3D-Druck poröse Zellulose Nanocomposites Hydrogel Gerüste

Zusammenfassung

Die drei kritischen Schritte dieses Protokolls i) entwickeln die richtige Zusammensetzung und Konsistenz der Zellulose Hydrogel Tinte, Ii) 3D Drucken von Gerüsten in verschiedenen Strukturen mit guter Form Treue und Dimensionen und (Iii) Demonstration der pore der mechanische Eigenschaften im simulierten Körper Bedingungen für die Knorpelregeneration.

Zusammenfassung

Diese Arbeit zeigt den Einsatz von dreidimensionalen (3D) Druck, poröse kubische Gerüste mit Zellulose Nanocomposites Hydrogel Tinte mit kontrollierten Porenstruktur und mechanischen Eigenschaften zu produzieren. Zellulose-Nanokristalle (CNCs, 69,62 Gew.-%) auf der Grundlage Hydrogel Tinte mit Matrix (Natriumalginat und Gelatine) entstand und 3D-Druck in Gerüste mit einheitlichen und gradient Porenstruktur (110-1.100 µm). Die Gerüste zeigte Kompression Modul im Bereich von 0,20-0,45 MPa bei simuliert in vivo Bedingungen (in destilliertem Wasser bei 37 ° C). Die Porengrößen und der Kompression-Modul von der 3D Gerüste, abgestimmt mit den Anforderungen für Knorpel Regeneration Anwendungen benötigt. Diese Arbeit zeigt, dass die Konsistenz der Farbe, durch die Konzentration der Ausgangsstoffe gesteuert werden und Porosität im 3D Druckverfahren gesteuert werden und beide Faktoren definiert im Gegenzug die mechanischen Eigenschaften der 3D gedruckt porös Hydrogel-Gerüst. Dieser Prozessmethode kann daher verwendet werden, strukturell und kompositorisch angepasste Gerüste entsprechend den spezifischen Bedürfnissen der Patienten herzustellen.

Einleitung

Cellulose ist ein Polysaccharid, bestehend aus linearen Ketten von β (1-4) verknüpften D-Glucose-Einheiten. Es wird ist das am häufigsten vorkommende natürliche Polymer auf der Erde und aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Meerestiere (z. B. Manteltiere), Pflanzen (z. B. Holz, Baumwolle, Weizenstroh) und bakteriellen Quellen wie Algen (z. B. Valonia), Pilze und sogar Amöben (Protozoen )^1,2. Cellulose-Nanofasern (CNF) und Cellulose Nanokristallen (CNC) mit mindestens einer Dimension auf nanoskaligen werden durch mechanische Behandlungen und saure Hydrolyse von Zellulose gewonnen. Sie verfügen nicht nur über die Eigenschaften von Zellulose, wie Potenzial für chemische Modifikation, geringe Toxizität, Biokompatibilität, biologisch abbaubar und erneuerbare, aber es hat auch Nanoscale Eigenschaften wie hoher spezifischer Oberfläche, hohe mechanische Eigenschaften , rheologische und optischen Eigenschaften. Diese attraktiven Eigenschaften haben CNFs und CNC-Maschinen für biomedizinische Anwendungen geeignet, vor allem in Form von 3-dimensionalen (3D) Gerüste Hydrogel³. Diese Gerüste benötigen kundenspezifische Abmessungen mit kontrollierten Porenstruktur und vernetzten Porosität. Unsere Fraktion und andere berichtet 3D poröse Zellulose Nanokomposite vorbereitet durch Gießen, Elektrospinnen und Gefriertrocknung^4,5,6,7,8. Jedoch Steuern auf die Porenstruktur und Fertigung komplexer Geometrie wird nicht durch diese traditionellen Techniken erreicht.

3D-Druck ist eine additive Fertigungstechnik, 3D Objekte in der Schicht für Schicht durch die computergesteuerte Ablagerung von Tinte⁹erstellt werden. Die Vorteile des 3D-Drucks über traditionelle Techniken beinhaltet Gestaltungsfreiheit, kontrollierte Makro und Mikrodimensionen, Herstellung von komplexen Architekturen, Anpassung und Reproduzierbarkeit.  Darüber hinaus bietet 3D Druck von CNFs und CNC-Maschinen auch Scheren-induzierte Ausrichtungen von Nanopartikeln, bevorzugt Direktionalität, gradient Porosität und leicht erweiterbar bis 3D Bioprinting^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. die Dynamik der CNCs Ausrichtung während des 3D Druckens wurde berichtete kürzlich,^16,17. Fortschritte auf dem Gebiet der Bioprinting haben ermöglichen 3D gedruckten Geweben und Organen trotz der beteiligten Herausforderung wie Auswahl und Konzentration von lebenden Zellen und Wachstumsfaktoren, Zusammensetzung der Träger Tinte, drucken, Druck und Düse Durchmesser^{18 ,19,20}.

