Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Resumo

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Resumo

Em vitro autoradiografia pretende visualizar a distribuição anatômica de uma proteína de interesse em tecido de animais experimentais, bem como os seres humanos. O método baseia-se a vinculação específica de um radioligantes ao seu alvo biológico. Portanto, seções congeladas do tecido são incubadas com radioligantes solução, e a ligação para o destino é posteriormente localizada por detecção de decaimento radioativo, por exemplo, usando filme fotossensível ou imagem de placas de fósforo. Autoradiograms Digitas resultantes exibem notável resolução espacial, que permite a quantificação e localização da ligação de radioligantes em estruturas anatômicas distintas. Além disso, quantificação permite a caracterização farmacológica de afinidade de ligante através de constantes de dissociação (K_d), constantes de inibição (K_eu), bem como a densidade dos sítios de ligação (B_máx) em tecidos selecionados. Assim, o método fornece informações sobre localização de alvo e seletividade de ligante. Aqui, a técnica é exemplificada com eosina caracterização do ácido de alta afinidade γ-hidroxibutírico (GHB) vinculação sites no tecido do cérebro de mamíferos, com ênfase especial em considerações metodológicas sobre o ensaio parâmetros, a escolha do radioligantes e o método de deteção.

Introdução

Autoradiografia é um método que fornece imagens de decaimento radioativo. A técnica é usada rotineiramente para estudar a distribuição de tecido de uma proteína de interesse em vitro com base em uma interação farmacológica específica entre um composto marcadas com radioisótopos e seu destino. Isto fornece informação directa sobre a seletividade do ligante para o alvo. Em vitro autoradiografia pode também ser utilizada para a determinação quantitativa dos parâmetros de ligação farmacológica de radioligands, tais como a constante de dissociação (K_d) e a densidade dos sítios de ligação (B_máx), bem como para a determinação a constante de inibição (K_i) de concorrentes ligantes^1,2. Comparado aos tradicionais homogenate radioligantes vinculação, autoradiografia tem a vantagem de ser capaz de visualizar a anatomia espacial e dando detalhes sucintas de padrões de expressão regional³. O método de autoradiografia, portanto, é uma alternativa relevante de imunocitoquímica, especialmente na ausência de um anticorpo validado. Autoradiografia é facilmente implementada em um laboratório de radioisótopos padrão dado a disponibilidade de um radioligantes adequado com a necessária especificidade farmacológica, acesso a um criostato micrótomo para a preparação de cortes de tecido e uma imagem adequada dispositivo que é capaz de analisar a distribuição de radioatividade nas seções respectivas tecido. Nomeadamente, um critério importante de seleção para o radioligantes é uma quantidade limitada de ligação a sites não-alvo. Isto pode ser para outras proteínas, membranas ou materiais como plástico ou filtros e é coletivamente conhecido como inespecificas. Geralmente, inespecificas é não saturável, mas podem ser saturável se envolve uma proteína específica de fora do alvo. A melhor forma de validar a verdadeira ligação específica é comparar aos tecidos falta o alvo, por exemplo, geneticamente projetado tecido (nocaute)⁴.

Aqui, a metodologia é ilustrada com a eosina caracterização do sítio de ligação de alta afinidade para ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o cérebro de mamíferos. Compreender a interação farmacológica entre o GHB e o seu sítio de ligação é de relevância como o GHB é uma droga ambos clinicamente útil no tratamento da narcolepsia e alcoolismo⁵, mas, também, um constituinte natural do cérebro de mamíferos e um recreio Droga,⁶. Locais de alta afinidade GHB obrigatórios foram primeiro descritos usando vinculação de GHB [³H] de cérebro de rato homogenate⁷. Ao longo dos anos, mais estudos autoradiografia com [³H] GHB e o análogo [³H] NCS-382 mostrou uma alta densidade de binding sites em regiões prosencéfalo de rato^8,9,10, rato⁹ , cérebro de macaco/humano e¹¹¹²de porco. No entanto, a identidade molecular e a relevância funcional exata desses sites de ligação permaneceram indescritíveis.

Com a intenção de caracterizar ainda mais os sítios de ligação e para facilitar os estudos sobre o papel fisiológico de GHB, foram desenvolvidos vários radioligands, incorporando diferentes isótopos dotados com afinidades diferentes ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA e [¹²⁵eu] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(revisto em¹⁷) (Figura 1). A combinação de radioligands de alta afinidade seletiva e uma densidade muito alta de tecido de binding sites permitiram a produção de imagens de alta qualidade usando o fósforo de imagem técnica^9,11. Juntamente com um resumo dos pontos na criação de uma experiência de eosina e uma ilustração para exemplificar detalhes práticos, a seção de discussão enfatizará i) a escolha do radionuclídeo, ii) a escolha das condições de ensaio e iii) a utilização de fósforo placas de imagem contra a película de raio x. O objetivo geral deste trabalho é fornecer detalhes técnicos, metodológicos e científicos sobre a técnica de autoradiografia para informar sobre a distribuição tecidual e análise farmacológica de alvos de proteína.

