3D imprimés Cellulose poreuse Nanocomposite Hydrogel échafaudages

Résumé

Les trois étapes essentielles du présent protocole sont i) développer la bonne composition et des pores de cohérence de l’encre d’hydrogel de cellulose, ii) 3D impression d’échafaudages dans diverses structures avec fidélité de bonne forme et de dimensions et d’iii) démonstration de la propriétés mécaniques dans des conditions simulées de corps pour la régénération du cartilage.

Résumé

Ce travail démontre l’utilisation des trois dimensions (3D) impression pour produire des échafaudages cubes poreux à l’aide de cellulose nanocomposite hydrogel d’encre, avec la structure de pore contrôlé et les propriétés mécaniques. Nanocristaux de cellulose (CNCs, 69,62 % en poids) encre base hydrogel avec matrice (alginate de sodium et gélatine) a été développé et 3D imprimés en échafaudages avec structure de pores uniforme et dégradé (110-1 100 µm). Les échafaudages ont montré le module de compression de l’ordre de 0,20 à 0,45 MPa lors d’essai simulé des conditions in vivo (dans l’eau distillée à 37 ° C). La taille des pores et le module de compression des échafaudages 3D mis en correspondance avec les exigences requises pour les applications de régénération du cartilage. Ce travail démontre que la cohérence de l’encre peut être contrôlée par la concentration des précurseurs et porosité peut être contrôlée par le procédé d’impression 3D et ces deux facteurs définit en retour la mécanique propriétés du 3D imprimés poreux échafaudage d’hydrogel. Cette méthode de processus peut donc servir pour fabriquer leur structure et une composition personnalisée selon les besoins spécifiques des patients.

Introduction

Cellulose est un polysaccharide composé de chaînes linéaires de β liées unités de D-glucose (1-4). C’est le plus abondant polymère naturel sur terre et est extraite de diverses sources, y compris les animaux marins (p. ex., tuniciers), plantes (bois, coton, paille de blé) et des sources bactériennes, telles que les algues (p. ex., Valonia), les champignons et même amibe (protozoaires )^1,2. Nanofibres cellulose (CNF) et les nanocristaux de cellulose (CNC) au moins une dimension à échelle nanométrique est obtenus par hydrolyse acide de la cellulose et de traitements mécaniques. Ils possèdent non seulement les propriétés de la cellulose, tels que les possibilités de modification chimique, faible toxicité, biocompatibilité, biodégradable et renouvelable, mais il possède également des caractéristiques de l’échelle nanométrique comme haute surface spécifique, des propriétés mécaniques élevées , les propriétés rhéologiques et optiques. Ces propriétés attrayantes ont fait CNFs et CNCs adapté aux applications biomédicales, principalement sous la forme de 3 dimensions (3D) hydrogel échafaudages³. Ces échafaudages nécessitent des dimensions personnalisées avec la structure de pore contrôlé et porosité interconnectée. Notre groupe et autres ont signalé des nanocomposites de cellulose poreuse 3D préparé par coulée, électrofilage et lyophilisation^4,5,6,7,8. Cependant, contrôler sur la structure de pore et fabrication de géométrie complexe n’est pas atteint par le biais de ces techniques traditionnelles.

L’impression 3D est une technique de fabrication additive, dans lequel les objets 3D sont créés couche par couche par le dépôt contrôlé par ordinateur de l' encre⁹. Les avantages de l’impression 3D sur les techniques traditionnelles inclut la liberté de conception, contrôlé macro et micro dimensions, fabrication des architectures complexes, de personnalisation et de reproductibilité.  En outre, l’impression 3D du CNFs et CNCs offre également induite par le cisaillement des alignements des nanoparticules, préféré la directionnalité, porosité dégradée et peut facilement être étendu à 3D bioprinting^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. la dynamique du CNCs alignement lors de l’impression 3D a été rapporté récemment,^16,17. Avancées dans le domaine de bioprinting ont activer 3D tissus imprimés et organes malgré le défi impliqué comme choix et concentration des cellules vivantes et des facteurs de croissance, la composition de l’encre de transporteur, impression des pressions et des diamètres de buse^{18 ,19,20}.

