3D stampato cellulosa porosa dell'idrogelo Nanocomposite ponteggi

Riepilogo

I tre passaggi critici del presente protocollo sono i) sviluppare la giusta composizione e consistenza dell'inchiostro cellulosa idrogel, ii) stampa di ponteggi in vari 3D poro strutture con fedeltà di buona forma e dimensioni e iii) dimostrazione della Proprietà meccaniche in condizioni simulate di corpo per la rigenerazione della cartilagine.

Abstract

Questo lavoro viene illustrato l'utilizzo della stampa tridimensionale (3D) per produrre porosi ponteggi cubi utilizzando inchiostro di idrogel di cellulosa nanocompositi, con struttura di poro controllata e proprietà meccaniche. Nanocristalli di cellulosa (CNCs, 69,62 wt %) inchiostro base idrogel con matrice (alginato di sodio e gelatina) è stato sviluppato e 3D stampato in impalcature con struttura uniforme e gradienti poro (110-1.100 µm). I ponteggi ha mostrato modulo di compressione nella gamma di 0.20-0.45 MPa quando testati simulato condizioni in vivo (in acqua distillata a 37 ° C). Le dimensioni dei pori e il modulo di compressione di impalcature 3D abbinato con i requisiti necessari per le applicazioni di rigenerazione della cartilagine. Questo lavoro dimostra la coerenza dell'inchiostro può essere controllata dalla concentrazione dei precursori e porosità può essere controllato tramite il processo di stampa 3D che entrambi questi fattori definisce in cambio meccanico proprietà del 3D stampato poroso impalcatura di idrogel. Questo metodo processo può pertanto essere utilizzato per fabbricare ponteggi strutturalmente e compositivamente su misura secondo le esigenze specifiche dei pazienti.

Introduzione

La cellulosa è un polisaccaride costituito da catene lineari di β (1-4) unità di D-glucosio collegati. È il polimero naturale più abbondante sulla terra ed è estratta da una varietà di fonti, tra cui animali marini (ad es., tunicati), piante (ad esempio, legno, cotone, paglia di grano) e fonti batteriche, come anche ameba (protozoi, funghi e alghe (ad es., Vallonea) )^1,2. Nanofibre di cellulosa (CNF) e cellulosa nanocristalli (CNC) con almeno una dimensione su scala nanometrica sono ottenuti mediante idrolisi acida da cellulosa e trattamenti meccanici. Essi non solo possiede le proprietà di cellulosa, come ad esempio potenziale modificazione chimica, bassa tossicità, biocompatibilità, biodegradabile e rinnovabile, ma ha anche caratteristiche su scala nanometrica come elevata superficie specifica, elevate proprietà meccaniche , proprietà reologiche e ottiche. Queste proprietà attraente hanno fatto CNFs e CNCs adatto per applicazioni biomediche, principalmente sotto forma di 3-dimensionale (3D) idrogel ponteggi³. Queste impalcature richiedono dimensioni su misura con struttura di poro controllata e porosità interconnesse. Il nostro gruppo e altri hanno riportato 3D cellulosa porosa nanocompositi preparati attraverso casting, elettrofilatura e liofilizzazione^4,5,6,7,8. Tuttavia, controllare la struttura dei pori e la fabbricazione di geometria complessa non avviene attraverso queste tecniche tradizionali.

La stampa 3D è una tecnica di produzione additiva, in cui vengono creati oggetti 3D a strati attraverso la deposizione di inchiostro⁹controllati dal computer. I vantaggi della stampa 3D rispetto alle tecniche tradizionali include la libertà di progettazione, controllata macro e micro dimensioni, realizzazione di architetture complesse, la personalizzazione e la riproducibilità.  Inoltre, la stampa 3D di CNFs e CNCs offre anche indotta da taglio allineamenti delle nanoparticelle, preferito direzionalità, gradiente porosità e può essere facilmente esteso al 3D multimateriali^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. recentemente, la dinamica di CNC allineamento durante la stampa 3D è stato riferito che^16,17. Gli avanzamenti nel campo della multimateriali hanno attivare 3D stampati tessuti e organi nonostante la sfida coinvolto come scelta e la concentrazione di cellule viventi e fattori di crescita, composizione dell'inchiostro vettore, stampa di pressioni e diametri ugello^{18 ,19,20}.