Protocolo

Todo animal manipulação foi realizada em conformidade com as diretrizes da Inspetoria de Experimentação Animal dinamarquês.

Nota: O protocolo descrito aqui aborda a preparação do tecido (ou seja, tecido de cérebro de rato), em vitro ensaio eosina em detalhes suficientes para a criação do método em um novo laboratório, a exposição de imagem de placas de fósforo, bem como subsequente análise densitométricos de autoradiograms (Figura 2) com o objetivo de localizar e quantificar radioligantes vinculação em estruturas anatômicas distintas. Para comparação histológica, um protocolo para coloração de cresilo violeta está incluído. Além disso, a determinação de ligação não-específica com um ligante concorrente está incluída dentro do protocolo. Para uma descrição detalhada sobre como determinar K_d, B_máx ou K_eu, consulte anterior publicação⁴.

1. tecido preparação por Cryosectioning

1. Eutanásia o mouse por deslocamento cervical e imediatamente dissecar o cérebro usando uma tesoura e pinça. Diretamente a prosseguir para a próxima etapa para evitar danos aos tecidos.
2. Snap-congelar o tecido por submersão em pó gelo seco, gasoso CO₂ ou isopentano. Transferir diretamente o tecido congelado para um criostato com a temperatura definida como-20 ° C. Alternativamente, armazene o tecido a-80 ° C até o processamento.
   Nota: Evite descongelar/congelamento repetido para reduzir o dano de tecido.
3. Deixe o tecido adaptar à-20 ° C em criostato por 20 min antes de processamento adicional para evitar a ruptura do tecido.
4. Cobrir o suporte do tecido com encastre meio fora do criostato e rapidamente Coloque a amostra de tecido congelado na orientação desejada enquanto meio de encastre é ainda líquido. Por exemplo, coloque o cérebro de rato verticalmente no cerebelo para atingir rostrais secções coronais. Transferir o suporte do tecido para o criostato e expor médio encastre a temperaturas abaixo de-10 ° C para endurecimento.
   Nota: Amostra de tecido frágil deve ser revestida em incorporação médio dentro dos moldes do tecido antes da montagem.
5. Posicione o suporte do tecido em micrótomo do criostato. Ajuste a orientação do tecido para evitar seções inclinadas.
6. Corte o tecido com a orientação de um atlas estereotáxica¹⁸ nas seções da espessura desejada (12 µm recomendado para [³H] rotulados ligantes). Cuidadosamente endireitar e desdobrar a seção com uma escova de tamanho pequeno, se necessário e degelo-monte a seção numa lâmina de microscópio. Sequencialmente, recolha as seções da região de interesse para replicação técnica desejada (por exemplo, 4 seções por slide).
7. Permitir que as seções sobre os slides para secar por 1h antes de manusear ainda mais.
   Nota: Adição de material dessecante para slide caixas minimiza a umidade se acumulam sobre as secções de tecido. Procotol pode ser pausado aqui armazenando seções a longo prazo em caixas de slide a-80 ° C.

2. in vitro autoradiografia

PRECAUÇÃO: radioatividade. Trabalha em um laboratório certificado de acordo com os regulamentos locais. Utilizar vestuário de protecção. Elimine em conformidade com o decaimento radioativo ou terceirizar para uma empresa certificada.