La porosité et la résistance à la compression des échafaudages de régénération du cartilage sont des propriétés importantes qui dicte son efficacité et sa performance. Taille des pores joue un rôle important pour l’adhérence, la différenciation et la prolifération des cellules ainsi que pour l’échange de nutriments et de déchets métaboliques²¹. Cependant, il n’y a aucune taille de pore précise qui peut être considéré comme une valeur idéale, certaines études ont montré bioactivité supérieure avec des pores plus petits tandis que d’autres ont montré la meilleure régénération du cartilage avec des pores plus grands. Macropores (< 500 µm) faciliter la minéralisation des tissus, l’apport en nutriments et enlèvement des déchets, tandis que les micropores (150-250 µm) faciliter la fixation des cellules et meilleures propriétés mécaniques^22,23. L’échafaud implanté doit avoir une intégrité mécanique suffisante du temps de manutention, implantation et jusqu'à l’achèvement de son but désiré. Le module de compression global pour le cartilage articulaire naturel est signalé à être de l’ordre de 0,1-2 MPa selon l’âge, le sexe et emplacement testé^{4,24,25,26,27 ,28,29}.

Dans notre précédent travail¹¹, impression 3D a été utilisée pour fabriquer bioscaffolds poreux d’un double réticulé imbriques réseau polymère (IPN) d’une encre d’hydrogel contenant CNCs renforcées dans une matrice d’alginate de sodium et de la gélatine. La voie de l’impression 3D a été optimisée pour atteindre des échafaudages 3D avec pores uniforme et gradient de structures (80-2 125 µm) où nanocristaux oriente de préférence dans le sens d’impression (degré d’orientation entre 61 à 76 %). Ici, nous présentons la poursuite de ce travail et montre l’effet de la porosité sur les propriétés mécaniques de la 3D imprimés hydrogel échafaudages dans des conditions simulées de corps. CNCs utilisés ici, ont été précédemment rapporté par nous à être cytocompatible et non toxiques (p. ex., la croissance cellulaire après 15 jours d’incubation a été confirmé³⁰). En outre, échafaudages préparé par lyophilisation utilisant le même CNCs, alginate de sodium et de la gélatine a montré une porosité élevée, consommation élevée de solution saline tampon phosphate et cytocompatibility vers les cellules souches mésenchymateuses⁵. L’objectif de ce travail est de démontrer la transformation d’encre hydrogel, l’impression 3D d’échafaudages poreux et les essais de compression. Schémas de l’itinéraire de traitement est illustré à la Figure 1.

Protocole

1. préparation des précurseurs

1. Préparation de la suspension de nanocristaux de cellulose
   NOTE : Isolement des nanocristaux de cellulose se fait conformément à la procédure rapportée par Mathew, et al.,³⁰.
   1. Suspension 17 diluée de % wt de nanocristaux de cellulose à 2 % en poids en ajoutant distillée d’eau pour obtenir un volume total de 2 L. mélanger soigneusement avec des lots plus petits (250-300 mL) ultra sonication et utilisation pour un mixage efficace.
   2. Passer la suspension sonified par le biais de l’homogénéisateur 10 fois à une pression de 500 à 600 bar. À ce stade, un gel transparent épais de nanocristaux de cellulose 2 wt % est obtenu.
   3. Concentré à 2 % de cellulose du wt nanocristaux de gel à 11 % en poids par centrifugations à 24 500 x g pendant 1,5 h. décanter l’eau entre chaque 30 min.
      Remarque : L’expérience peut être suspendu ici.
2. Préparation des phases de matrice
   1. Préparer une solution homogène 6 wt % d’alginate de sodium (SA) dans l’eau distillée à 60 ° C sous agitation continue.
   2. Préparer une solution homogène de 12 wt % de gélatine (Gel) dans l’eau distillée à 60 ° C sous agitation continue.
      NOTE : Préparer un volume de 20 mL pour les solutions de matrice et mettre au réfrigérateur.
3. Préparation des agents Réticulants
   1. Préparer la solution 3 wt % de chlorure de calcium dans l’eau distillée à température ambiante sous agitation continue.
   2. Préparer la solution de glutaraldéhyde à % wt 3 dans l’eau distillée à température ambiante sous agitation continue.
      NOTE : Préparer un volume de 50 mL pour les solutions de réticulation et stocker à température ambiante. Se référer à la Table des matières pour les informations sur le fournisseur. Expérience peut être suspendu ici.

2. préparation de l’encre d’hydrogel

1. Préparer les 40 mL d’encre hydrogel dans un récipient en polystyrène en mélangeant 11 wt % CNC, 6 wt % SA et 12 % en poids de Gel pour obtenir un humide (% poids) composition du CNC/SA/Gel/eau : 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. Porter le mélange à 40 ° C et mélanger avec une spatule jusqu'à l’obtention d’une pâte lisse.
3. Transférer le mélange dans une seringue de 60 mL. Passer le mélange à travers une série de buses de différents diamètres dans une autre seringue de 60 mL, à l’aide d’une pince mécanique. Répétez l’opération jusqu'à obtient des filaments en douceur extrudés d’encre hydrogel. Commencez avec la buse et le plus grand diamètre de 800 µm, suivie de 600 µm à 400 µm.
4. Doucement la centrifugeuse (4 000 x g) la seringue remplie avec de l’encre d’hydrogel pour supprimer air emprisonné.
   Remarque : L’expérience peut être suspendu ici.

