3D מודפס נקבובי תאית Nanocomposite הידרוג פיגומים

Summary

שלושת הצעדים הקריטיים של פרוטוקול זה i) מפתחים את ההרכב הנכון ונקבוביות עקביות הדיו הידרוג תאית, ii) 3D הדפסה של פיגומים לתוך שונות מבנים עם נאמנות בכושר טוב, מידות iii) הוכחת תכונות מכניות בתנאים מדומה הגוף עבור התחדשות הסחוס.

Abstract

עבודה זו מדגים את השימוש תלת מימדי (3D) הדפסה כדי לייצר פיגומים מעוקב נקבובי באמצעות תאית nanocomposite הידרוג דיו, עם מבנה בררניים, תכונות מכניות. Nanocrystals תאית (CNCs, 69.62 wt %) הידרוג מבוסס דיו עם מטריקס (alginate נתרן, ג'לטין) פותחה והודפס 3D לתוך פיגומים עם נקבוביות אחיד, צבע מבנה (110-1,100 מיקרומטר). פיגומים הראה דחיסה מודולוס בטווח של 0.20-0.45 MPa כאשר נבדק ב מדומה ויוו התנאים (מים מזוקקים ב 37 מעלות צלזיוס). גודל הנקבוביות, המודולוס דחיסה של פיגומים 3D תואם לדרישות הדרושים ליישומים התחדשות הסחוס. עבודה זו ממחישה כי מרקם של הדיו יכול להיות נשלט על ידי הריכוז של סימנים מקדימים נקבוביות יכול להיות נשלט על ידי תהליך ההדפסה התלת מימדית, שניהם גורמים אלה בתמורה מגדיר את מכניים המאפיינים של 3D מודפס נקבובי הידרוג לגרדום. ניתן להשתמש בשיטה זו תהליך ולכן כדי לבדות פיגומים מבנית, מאלכוהול מותאם אישית בהתאם לצרכים הספציפיים של חולים.

Introduction

תאית היא רב-סוכר המורכב שרשראות ליניארי של β יחידות D-גלוקוז המקושרות (1-4). הפולימר הטבעי הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ והוא מופק מגוון רחב של מקורות, כולל בעלי חיים ימיים (למשל, tunicates), צמחים (למשל, עץ, כותנה, קש חיטה) ומקורות חיידקים, כגון אצות (למשל, Valonia), פטריות, אפילו אמבה (חד-תאיים )^1,2. תאית nanofibers (CNF) ו nanocrystals תאית (CNC) עם ממד אחד לפחות בננו מתקבלים באמצעות טיפולי מכני, חומצה הידרוליזה של תאית. לא רק ברשותם את המאפיינים של תאית, כגון פוטנציאל שינוי כימי, רעילות נמוכה, כימי, מתכלה, מתחדשת, אבל יש גם מאפיינים הננומטרי כמו גבוהה פנים סגולי, תכונות מכניות גבוהה , מאפייני rheological ואופטית. מאפיינים אטרקטיביים אלה הפכו CNFs ו- CNCs מתאים ליישומי ביו, בעיקר בצורה של תלת-ממדי (3D) הידרוג פיגומים³. פיגומים אלו דורשים מידות מותאמות אישית עם מבנה בררניים, נקבוביות מחובררים. הקבוצה שלנו ואחרים דיווחו על תאית נקבובי 3D nanocomposites מוכן דרך הליהוק, electrospinning, ליופיליזציה^4,5,6,7,8. עם זאת, לשלוט על המבנה נקבובית, ייצור של גאומטריה מורכבת אינה מושגת באמצעות שיטות מסורתיות.