1. Descongele as seções pelo menos 30 min à temperatura ambiente (RT). Rotule os slides com condições experimentais. Use um lápis porque os slides vão ser banhados em álcool etílico durante coloração subsequentes.
2. Coloque as lâminas na horizontal em bandejas plásticas.
   Nota: Slides sobre uma plataforma elevada dentro de bandejas plásticas de posicionamento facilita a sua manipulação.
3. Pre-incubate as seções montadas sobre os slides no buffer de ensaio ajustado ao alvo em questão (para protocolo GHB, 50mm KHPO₄ tampão pH 6.0 é usado) aplicando cuidadosamente um volume adequado para o slide (700 µ l para roedores secções coronais de 3-4).
   Nota: Certifique-se que cada seção é completamente coberta com o líquido.
   1. Cobrir as bandejas de plástico com uma tampa para evitar a evaporação e pre-incubar a temperatura relevante (para o protocolo GHB pre-incubate por 30 min em RT) sob constante suave (20 rpm) agitando um agitador de placa.
   2. Para a determinação da ligação não-específica, suplemento buffer de ensaio com concentração relevante de rotuladas composto (para o protocolo GHB, 1mm GHB).
      Nota: Pré-incubação pode não ser necessário.
4. Decantar o líquido de pré-incubação de cada slide e transferir os slides para a bandeja de plástico.
5. Para evitar a desidratação, incubar imediatamente as seções com concentração relevante de radioligantes no buffer de ensaio sob condições desejadas (para o protocolo GHB, 1 nM [³H] HOCPCA por 1h no RT) cobrindo as seções completamente com o radioligantes solução (700 µ l para roedores secções coronais de 3-4).
   1. Incube sob sob constante suave (20 rpm) tremendo de bandejas plásticas com tampa fechada.
      Nota: A concentração de radioligantes pode ser validada pelo contando uma alíquota em um contador de cintilação líquida.
6. Remover a solução de incubação por decantar o líquido e transfira os slides em um rack de slide de microscópio. Seguir para a próxima etapa para evitar a desidratação da seção.
7. Lave os slides. Para o protocolo GHB, lave com buffer de ensaio gelada duas vezes para 20 s e em seguida enxaguar duas vezes por mergulhar as lâminas em bandejas cheias com água destilada gelada para remover os sais. Posicione os slides verticalmente em racks para secar pelo menos 1 h no RT ou seque os slides por 5 min com um soprador de definir a temperatura fria.
   Nota: A lavagem deve ser otimizada, por exemplo, lavagem extensa pode ser úteis para diminuir inespecificas.
8. Transferi os slides para um fixador externo contendo paraformaldeído (PFA) em pó para fixação da noite com vapores PFA em RT para proteger a integridade do complexo ligante-alvo.
   Atenção: O PFA é tóxico. Fixador de Positionthe no exaustor de fumo e evitar o contato de pele/olho com PFA.
9. No dia seguinte, transfira os slides para uma caixa de dessecador contendo sílica gel para 3h no RT para eliminar a umidade.

3. exposição de placas de fósforo e digitalização

1. Coloca as seções em uma gaveta de placa de imagem blindado radiação com o tecido virado para cima. Para posterior quantificação de radioligantes vinculação, incluem uma microescala [³H] em cada gaveta. Organizar as seções aleatoriamente e expor as seções para comparação directa no mesmo.
2. Apaga o fósforo de trítio sensíveis placa imediatamente antes do uso de imagens, a fim de remover sinais acumulados de armazenamento e para eliminar sinais de fundo. Portanto, carregar a placa na máquina da imagem latente do fósforo e expô-la ao visível/infravermelho luz de acordo com as instruções do fabricante.
3. Retirar a placa da máquina da imagem latente do fósforo e imediatamente coloque-a sobre as seções na gaveta. Certifique-se de que a fita está completamente fechada. Expor as seções para a placa de imagem de fósforo por 3 dias no RT, protegido da luz.
4. Porque a luz apaga sinal da placa de imagem, cuidadosamente Abra a gaveta no escuro e imediatamente transferir a placa de imagem na caixa escura de um Imageador de fósforo ou coloque o tonalizador de fósforo em um quarto escuro.
   Nota: Certifique-se de anotar o arranjo espacial dos slides durante a exposição, a fim de identificar cada amostra na imagem digital após análise. Portanto, placas de imagem de fósforo também exibem um canto cortado num ângulo bem distinto a fim de identificar a orientação correta da placa na imagem digital.
5. Escaneie a placa com a maior resolução possível obter uma imagem digital.