3. mesure des caractéristiques rhéologiques d’hydrogel

NTE : Exécuter les propriétés rhéologiques à l’aide d’une géométrie de cône-sur-plaque lisse, CP25-2-SN7617, diamètre 25 mm, 2 ° angle nominal et la hauteur de l’écart 0,05 mm à 25 ° C.

1. Allumez le rhéomètre, le compresseur d’air et le boîtier de commande de température. Initialiser le logiciel.
2. Monter l’appareil de mesure dans le rhéomètre et affectez zéro-gap.
3. Extruder environ 1 mL d’encre sur la plateforme de rhéomètre hydrogel.
4. Mesure de la viscosité en fonction de la vitesse de cisaillement. Sélectionnez la plage de taux de cisaillement de 0.001 à 1 000.
5. Une fois la mesure terminée, nettoyer la plate-forme rhéomètre et outil de mesure. Extruder 1 mL d’encre hydrogel frais encore une fois sur la plate-forme de rhéomètre.
6. Mesurer la perte modules (G″) et modules de stockage (G′) comme une fonction de la contrainte de cisaillement à une fréquence de 1 Hz. Sélectionnez la plage de la contrainte de cisaillement de 10³ 10⁷.
7. Une fois les tests terminés, copier les données dans le fichier texte et tracer les courbes rhéologiques en échelle logarithmique.

4. déposer la préparation pour l’impression 3D

Remarque : Logiciel de Cura 2.4.0 est utilisé pour la conception des échafaudages 3D (20 mm³) ayant trois types de pores. 1-uniform pores de 0,6 mm, 2-uniforme pores de 1,0 mm et gradient de 3 pores de gamme 0,5 à 1 mm.

1. Télécharger fichier de stéréolithographie (stl) d’un cube solid depuis thingsinverse.com et ouvrez le fichier dans Cura.
2. Cliquez sur le modèle chargé et déplacez-le à X/Y/Z : 0/0/0 mm. Cliquez sur échelle, décochez la case pour la mise à l’échelle uniforme et de définir les dimensions de X/Y/Z : 20/20/20 mm. Cliquez sur faire pivoter et tourner le cube à 45 ° dans le plan XY.
3. Dans le panneau latéral, buse & matériel, sélectionnez 0,4 mm et coller le profil. Sélectionnez l’imprimante Discov3ry complet .
4. Dans le panneau latéral, sélectionnez personnalisé pour la Configuration de l’impression. Au chapitre de la qualité , entrez 0. 2 mm pour toutes les sous-sections. Sous section de Shell , entrez 0 mm pour toutes les sous-sections. Rubrique matériel , entrez 26 ° C de température, flux de 1 mm de diamètre et 100 %. Au chapitre de la vitesse , entrez 30 mm/s Vitesse d’impression et de 120 mm/s en Vitesse de déplacement. En vertu de la section de l’appui , décochez la case pour Activer la prise en charge. Conformément à l’article Construire plaque adhérence , sélectionnez jupe, entrez 3 mm distance de Jupe et 150 mm longueur Jupe/ras bord Minimum.
5. Pour échafaudages avec la taille des pores uniforme, entrez 0,6 1 mm Distance de ligne de remplissage , puis sélectionnez Remplissage de grille.
6. Pour les échafaudages de gradient de porosité, fusion et regroupement outil sont utilisé. Faites un clic droit sur le modèle chargé, certains Modèles multiples, entrez 2 et appuyez sur OK. Chaque maquette comme X/Y/Z : 20/20/7 mm. placer les modèles sur le dessus de l’autre. Entrez Distance de ligne de remplissage 0,3, 0,5 et 0,7 mm pour modèle bas, moyen et supérieur, respectivement. Sélectionnez les trois modèles (Ctrl + A), faites un clic droit et cliquez sur Modèles de groupe.
7. Enregistrez les modèles sur la carte que Digital (SD). Cura enregistrer automatiquement le fichier gcode qui est lue par l’imprimante.