הדפסה תלת-ממדית היא טכניקת הייצור מוספים, שבהם עצמים תלת-ממדיים נוצרים שכבה על דרך בתצהיר מבוקר-מחשב של דיו⁹. היתרונות של הדפסת תלת-ממד על טכניקות מסורתיות כולל חופש עיצוב, מאקרו מבוקרת מיקרו מידות, ייצור של ארכיטקטורות מורכבות, התאמה אישית, הפארמצבטית.  בנוסף, הדפסת תלת-ממד של CNFs ו- CNCs מציע גם הטיה-induced מערכים של חלקיקים, העדיפו כיוון, נקבוביות הדרגתיות ניתן להרחיב בקלות ל- 3D bioprinting^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. הדינמיקה של CNCs יישור במהלך הדפסת תלת-ממד כבר דיווח לאחרונה,^16,17. ההתקדמות בתחום של bioprinting יש לאפשר לרקמות מודפס 3D ואיברים למרות האתגר מעורב כגון הבחירה וריכוז של תאים חיים, גורמי גדילה, קומפוזיציה של הדיו המוביל, הדפסה פשוטה, זרבובית קטרים^{18 19, ,20}.

נקבוביות ואת חוזק של פיגומים משובי הסחוס הן תכונות חשובות המכתיבה את היעילות והביצועים שלו. גודל הנקבוביות ממלא תפקיד חשוב עבור אדהזיה, בידול, התפשטות של תאים כמו גם לגבי ההחלפה של חומרים מזינים, פסולת מטבולית²¹. אולם, אין גודל הנקבוביות מובהק זה יכול להיחשב ערך אידיאלי, כמה מחקרים הראה אתריים גבוה עם נקבוביות קטנות יותר בעוד אחרים הראו יותר התחדשות הסחוס עם נקבוביות גדולות יותר. Macropores (< 500 מיקרומטר) להקל על רקמות מינרליזציה, אספקת מזונם, פינוי פסולת, בעוד micropores (150-250 מיקרומטר) להקל על התא מצורף ותכונות מכניות יותר^22,23. לגרדום מושתל חייב להיות מספיק מכנית מימי טיפול, ההשתלה, עד להשלמת מטרתו הרצויה. המודולוס compressive צבירה על הסחוס במפרק טבעי הוא דיווח כי בטווח של 0.1-2 MPa תלוי גיל, מין, מיקום שנבדקו^{4,24,25,26,27 28, ,29}.

שלנו הקודם עבודה¹¹, הדפסת תלת-ממד שימש כדי לפברק נקבובי bioscaffolds של תפור כפול interpenetrating רשת פולימר (IPN) מדיו הידרוג המכיל CNCs מחוזק במטריצה של alginate נתרן, ג'לטין. מסלול הדפסה 3D אופטימלי כדי להשיג פיגומים 3D עם נקבוביות אחיד, הדרגתיות מבנים (80-2,125 מיקרומטר) איפה nanocrystals אוריינט רצוי בכיוון ההדפסה (מידת התמצאות בין 61-76%). . הנה, אנו מציגים המשכיות זה לעבוד ומדגים ההשפעה של נקבוביות על התכונות המכאניות של תלת-ממד מודפס הידרוג פיגומים בתנאי גוף מדומה. CNCs היה כאן, דווחו קודם לכן על ידי אותנו להיות cytocompatible ולא רעיל (קרי, גדילת התאים לאחר 15 ימים של דגירה היה אושרו³⁰). יתר על כן, פיגומים הכין דרך להקפיא ייבוש באמצעות את CNCs אותו, alginate נתרן, ג'לטין הראה נקבוביות גבוהה, גבוהה ספיגת של תמיסת מלח מאגר פוספט, cytocompatibility לעבר גזע mesenchymal⁵. מטרת עבודה זו היא להפגין עיבוד הדיו הידרוג, הדפסת תלת-ממד של פיגומים נקבובי, הבדיקה דחיסה. שרטוטים של המסלול עיבוד מוצג באיור1.

