5 g d’acétate violet de crésyle dans 500 mL d’eau désionisée (dH2O) jusqu'à la dissolution (environ 2 h). Filtrer sur un filtre en papier à l’aide d’un entonnoir dans un nouveau flacon de 500 mL. Ajuster le pH de 3,5 à 3,8.
  2. La coloration de la diapositive positionné sous hotte aspirante. Préparer les plateaux avec les solutions suivantes dans des plateaux en polypropylène blancs (à l’exception de xylène) :
    a. 50 % ethanol/50% dH2O
    b. 70 % ethanol/30% dH2O
    c. 100 % éthanol
    d. 100 % éthanol
    e. 100 % dH2O
    f. violet de crésyle 1 %
    g. 0,07 % d’acide acétique (ajouter 175 µL d’acide acétique dans 250 mL de dH2O).
    h. 100 % xylène dans des plateaux résistant aux solvants verts
    i. 100 % xylène dans des plateaux résistant aux solvants verts
  3. Transférer les lames à la hotte et les placer dans une grille coulissante.
  4. Dissoudre les lipides à travers une série graduée croissante d’éthanol en dH2O en 100 % éthanol (plateau a à d) en plongeant les diapositives pendant 1 min.
  5. Réhydrater les echantillons dH2O à décroissant des concentrations d’éthanol (plateau a-d dans l’ordre inverse, suivi de plateau e) en plongeant les diapositives pendant 1 min.
  6. Immerger les échantillons en solution de violet de crésyle pendant 10 min.
  7. Rincer les spécimens dans l’acide acétique 0,07 % en soulevant la glisse de haut en bas doucement pendant 4-8 s. lavage les diapositives en plongeant en dH2O pendant 1 min.
  8. Déshydrater les spécimens par immersion des diapositives pour 30 s en croissant des concentrations d’éthanol (plateau a à d).
  9. Transférer les échantillons par le biais de deux plateaux de 100 % de xylène (plateau h et i) pour étancher l’éthanol.
  10. Réhydrater les echantillons dH2O à décroissant des concentrations d’éthanol (plateau a-d dans l’ordre inverse, suivi de plateau e) en plongeant les diapositives pendant 1 min.
  11. Supprimer les diapositives de sérum physiologique avec une pince. Ajouter quelques gouttes de solvant organique médias par lame de montage et ajouter une lamelle de 24 x 60 mm sur le dessus pour protéger les spécimens. Enlever les bulles d’air entre l’échantillon et la lamelle couvre-objet en appuyant doucement sur la lamelle couvre-objet.
    Remarque : Conservez les diapositives restants dans le xylène lors du montage pour éviter le dessèchement.
  12. Les diapositives sèche durant la nuit dans une hotte de laboratoire à température ambiante.
  13. Obtenir une image de l’échantillon avec un microscope et 1,25 X objectif.

5. densitométrie de l’Image numérique

  1. Mesurer les densités optiques relatives (tiges) de chaque solution étalon de la micro-échelle [3H] avec une analyse d’images.
    1. Sélectionnez une zone de taille égale pour chaque point de la [3H] microscale utilisant un outil de création de la région de l’élément de menu détermination de la région. Attribuer un numéro à chaque zone sélectionnée en cliquant sur le numéro dans la rubrique Label.
    2. Exporter des valeurs de do pour chaque point de la solution étalon en cliquant sur fichier | E xport | rapport 2D région. Transfert des valeurs ROD dans une feuille de calcul et normaliser par la taille de la zone sélectionnée. Effectuer une régression linéaire pour obtenir une courbe d’étalonnage pour analyse densitométrique.
      Remarque : Assurez-vous que les zones sélectionnées sont étiquetés afin d’identifier les valeurs ROD et échantillons correspondants.
  2. Effectuer la quantification des autoradiogrammes à l’aide de l’auteur de logiciels d’imagerie en sélectionnant la zone d’intérêt (ROI) à l’aide d’un outil de création de la région dans toutes les sections et en mesurant son ODs. Sélectionner la même région dans toutes les sections en créant un modèle pour la région d’intérêt, ce qui est copié et réglé manuellement à des variations mineures dans l’anatomie du cerveau pour chaque autoradiogram. Identifier l’anatomie du ROI en comparaison des autoradiogrammes avec un cerveau atlas18. Lorsqu’on compare plusieurs traitements, effectuer l’analyse aveuglé et randomisées afin d’éviter la sélection biaisée des ROIs.
  3. Exporter des valeurs de tige et les tailles des zones sélectionnées dans une feuille de calcul en cliquant sur fichier | E xport | rapport 2D région.
  4. Diviser la tige mesurée du ROI sélectionné par sa superficie pour obtenir la densité surfacique spécifiques.
  5. Mesurer la tige du fond de la plaque et les valeurs correspondantes de tige et de la taille de la zone d’exportation dans un tableur. Soustraire le signal de fond moyenne de chaque valeur de la tige de chaque ROI.
  6. Moyenne les tiges de réplicats techniques, par exemple, article reproduit en utilisant des tissus de l’animal même.
  7. Utiliser la courbe d’étalonnage pour convertir tiges en unités de radioligands, i.e., équivalents de tissu nCi/mg (TE).
    NOTE : Le terme T’est utilisé parce que les normes sont générés avec matériaux simulant de tissu.
  8. Exprimer la liaison par conversion de nCi/mg à nmol/mg TE selon l’activité spécifique du radioligand (équation 1).
    figure-protocol-14569(1)
  9. Pour obtenir les valeurs de liaison spécifique, soustraire non-spécifiques de fixation totale.
  10. Moyenne la liaison de chaque réplication biologique à l’aide de la moyenne de la technique réplique de chaque animal (obtenu à l’étape 5,6).

Résultats

En utilisant le protocole décrit, la répartition anatomique des sites de liaison de haute affinité GHB a été visualisée avec l’analogue GHB radiomarqué [3H] HOCPCA dans le cerveau de souris, qui a été coupé en sections coronales, sagittales et horizontales (Figure 3 ). Des niveaux élevés de liaison ont été observés dans l’hippocampe et le cortex, une liaison plus faible dans le striatum et aucune liaison n’a été détectés da...

Discussion

La qualité d’un test autoradiographique est le plus souvent déterminée par la sensibilité au radioligand. Un facteur important est le radio-isotope sélectionné, qui est indiqué par la disponibilité de ligands connus ou de la faisabilité des techniques spécifiques de l’étiquetage à céder des ligands avec une activité spécifique appropriée (c'est-à-dire, la quantité de radioactivité par mole d’unité un radioligand)23et avec une quantité limitée de dégradation ch...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Remerciements

Le travaux ont été subventionnés par la fondation de Lundbeck (Grant R133-A12270) et le Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Les auteurs remercient Dr Aleš Marek pour la fourniture du radioligand [3H].

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore107017
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mLSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus slidesVWR631-9483microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura Finetek Denmark ApS4451
Tritium Standard on GlasAmerican Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
Xylene substituteSigma-AldrichA5597

Références

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