5. 3D impression échafaudages poreux

1. Insérez le tube de transfert dans le porte-buse et 400 µm buse y connecter. Niveau de la plaque de construction pour obtenir la bonne distance entre la plaque de construction et de la buse.
2. Charger la seringue centrifugée dans la cartouche et le connecter à l’autre côté du tube de transfert.
3. Insérez la carte SD dans l’imprimante, sélectionnez purger rapidement et commencer à purger l’encre hydrogel jusqu'à ce qu’il commence à extruder de la buse. Poursuivre la purge pendant 2-3 min afin d’obtenir un flux homogène.
4. De la carte SD, sélectionnez les fichiers enregistrés pour échafaudages uniforme et gradient de porosité et lancer l’impression. Gardez un oeil sur le taux d’extrusion. Si nécessaire, ajuster le taux de vitesse et le débit en conséquence. Pour la taille des pores plus petit, utilisez une vitesse plus rapide combinée à faible débit (50 mm/s et 70 %).
   Remarque : Ne touchez pas les échafaudages imprimés 3D.

6. la réticulation de 3D imprimés échafaudages

1. Après que l’impression 3D est terminée, ajouter doucement gouttes de 3 % en poids CaCl₂ au supplice jusqu'à ce qu’il devienne complètement mouillée. Attendre 5 min.
2. Transvasez très soigneusement l’échafaud de l’imprimante à un réservoir de 50 mL rempli de 3 % en poids de CaCl₂. Laisser la nuit.
3. Laver soigneusement avec de l’eau distillée et transférer l’échafaud dans un réservoir de 50 mL, rempli de 3 wt % de glutaraldéhyde. Laisser la nuit.
4. Laver soigneusement et entreposer l’échafaud imprimé 3D dans l’eau distillée.

7. essais de compression

Remarque : Effectuez des essais de compression avec 100 peson de N dans l’eau à 37 ° C.

1. Remplissez le réservoir équipé avec plaque de base de compression submersible avec 2 L d’eau et de démarrer le système de chauffage pour atteindre 37 ° C.
2. Initialiser le logiciel Bluehill universel et mis en place la méthode d’essai. Géométrie rectangulaire spécimen, choisissez l’option d’entrer les dimensions avant de tester chaque échantillon.  Définir la vitesse de déformation à 2 mm/min et à la fin du résultat comme 80 % de déformation compressive avec 90 force N.
3. Dans la section de mesure , sélectionnez la force, de déplacement, de contrainte de compression et de compression souche. Choisissez l’option pour exporter les données sous forme de fichiers texte pour le futur tracé.
4. Définit le point d’extension zéro en utilisant le jog pour abaisser la plaque de crosse aussi près que possible de la plaque de base.
5. Mesurer et noter les dimensions des échantillons à tester.
6. Lorsque la température atteint 37 ° C, placez l’échantillon sur la plaque de base.  Fixez l’échantillon par le déplacement de la plaque de crosse afin qu’il commence à toucher l’échantillon.
7. Remonter l’eau du bain, afin que les plaques avec l’entre-deux échantillon eux sont immergés dans l’eau.
8. Entrez les dimensions et le nom de l’échantillon. Démarrez le test.
9. Une fois le test terminé, tout d’abord descendre l’eau du bain et puis soulever la plaque de crosse.
10. Retirer l’échantillon et ses pièces, cas échéant, nettoyer les deux plaques et charger un nouvel échantillon.
11. Après que tous les échantillons sont testés, exporter les données brutes. Tracer une contrainte de compression vs courbes déformation compressive et déterminer le module tangent compression à des valeurs de la souche de 1 à 5 % et 25 à 30 %.
    Remarque : Placez le cube dégradé de telle sorte que les plus grands trous face à la plaque de base de papeterie.
    Tout d’abord garantir l’échafaud entre les poignées et ensuite démarrer/arrêter la mesure.

Résultats

CNCs basés nanocomposite hydrogel encre montre un fort cisaillement non newtoniens amincissement comportement (Figure 2a). La viscosité apparente de 1,55 × 10⁵ Pa.s à un taux de cisaillement faible (0,001 s^-1) descend de cinq ordres de grandeur d’une valeur de 22,60 Pa.s à un taux de cisaillement de 50 s^-1 (≈50 s^-1 étant un taux de cisaillement typique expérimenté lors de l’impression 3D)³¹ . L...

Discussion

L’impression 3D nécessite adaptés rhéologiques de l’encre d’hydrogel. L’encre de haute viscosité auront besoin des pressions extrêmes pour son extrusion tandis qu’encre faible viscosité ne maintiendra pas sa forme après extrusion. La viscosité de l’encre hydrogel peut être contrôlée par la concentration des ingrédients. Par rapport à notre précédent travail¹¹, la teneur en matières solide de l’encre hydrogel est augmenté de 5,4 à 9,9 % de poids résultant à l’enc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%