Protocol

1. הכנת מבשרי

1. הכנה של השעיה nanocrystals תאית
   הערה: בידוד של תאית nanocrystals נעשית על פי הנוהל שדווחו על-ידי מתיו, ואח³⁰.
   1. 17 wt % בתרחיף של תאית nanocrystals ל 2% wt על-ידי הוספת מים כדי להפוך את הנפח הכולל של 2 ל' לערבב ביסודיות באמצעות אולטרה sonication ושימוש אצוות קטנות יותר (250-300 מ ל) עבור ערבוב יעיל מזוקקים.
   2. עוברים את המתלים sonified דרך מהמגן 10 פעמים, בלחץ של 500-600 בר. בשלב זה, ג'ל שקוף בעובי של 2 wt % תאית nanocrystals מתקבל.
   3. רכז wt 2% תאית nanocrystals ג'ל ל 11% wt דרך centrifugations ב x 24,500 g עבור ה 1.5 Decant המים בין כל 30 דקות.
      הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן.
2. הכנת מטריצה שלבים
   1. הכן תמיסה הומוגנית של wt 6% alginate נתרן (SA) במים מזוקקים-60 ° C תחת ערבוב רצוף.
   2. הכן תמיסה הומוגנית של wt 12% ג'לטין (ג'ל) במים מזוקקים-60 ° C תחת ערבוב רצוף.
      הערה: להתכונן נפח של 20 מ"ל מטריקס פתרונות ולאחסן במקרר.
3. הכנת crosslinkers
   1. להכין את הפתרון של 3% wt סידן כלורי במים מזוקקים בטמפרטורת החדר תחת ערבוב רצוף.
   2. להכין את הפתרון של 3% wt גלוטראלדהיד במים מזוקקים בטמפרטורת החדר תחת ערבוב רצוף.
      הערה: להתכונן נפח של 50 מ ל פתרונות crosslinking ולאחסן הטמפרטורה בחדר. עיין טבלה של חומרים למידע הספק. ניתן להשהות כאן ניסוי.

2. הכנת הידרוג דיו

1. הכן 40 מ של הידרוג הדיו במיכל פוליסטירן על ידי ערבוב wt 11% CNC, 6 wt % SA ו- wt 12% ג'ל להשיג רטוב (wt %) ההרכב של CNC/SA/ג'ל/מים: 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. מחממים את התערובת עד 40 ° צלזיוס, לערבב עם מרית עד עיסה חלקה, מתקבל.
3. להעביר את התערובת לתוך מזרק 60 מ. להעביר את התערובת דרך סדרה של חרירי עם קטרים שונים לתוך מזרק 60 מ ל אחר, עם העזרה של קלאמפ מכני. חזור על התהליך עד חוטים בצורה חלקה עם הבלטה של הידרוג דיו מתקבלים. להתחיל עם החרירים בקוטר הגדול של 800 מיקרומטר, ואחריו מיקרומטר 600 ו 400 מיקרומטר.
4. בעדינות צנטריפוגה (4000 x g) המזרק עם הידרוג דיו כדי להסיר מילוי אוויר לכוד.
   הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן.

3. מדידה של מאפייני rheological של הידרוג

NTE: לבצע מאפייני rheological באמצעות גאומטריה חלקה של חרוט על צלחת, CP25-2-SN7617, קוטר 25 מ מ, 2 ° הנומינלי בזווית ובגובה הפער 0.05 מ"מ 25 º C.

1. הפעל את rheometer, מדחס אוויר, תיבת בקרת טמפרטורה. אתחל את התוכנה.
2. הר בכלי מדידה rheometer ולהגדיר אפס-gap.
3. הבלטת כ 1 מ"ל של הדיו הידרוג על הפלטפורמה rheometer.
4. למדוד את צמיגות כפונקציה של שיעור הטיה. בחר את הטווח קצב הטיה מ 0.001 עד 1,000.
5. אחרי המדידה נעשית, לנקות את הפלטפורמה rheometer, כלי מדידה. הבלטת 1 מ"ל של הידרוג טריים דיו שוב על הרציף rheometer.
6. למדוד אחסון מודולים (G′), אובדן מודולים (G″) כפי פונקציה של גזירה בתדר של 1 הרץ. בחר את הטווח גזירה מ-10³ עד 10⁷.
7. לאחר השלמת הבדיקות, להעתיק את הנתונים לקובץ טקסט, מגרש עקומות rheological לוגריתמי.