Die Porosität und Druckfestigkeit des Knorpels regenerative Gerüste sind wichtige Eigenschaften, die die Effizienz und Leistung bestimmt. Porengröße spielt eine wichtige Rolle für die Adhäsion, Differenzierung und Proliferation von Zellen sowie für den Austausch von Nährstoffen und metabolische Abfall²¹. Allerdings gibt es keine definitive Porengröße, die als einen ideellen Wert betrachtet werden kann, einige Studien zeigten höhere Bioaktivität mit kleineren Poren, während andere besser Knorpelregeneration mit größeren Poren zeigte. Makroporen (< 500 µm) Gewebe Mineralisierung, Nährstoffversorgung und Abfallentsorgung zu erleichtern, während die Mikroporen (150-250 µm) Zellhaftung und bessere mechanische Eigenschaften^22,23erleichtern. Die implantierte Gerüst müssen ausreichende mechanische Integrität aus der Zeit der Behandlung, Implantation und bis zur Fertigstellung ihres gewünschten Zweckes. Das aggregierte zusammenpressende Modul für natürliche Gelenkknorpel wird berichtet, dass im Bereich von 0,1-2 MPa abhängig von Alter, Geschlecht und getesteten Standort^{4,24,25,26,27 ,28,29}.

In unserer bisherigen Arbeit¹¹3D-Druck diente fabrizieren porösen Bioscaffolds eine doppelte querverbunden durchdringen Polymernetz (IPN) aus einem Hydrogel-Tinte mit verstärkten CNCs in einer Matrix von Natriumalginat und Gelatine. Der 3D Druck Weg wurde optimiert, um 3D Gerüste mit einheitlichen und gradient Porenstrukturen (80-2.125 µm) zu erreichen, wo die Nanokristalle vorzugsweise in Druckrichtung (Grad der Ausrichtung zwischen 61-76 %) orientieren. Hier präsentieren wir die Fortsetzung dieser Arbeiten und zeigt, dass die Wirkung der Porosität auf die mechanischen Eigenschaften von 3D Hydrogel Gerüste in simulierten Körper Bedingungen gedruckt. CNC-Maschinen verwendet, hier wurden früher von uns zu Cytocompatible und ungiftig (d. h. Zellwachstum nach 15 Tagen Inkubation war bestätigte³⁰) gemeldet. Darüber hinaus bereitete Gerüste mittels Gefriertrocknung die gleichen CNCs Natriumalginat und Gelatine zeigte hohe Porosität, hohe Aufnahme von Phosphat Puffer Kochsalzlösung und Cytocompatibility in Richtung mesenchymalen Stammzellen⁵. Das Ziel dieser Arbeit ist die Hydrogel-Tinte-Verarbeitung, 3D-Druck poröse Gerüste und die Kompression Prüfung nachweisen. Schaltpläne der Verarbeitung Route ist in Abbildung 1dargestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung der Vorläufer

1. Vorbereitung der Cellulose Nanokristallen Aussetzung
   Hinweis: Isolation von Cellulose Nanokristallen erfolgt nach dem Verfahren von Mathew, berichtet Et Al³⁰.
   1. Verdünnte 17 wt % Suspension von Cellulose Nanokristallen, 2 Gew.-% durch Zugabe von destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 2 L. Mischung gründlich mit ultra Beschallung und Nutzung kleiner Chargen (250-300 mL) für effizientes Mischen.
   2. Passieren Sie die sonified Aussetzung durch den Homogenisator 10 Mal bei einem Druck von 500-600 Bar. An dieser Stelle ergibt sich ein Dicke transparentes Gel von 2 wt % Cellulose Nanokristallen.
   3. 2 wt % Zellulose, die gel-Nanokristalle, 11 Gew.-% durch Centrifugations bei 24.500 X g für 1,5 h Dekantieren Wasser zwischen jedem 30 min zu konzentrieren.
      Hinweis: Experiment kann hier angehalten werden.
2. Vorbereitung der Matrix Phasen
   1. Homogene Lösung von 6 wt % Natriumalginat (SA) in destilliertem Wasser bei 60 ° C unter ständigen rühren zubereiten.
   2. Bereiten Sie homogene Lösung 12 wt % Gelatine (Gel) in destilliertem Wasser bei 60 ° C unter ständigen rühren.
      Hinweis: Ein Volumen von 20 mL für Matrix Lösungen vorbereiten und im Kühlschrank lagern.
3. Vorbereitung der Vernetzer
   1. Bereiten Sie die Lösung von 3 wt % Kalzium-Chlorid in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur unter ständigen rühren.
   2. Lösung 3 wt % Glutaraldehyd in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur unter ständigen rühren zubereiten.
      Hinweis: Ein Volumen von 50 mL für Vernetzung Lösungen vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern. Finden Sie in der Tabelle der Materialien für die Herstellerinformationen. Experiment kann hier angehalten werden.