La porosità e la resistenza alla compressione di ponteggi rigenerativa della cartilagine sono proprietà importanti che determina la sua efficienza e prestazioni. Dimensione dei pori svolge un ruolo importante per l'adesione, la differenziazione e la proliferazione delle cellule come pure per quanto riguarda lo scambio di sostanze nutritive e rifiuti metabolici²¹. Tuttavia, non esiste una dimensione definita poro che può essere considerata come un valore ideale, alcuni studi hanno mostrato maggiore bioattività con pori più piccoli, mentre altri hanno mostrato migliore rigenerazione della cartilagine con pori più grandi. Macropori (< 500 µm) facilitare la mineralizzazione del tessuto, apporto di sostanze nutritive e rimozione dei rifiuti mentre micropori (150-250 µm) facilitano l'adesione delle cellule e migliori proprietà meccaniche^22,23. L'impalcatura impiantato dovrà avere sufficiente integrità meccanica dal momento della manipolazione, l'impianto e fino al completamento dello scopo desiderato. Il modulo di compressione aggregato per naturale della cartilagine articolare è segnalato per essere nella gamma di 0.1-2 MPa a seconda di età, sesso e posizione valutata^{4,24,25,26,27 ,28,29}.

Nel nostro precedente lavoro¹¹, stampa 3D è stata utilizzata per fabbricare poroso bioscaffolds di un doppio reticolato compenetrante reticolo polimerico (IPN) da un inchiostro di idrogel contenenti CNCs rinforzato in una matrice di gelatina e di alginato di sodio. Via della stampa 3D è stata ottimizzata per ottenere scaffold 3D con strutture di poro uniforme e sfumatura (80-2.125 µm) dove nanocristalli orientano preferibilmente in direzione stampa (grado di orientamento tra 61-76%). Qui, vi presentiamo la continuazione di questo lavoro e viene illustrato l'effetto della porosità sulle proprietà meccaniche del 3D stampato idrogel impalcature in condizioni simulate di corpo. CNC usata qui, sono stati in precedenza riferito da noi di essere citocompatibili e non tossico (cioè, crescita cellulare dopo 15 giorni di incubazione è stato confermato³⁰). Inoltre, la impalcature preparato tramite liofilizzazione utilizzando lo stesso CNCs, alginato di sodio e gelatina hanno mostrato elevata porosità, alto assorbimento di soluzione salina tampone fosfato e citocompatibilità verso cellule staminali mesenchimali⁵. L'obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l'elaborazione di inchiostro di idrogel, stampa 3D di scaffold porosi e le prove di compressione. Schemi del percorso di elaborazione è illustrato nella Figura 1.

Protocollo

1. preparazione dei precursori

1. Preparazione della sospensione di nanocristalli di cellulosa
   Nota: Isolamento della cellulosa nanocristalli avviene secondo la procedura segnalata da Mathew, et al.³⁰.
   1. Diluire 17 wt % di sospensione di nanocristalli di cellulosa a 2% in peso con l'aggiunta di acqua distillata per rendere un volume totale di 2 L. Mix accuratamente utilizzando ultra (250-300 mL) sonicazione e uso di lotti più piccoli per la miscelazione efficiente.
   2. Passare la sospensione sonified attraverso l'omogeneizzatore 10 volte ad una pressione di 500-600 bar. A questo punto, si ottiene un gel trasparente spesso di 2 wt % cellulosa nanocristalli.
   3. Concentrato 2 wt % cellulosa nanocristalli NAD a 11 wt % attraverso centrifugazioni a 24.500 x g per 1,5 h. decantare acqua fuori tra ogni 30 min.
      Nota: Esperimento può essere messo in pausa qui.
2. Preparazione delle fasi di matrice
   1. Preparare soluzione omogenea di 6 wt % sodio alginato (SA) in acqua distillata a 60 ° C sotto agitazione continua.
   2. Preparare soluzione omogenea di gelatina di 12 wt % (Gel) in acqua distillata a 60 ° C sotto agitazione continua.
      Nota: Preparare un volume di 20 mL per soluzioni matrix e conservare in frigorifero.
3. Preparazione di reticolanti
   1. Preparare la soluzione 3 wt % di cloruro di calcio in acqua distillata a temperatura ambiente sotto agitazione continua.
   2. Preparare la soluzione di 3% di glutaraldeide wt in acqua distillata a temperatura ambiente sotto agitazione continua.
      Nota: Preparare un volume di 50 mL per soluzioni di reticolazione e conservare a temperatura ambiente. Fare riferimento alla Tabella materiali per informazioni sul fornitore. Esperimento può essere messo in pausa qui.