4. תיק לקראת הדפסה תלת-ממדית

הערה: התוכנה Cura 2.4.0 משמש לעיצוב תלת-ממד פיגומים (20 מ מ³) יש שלושה סוגים של הנקבוביות. 1-המדים הנקבוביות של 0.6 מ"מ, 2 אחידה הנקבוביות של 1.0 מ מ 3-צבע הנקבוביות של טווח 0.5-1 מ מ.

1. הורד הקובץ stereolithography (stl) של קובייה מוצקה thingsinverse.com, פתח את הקובץ ב Cura.
2. לחצו על דגם טעון והעברתו X/Y/Z: 0/0/0 מ מ. לחץ על קנה מידה, בטל את הסימון בתיבה עבור קנה מידה אחיד והגדר את הממדים X/Y/Z: 20/20/20 מ מ. לחץ על סובב וסובב את הקוביה על-ידי 45 ° במישור XY.
3. בחלונית ' צד ', זרבובית & חומר, בחר 0.4 מ מ ולהדביק את הפרופיל. בחר Discov3ry מלאה המדפסת.
4. בחלונית ' צד ', בחר מותאמת אישית עבור הגדרת הדפסה. בסעיף איכות , הזן 0.2 מ מ עבור כל המקטעים sub. בסעיף מעטפת , הזן 0 מ מ עבור כל המקטעים sub. בסעיף חומר , הזן 26 ° C עבור טמפרטורה, 1 מ מ קוטר, 100% לזרום. בסעיף מהירות , להזין 30 מ מ/s מהירות הדפסה ו- 120 מ מ/s כמו מהירות נסיעה. בסעיף התמיכה , בטל את סימון התיבה עבור תמיכה לזמינה. בסעיף אדהזיה הצלחת לבנות , בחר את החצאית, להזין 3 מ מ כמו חצאית מרחק של 150 מ מ אורך החצאית/ברים מינימום.
5. על פיגומים עם גודל הנקבוביות אחיד, הזן 0.6 או 1 מ מ מרחק קו Infill ובחרו תבנית Infill רשת.
6. פיגומים נקבוביות הדרגתיות, מיזוג וקיבוץ הכלי משמש. קליק ימני המודל טעון, בחר במספר דגמים, הזינו 2 תעיבק קנה המידה של כל דגם כמו X/Y/Z: 20/20/7 מ"מ. מניחים הדגמים אחד על גבי השני. הזן מרחק קו Infill 0.3, 0.5, 0.7 מ מ התחתון, התיכון ודגם טופ, בהתאמה. בחר כל שלושת הדגמים (Ctrl + A), קליק ימני ולחץ על קבוצת מודלים.
7. לשמור את המודלים שבכרטיס בטוח דיגיטלי (SD). Cura לשמור באופן אוטומטי את הקובץ gcode הוא לקריאה על-ידי המדפסת.

5. 3D הדפסה פיגומים נקבובי

1. להכניס את הצינור העברה בעל זרבובית, להתחבר אליו 400 זרבובית מיקרומטר. רמת הצלחת לבנות כדי לקבל את המרחק הנכון בין הצלחת לבנות ו זרבובית.
2. לטעון את המזרק centrifuged לתוך הדיו וחבר אותו לצד השני של הצינור העברה.
3. הכנס את כרטיס ה-SD לתוך המדפסת, בחר נקה מהר ולהתחיל מנקה את הדיו הידרוג עד שהוא מתחיל הבלטה של הצינור. המשך טיהור למשך 2-3 דקות לקבל זרם הומוגנית.
4. של כרטיס ה-SD, בחר קבצים שנשמרו עבור פיגומים נקבוביות אחיד ולא הדרגתי ולהתחיל הדפסה. לפקוח עין על שיעור ההבלטה. במידת הצורך, התאם את מהירות וקצב זרימת בהתאם. לשימוש גודל הנקבוביות קטן יותר, מהירות גבוהה יותר בשילוב עם קצב הזרימה נמוך (50 מ מ/s ו-70%).
   הערה: אל תיגע פיגומים מודפס 3D.