2. Vorbereitung des Hydrogel Tinte

1. Bereiten Sie 40 mL Hydrogel Tinte in einem Styropor-Container durch Mischen 11 Gew.-% CNC, 6 wt % SA und 12 Gew.-% Gel zu einem nassen (Gew.-%) Zusammensetzung des CNC/SA/Gel/Wasser: 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. Erhitzen Sie die Mischung auf 40 ° C und Mischung mit einem Spatel, bis eine glatte Paste entsteht.
3. Übertragen Sie die Mischung in eine 60 mL-Spritze. Übergeben Sie die Mischung durch eine Reihe von Düsen mit unterschiedlichen Durchmessern in einem anderen 60 mL Spritze mit Hilfe von mechanischen Klemme. Wiederholen Sie den Vorgang, bis glatt extrudierten Filamente Hydrogel Tinte gewonnen werden. Beginnen Sie mit Düse mit Drehdurchmesser von 800 µm, gefolgt von 600 µm und 400 µm.
4. Sanft Zentrifuge (4.000 X g) die Spritze mit Hydrogel Tinte gefüllt entfernen Lufteinschlüsse.
   Hinweis: Experiment kann hier angehalten werden.

3. Messung der rheologischen Eigenschaften von hydrogel

NTE: Durchführen die rheologischen Eigenschaften mit einer glatten Kegel / Platte Geometrie CP25-2-SN7617, Durchmesser 25 mm, 2 ° nominalen Winkel und Abstand Höhe 0,05 mm bei 25 ° C.

1. Schalten Sie das Rheometer, Luftkompressor und Temperatur-Control-Box. Initialisieren Sie die Software.
2. Montieren Sie das Messwerkzeug in dem Rheometer und stellen Sie Null-Abstand ein.
3. Extrudieren Sie etwa 1 mL der Hydrogel Tinte auf die Rheometer-Plattform.
4. Messen der Viskosität als Funktion der Schergeschwindigkeit. Markieren Sie der Scherbereich Rate von 0,001 bis 1.000
5. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, reinigen Sie die Rheometer-Plattform und Messgerät. Extrudieren Sie 1 mL frisch Hydrogel Tinte wieder auf das Rheometer-Plattform.
6. Lagerung Moduli (G′) und Verlust Moduli (G″) zu messen, wie eine Funktion der Schubspannung bei einer Frequenz von 1 Hz. Wählen Sie Bereich Schubspannung aus 10³ bis 10⁷.
7. Sobald die Tests abgeschlossen sind, kopieren Sie die Daten in Text-Datei und Plotten Sie rheologische Kurven im logarithmischen Maßstab.

4. Datei Vorbereitung für den 3D-Druck

Hinweis: Cura 2.4.0 Software wird verwendet für die Gestaltung von 3D Gerüste (20 mm³) mit drei Arten von Poren. 1-Uniform Poren von 0,6 mm, 2-Uniform Poren von 1,0 mm und 3-Gradient Poren der Bereich von 0,5-1 mm.