4. opcional: Cresilo coloração violeta de seções do tecido

1. Preparar a solução de cresilo violeta 1% através da mistura de 5 g de acetato de cresilo violeta em 500 mL de água desionizada (dH₂O) até dissolver (aproximadamente 2h). Filtrar por papel de filtro usando um funil em uma nova garrafa de 500 mL. Ajuste o pH a 3,5-3,8.
2. Posição o slide coloração definida sob a coifa. Prepare as bandejas com as seguintes soluções em bandejas de polipropileno brancas (exceto para-xileno):
   r. 50% ethanol/50% dH₂O
   b. 70% ethanol/30% dH₂O
   c. 100% de etanol
   m. 100% de etanol
   e. O 100% dH₂
   f. 1% violeta de cresilo
   g. 0.07% de ácido acético (Adicionar 175 µ l de ácido acético a 250 mL de dH₂O).
   h. 100% xileno em bandejas resistentes a solventes verdes
   i. 100% xileno em bandejas resistentes a solventes verdes
3. Transferir os slides para a coifa e colocá-los em um rack de slide.
4. Dissolva os lipídios através de crescente série graduada de etanol em dH₂O a 100% de etanol (bandeja a-d) mergulhando os slides por 1 min.
5. Hidratar os espécimes para dH₂O através de decrescente concentrações de etanol (bandeja um-d em ordem inversa, seguido de bandeja e) mergulhando os slides por 1 min.
6. Mergulhe as amostras em solução de cresilo violeta por 10 min.
7. Lave os espécimes em 0.07% de ácido acético, levantando os slides acima e para baixo suavemente durante 4-8 s lavar os slides mergulhando na dH₂O por 1 min.
8. Desidratar os espécimes por imersão dos slides por 30 s em crescente concentração de etanol (bandeja a-d).
9. Transferi as amostras através de duas bandejas de 100% de xileno (bandeja h e i) para saciar o etanol.
10. Hidratar os espécimes para dH₂O através de decrescente concentrações de etanol (bandeja um-d em ordem inversa, seguido de bandeja e) mergulhando os slides por 1 min.
11. Remova as lâminas de solução salina com fórceps. Adicionar algumas gotas de solvente orgânico, montagem de mídia por slide e adicionar uma lamínula 24 x 60 mm na parte superior para proteger espécimes. Remova as bolhas de ar entre a amostra e a lamela pressionando suavemente no sentido do lamela.
    Nota: Mantenha as lâminas restantes em xilol durante a montagem para impedir a secagem.
12. Seca os slides durante a noite em uma coifa no RT
13. Obter uma imagem de amostra com um microscópio e objectivo de X 1,25.

5. densitométricos análise de imagem Digital

1. Medir densidades ópticas relativas (hastes) de cada calibração padrão da microescala [³H] com um software de análise de imagem.
   1. Selecione uma área de igual tamanho para cada ponto da microescala [³H] usando uma ferramenta para criação de região de item de menu determinação da região. Atribua um número a cada área selecionada, clicando no número sob o rótulode item de menu.
   2. Exportar os valores de OD para cada ponto de calibração padrão clicando em arquivo | E xportar | relatório 2D região. Transferência de valores de haste para uma planilha e normalizar pelo tamanho da área selecionada. Realize a regressão linear para obter uma curva padrão para uma análise mais aprofundada densitométricos.
      Nota: Certifique-se de que as áreas selecionadas são rotuladas, para identificar os correspondentes valores ROD e amostras.
2. Realizar a quantificação de autoradiograms usando o proprietário software de imagem, selecionando a região de interesse (ROI) usando uma ferramenta de criação de região em cada seção e medindo suas ODs. Selecione a mesma região em cada seção, criando um modelo para a região de interesse, que é copiado e ajustado manualmente para pequenas variações na anatomia do cérebro para cada autoradiogram. Identifica a anatomia do ROI por comparação de autoradiograms com um cérebro atlas¹⁸. Quando vários tratamentos são comparados, efectuar a análise cegos e randomizados para evitar seleção tendenciosa de ROIs.
3. Exportar valores ROD e tamanhos de áreas selecionadas em uma planilha clicando arquivo | E xportar | relatório 2D região.
4. Divida a haste medida do ROI selecionados por sua área para obter a densidade por área específica.
5. Medir a haste do fundo da placa e exportar valores correspondentes de ROD e tamanho da área em uma planilha. Subtrai o sinal do fundo de cada valor de haste de cada ROI.
6. Média as hastes de repetições de técnicas, ou seja, seção Replica usando tecido do mesmo animal.
7. Usar a curva padrão para converter as hastes em unidades de radioligantes binding, i. e., equivalentes de tecido nCi/mg (TE).
   Nota: O termo TE é usado porque as normas são geradas com materiais simulando tecido.
8. Expressam ligação pela conversão do ICN/mg para nmol/mg TE de acordo com a atividade específica do radioligantes (equação 1).
   (1)
9. Para obter valores de ligação específica, subtrai inespecificas de ligação total.
10. Média a vinculação de cada biológico replicar usando a média de técnicos Replica de cada animal (obtido na etapa 5.6).

Resultados

Usando o protocolo descrito, a distribuição anatômica dos sites alta afinidade de ligação GHB foi visualizada com o análogo GHB marcadas com radioisótopos [³H] HOCPCA no cérebro de rato, que foi cortado em secções coronais, sagitais e horizontais (Figura 3 ). Observaram-se altos níveis de vinculação no hipocampo e córtex, ligação inferior no corpo estriado e não foi detectados no cerebelo, correspondente aos padrões de expressão ...

Discussão

A qualidade de um ensaio de eosina mais frequentemente é determinada pela sensibilidade do radioligantes. Um grande fator que contribui é o radioisótopo selecionado, que é dado pela disponibilidade de ligantes conhecidos ou pela viabilidade de técnicas específicas de rotulagem para produzir ligantes com atividade específica apropriada (ou seja, a quantidade de radioatividade por mole de unidade de um radioligantes)²³e com quantidades limitadas de degradação química. Um grande n?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597