6. Crosslinking של תלת-ממד מודפס פיגומים

1. בתום ההדפסה התלת-ממד, בעדינות להוסיף טיפות של wt 3% CaCl₂ אל הגרדום עד שיהפוך רטוב לגמרי. המתן 5 דקות.
2. להעביר בזהירות רבה לגרדום מהמדפסת במיכל 50 מ ל מלא wt 3% CaCl₂. תשאיר את זה בן לילה.
3. לשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים ולהעביר לגרדום מיכל 50 מ עם 3 wt % גלוטראלדהיד מילוי. תשאיר את זה בן לילה.
4. לשטוף ביסודיות ולאחסן לגרדום מודפס 3D במים מזוקקים.

7. דחיסת בדיקות

הערה: בצע דחיסה בדיקות עם תא מטען N 100 במים ב 37 º C.

1. למלא את המיכל מצויד דחיסה מועמסת צלחת הבסיס עם 2 ל' מים ולהתחיל מערכת החימום כדי להגיע 37 מעלות צלזיוס.
2. לאתחל את התוכנה Bluehill יוניברסל ולהגדיר את שיטת הבדיקה. בחר הדגימה מלבני הגיאומטריה ובחר את האפשרות להזין מידות לפני בדיקת כל דגימה.  הגדר את קצב זן 2 מ"מ/min וסוף תוצאה כמו זן compressive 80% יחד עם כוח N 90.
3. באזור ' מידות ', בחר כוח, עקירה, מתח compressive, זן compressive. בחר באפשרות כדי לייצא נתונים כקבצי טקסט להתוויה בעתיד.
4. להגדיר נקודת האפס הרחבה באמצעות הפקדים jog להוריד צלחת גלגל נוהג קרוב ככל האפשר ללוחית.
5. למדוד ורשום את הממדים של הדגימות להיבדק.
6. טמפרטורת המים מגיעה ל- 37 ° C, מניחים את הדגימה על הבסיס.  אבטח את הדגימה על-ידי הזזת את הצלחת גלגל נוהג כך הוא מתחיל לגעת המדגם.
7. להזיז את המים הרותחים, כך הצלחות עם באמצע המדגם אותם שקועים בתוך המים.
8. הזן מדגם וממדיו. התחל את הבדיקה.
9. בתום הבדיקה, קודם להעביר את המים הרותחים למטה ולאחר מכן הרם את הצלחת גלגל נוהג.
10. להסיר את הדגימה וחתיכות שלה, אם בכלל, לנקות את הצלחות בשני ולטעון מדגם חדש.
11. לאחר כל הדגימות נבדקים, לייצא את הנתונים הגולמיים. מגרש מתח compressive נ' זן compressive עקומות ולקבוע המודולוס המשיק compressive-עומס בערכים של 1-5% ל- 25-30%.
    הערה: הנח את הקוביה הדרגתי כך כי החורים גדולים יותר מול צלחת הבסיס של נייר מכתבים.
    תחילה לאבטח לגרדום בין אוחז, ואז התחל/הפסק המדידה.

תוצאות

CNCs מבוסס nanocomposite הידרוג דיו מראה של גזירה-ניוטונית חזקים דליל התנהגות (איור 2). צמיגות לכאורה של 1.55 × 10⁵ Pa.s בקצב הטיה נמוך (0.001 s^-1) טיפות על ידי חמישה סדרי גודל לערך של Pa.s 22.60 בקצב הטיה של 50 s^-1 (≈50 s^-1 להיות שיעור טיפוסי הטיה מנוסים במהלך הדפסת תלת-מ?...

Discussion

הדפסה תלת-ממדית דורש מתאימים מאפייני rheological הידרוג הדיו. הדיו צמיגות גבוהה ידרוש בלחצים קיצוניים לשחול שלה בזמן צמיגות נמוכה דיו לא ישמור על צורתו לאחר שחול. צמיגות של הדיו הידרוג יכול להיות נשלט באמצעות הריכוז של החומרים. לעומת שלנו הקודם עבודה¹¹, התוכן מוצק של הדיו הידרוג הוא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%