2. preparazione dell'inchiostro di idrogel

1. Preparare 40 mL di inchiostro di idrogel in un contenitore di polistirolo con 11 wt % CNC, 6 wt % SA e 12 wt % Gel per ottenere un umido (wt %) composizione di CNC/SA/Gel/acqua: 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. Scaldare il composto a 40 ° C e mescolare con una spatola fino ad ottenuta una pasta liscia.
3. Trasferire il composto in una siringa da 60 mL. Passare il composto attraverso una serie di ugelli con diametri diversi in un'altra siringa da 60 mL, con l'aiuto della pinza meccanica. Ripetere il processo fino a quando sono ottenuti senza intoppi estrusi filamenti di idrogel inchiostro. Iniziare con ugello con diametro più grande di 800 µm, seguita da 600 µm e 400 µm.
4. Delicatamente la centrifuga (4.000 x g) la siringa riempita con inchiostro di idrogel per rimuovere intrappolata aria.
   Nota: Esperimento può essere messo in pausa qui.

3. misurazione delle proprietà reologiche di idrogel

NTE: Eseguire le proprietà reologiche utilizzando una geometria cono su piastra liscia, CP25-2-SN7617, diametro 25 mm, 2 angolo nominale ° e altezza del traferro 0,05 mm a 25 ° C.

1. Attivare il reometro, compressore d'aria e scatola di controllo di temperatura. Inizializzare il software.
2. Montare lo strumento di misura in reometro e impostare zero-gap.
3. Estrudere circa 1 mL di inchiostro sulla piattaforma reometro idrogel.
4. Misurare la viscosità in funzione della velocità di taglio. Selezionare la gamma di frequenza di taglio da 0.001 a 1.000.
5. Dopo la misurazione avviene, pulire la piattaforma reometro e strumento di misura. Estrudere 1 mL di inchiostro fresco idrogel nuovamente sulla piattaforma reometro.
6. Misura moduli di deposito (g ′) e moduli di perdita (G″) come una funzione della sollecitazione di taglio ad una frequenza di 1 Hz. Selezionare l'intervallo di sollecitazione di taglio da 10 da³ a 10⁷.
7. Una volta che le prove sono completate, copiare i dati in file di testo e tracciare curve reologiche in scala logaritmica.

4. preparazione per la stampa 3D del file

Nota: Cura 2.4.0 software viene utilizzato per la progettazione 3D ponteggi (20 mm³) avendo tre tipi di pori. 1-uniforme pori di 0,6 mm, 2-uniforme pori di 1,0 mm e 3-gradiente pori della gamma 0,5-1 mm.

1. Scarica il file di stereolitografia (stl) di un cubo solido da thingsinverse.com e aprire il file in Cura.
2. Fare clic su modello caricato e spostarlo in X/Y/Z: 0/0/0 mm. Click scala, deselezionare la casella per cambiamento di scala uniforme e impostare le dimensioni di X/Y/Z: 20/20/20 mm. fare clic su ruota e ruotare il cubo di 45 ° nel piano XY.
3. Nel riquadro laterale, ugello & materiale, selezionare 0,4 mm e incollare il profilo. Selezionare Discov3ry completa come la stampante.
4. Nel riquadro laterale, selezionare personalizzato per Impostazioni di stampa. Nella sezione qualità , immettere 0,2 mm per tutte le sezioni secondarie. Nella sezione di Shell , immettere 0 mm per tutte le sezioni secondarie. Nella sezione materiale , immettere 26 ° C per temperatura, flusso di 1 mm di diametro e 100%. Nella sezione velocità , immettere 30 mm/s come Velocità di stampa e 120 mm/s come Velocità di traslazione. Nella sezione supporto , deselezionare la casella per Abilitare il supporto. Nella sezione Costruire piastra adesione , selezionare gonna, immettere 3 mm come Gonna distanza e 150 mm come lunghezza minima del pannello esterno/tesa.
5. Per ponteggi con dimensione dei pori uniforme, immettere 0,6 o 1 mm di Distanza della linea di riempimento e selezionare il Modello di riempimento griglia.
6. Per impalcature di gradiente porosità, fusione e raggruppamento strumento viene utilizzato. Fare clic destro il modello caricato, selezionare Più modelli, digitare 2 e premere OK. Scala ogni modello come X/Y/Z: 7/20/20 mm. Posizionare i modelli in cima a vicenda. Immettere Distanza linea di riempimento come 0,3, 0,5 e 0,7 mm per il modello inferiore, medio e superiore, rispettivamente. Selezionare tutti i tre modelli (Ctrl + A), fare clic destro e scegliere Modelli di gruppo.
7. Salvare i modelli sulla scheda sicuro Digital (SD). Cura salva automaticamente il file gcode che viene letto dalla stampante.

5. stampa scaffold porosi 3D

1. Inserire il tubo di trasferimento portaugello e 400 µm ugello di connettersi ad esso. Livello la piastra di compilazione per ottenere la corretta distanza tra la piastra di compilazione e l'ugello.
2. Caricare la siringa centrifugata nella cartuccia e collegarla a altro lato del tubo di trasferimento.
3. Inserire la scheda SD nella stampante, selezionate eliminare velocemente e iniziare l'eliminazione dell'inchiostro di idrogel finché inizia a estrudere dall'ugello. Continuare l'eliminazione per 2-3 minuti ottenere un flusso omogeneo.
4. Dalla scheda SD, selezionare i file salvati per porosità uniforme e gradienti impalcature e avviare la stampa. Tenere d'occhio la velocità di estrusione. Se necessario, regolare di conseguenza il tasso di velocità e flusso. Per ridurre le dimensioni dei pori, utilizzare velocità combinata con tasso di flusso debole (50 mm/s e il 70%).
   Nota: Non toccare le impalcature 3D stampate.

6. reticolazione del 3D stampato ponteggi

1. Dopo aver completata la stampa 3D, delicatamente aggiungere gocce del 3% in peso di CaCl₂ al patibolo finché diventa completamente bagnato. Attendere 5 min.
2. Molto attentamente trasferire il patibolo dalla stampante in un contenitore di 50 mL riempito con 3 wt % di CaCl₂. Lasciare tutta la notte.
3. Lavare accuratamente con acqua distillata e trasferire il patibolo in un contenitore di 50 mL riempito con 3 wt % glutaraldeide. Lasciare tutta la notte.
4. Lavare accuratamente e conservare lo scaffold 3D stampato in acqua distillata.

7. prove di compressione

Nota: Eseguire prove di compressione con cella di carico di 100 N in acqua a 37 ° C.

1. Riempire il contenitore dotato di piastra di base di sommergibili compressione con 2 L di acqua e avviare il sistema di riscaldamento per raggiungere i 37 ° C.
2. Inizializzare il software Bluehill universale e impostare il metodo di prova. Selezionare la geometria del provino rettangolare e scegliere l'opzione di inserire dimensioni prima del test di ciascun campione.  Impostare la velocità di deformazione fino 2 mm/min e alla fine del risultato come 80% deformazione compressiva insieme forza N 90.
3. Nella sezione di misura , selezionare forza, spostamento, sollecitazione di compressione e deformazione compressiva. Scegliere l'opzione per esportare i dati come file di testo per la stampa di futuro.
4. Impostare il punto zero estensione utilizzando i comandi di jog per abbassare la piastra traversa più vicino possibile alla piastra di base.
5. Misurare e annotare le dimensioni dei campioni da testare.
6. Quando la temperatura dell'acqua raggiunge a 37 ° C, il campione viene posto sulla piastra di base.  Fissare il campione spostando la piastra della traversa in modo che inizia a toccare il campione.
7. Spostare il bagno d'acqua, in modo che le piastre con la via di mezzo campione li sono immerse in acqua.
8. Specificare dimensioni e nome di esempio. Avviare il test.
9. Dopo aver completato il test, prima di spostare il bagno d'acqua verso il basso e poi sollevare la piastra della traversa.
10. Rimuovere il campione e relative parti, se presenti, pulire entrambe le piastre e caricare un nuovo campione.
11. Dopo tutti i campioni sono testati, esportare i dati grezzi. Tracciare la sollecitazione di compressione vs curve deformazione compressiva e determinare il modulo tangente alla compressione a valori di tensione di 1-5% e 25-30%.
    Nota: Posizionare il cubo di gradiente in modo tale che i fori più grandi faccia la piastra di base di cancelleria.
    In primo luogo garantire il patibolo tra le impugnature e poi start/stop la misurazione.

Risultati

CNC basato su nanocompositi idrogel inchiostro dimostra un forte taglio non newtoniani diradamento comportamento (Figura 2a). La viscosità apparente di 1,55 × 10⁵ PA. s a una velocità di taglio basso (0.001 s^-1) gocce di cinque ordini di grandezza per un valore di 22.60 PA. s a una velocità di taglio di 50 s^-1 (≈50 s^-1 essendo una velocità di taglio tipico con esperienza durante la stampa 3D)³¹ . L'in...

Discussione

Stampa 3D richiede adatto proprietà reologiche dell'idrogel inchiostro. L'inchiostro di alta viscosità richiede pressioni estreme per sua estrusione mentre inchiostro bassa viscosità non manterrà la sua forma dopo l'estrusione. La viscosità dell'inchiostro idrogel può essere controllata attraverso la concentrazione degli ingredienti. Rispetto al nostro precedente lavoro¹¹, il contenuto di solidi dell'inchiostro idrogel è aumentato da 5.4 a 9,9% wt conseguente inchiostro concentrato idrogel ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%