1. Herunterladen Sie Stereolithographie (Stl) Datei eines soliden Cubes von thingsinverse.com und öffnen Sie die Datei in Cura.
2. Klicken Sie auf die geladene Modell und verschieben Sie sie in X/Y/Z: 0/0/0 mm. Klick Skala, deaktivieren Sie die Kontrollkästchen für die einheitliche Skalierung und legen Sie die Maße, X/Y/Z: 20/20/20 mm. Klick Drehen und drehen Sie den Würfel um 45° in XY-Ebene.
3. Wählen Sie 0,4 mm in der Seitenwand in Düse & Materialund fügen Sie das Profil. Discov3ry komplett als Drucker auswählen.
4. Wählen Sie in der Seitenwand Benutzerdefiniert für die Druckereinrichtung. Geben Sie unter Bereich Qualität 0,2 mm für alle Unterabschnitte. Geben Sie unter Shell Abschnitt 0 mm für alle Unterabschnitte. Abschnitt " Material " geben Sie 26 ° C Temperatur, 1 mm Durchmesser und 100 % fließen. Abschnitt " Speed " geben Sie 30 mm/s Druckgeschwindigkeit und 120 mm/s als Fahrgeschwindigkeit. Abschnitt " Support " deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für Unterstützung zu ermöglichen. Abschnitt " Bauen Platte Haftung " wählen Sie Rock, geben Sie 3 mm als Rock Abstand und 150 mm als Rock/Krempe Mindestlänge.
5. Für Gerüste mit einheitlichen Porengröße geben Sie 0,6 bzw. 1 mm Linienabstand Infill und Füllung Gittermuster.
6. Für gradient Porosität Gerüste zusammenführen und Gruppierung Tool dient. Rechtsklick die geladene Modell, Mehrere Modelleauswählen, geben Sie 2 ein und drücken Sie "OK". Jedes Modell als X/Y/Z: 20/20/7 mm. Legen Sie die Modelle übereinander. Geben Sie Infill Linienabstand als 0,3, 0,5 und 0,7 mm für unteren, mittleren und oberen Modell, beziehungsweise. Wählen Sie alle drei Modelle (Strg + A), Rechte Maustaste und klicken Sie auf Gruppe Modelle.
7. Speichern Sie die Modelle auf der sicher Digital (SD) Karte. Cura automatisch speichern Sie die Datei als Gcode, die vom Drucker gelesen wird.

5. 3D-Druck poröse Gerüste

1. Stecken Sie das Übertragungsrohr in den Düsenhalter und 400 µm Düse an. Ebene die Build-Platte um den richtigen Abstand zwischen Build Platte und Düse zu erhalten.
2. Die zentrifugiert Spritze in die Patrone zu laden und auf die andere Seite der Rohrweiche verbinden.
3. Stecken Sie die SD-Karte in den Drucker, wählen Sie schnell reinigen und spülen die Hydrogel-Tinte, bis es beginnt, aus der Düse extrudiert. Weiter Spülen für 2-3 min, eine homogene Strömung zu erhalten.
4. Wählen Sie von der SD-Karte die gespeicherten Dateien für einheitliche und gradient Porosität Gerüste und starten Sie den Druckvorgang. Halten Sie ein Auge auf die Extrusionsgeschwindigkeit. Wenn nötig, passen Sie die Geschwindigkeit und den Fluss Rate entsprechend an. Verwenden Sie für kleinere Porengröße schnelleren Geschwindigkeit kombiniert mit low-Flow-Rate (50 mm/s und 70 %).
   Hinweis: Berühren Sie nicht die 3D gedruckte Gerüste.

6. Vernetzung von 3D gedruckt Gerüste

1. Nach Abschluss der 3D-Druck Tropfen Sie sanft 3 Gew.-% CaCl₂ zum Schafott bis sie komplett nass wird. 5 min. warten.
2. Übertragen Sie sehr sorgfältig das Gerüst aus dem Drucker auf eine 50 mL Behälter mit 3 Gew.-% CaCl₂. Lassen Sie es über Nacht.
3. Gründlich mit destilliertem Wasser spülen und das Gerüst auf ein 50 mL Behälter mit 3 wt % Glutaraldehyd übertragen. Lassen Sie es über Nacht.
4. Gründlich waschen und die 3D gedruckte Gerüst in destilliertem Wasser zu speichern.

7. die Kompression testen

Hinweis: Führen Sie Druckversuche mit 100 N-Wägezelle in Wasser bei 37 ° C.

1. Füllen Sie den Behälter ausgestattet mit versenkbaren Kompression Grundplatte mit 2 L Wasser und starten Sie die Heizung um 37 ° c erreichen.
2. Initialisieren Sie Bluehill Universal Software und richten Sie die Testmethode. Wählen Sie rechteckige Probe Geometrie aus und wählen Sie die Option Dimensionen geben vor dem testen jede Probe.  Legen Sie die Verformungsgeschwindigkeit, 2 mm/min und das Ende Resultat als 80 % Druckspannung zusammen mit 90 N Kraft.
3. Wählen Sie in der Messstrecke Kraft, Weg, Druckspannung und Druckspannung. Wählen Sie die Option zum Exportieren von Daten als Text-Dateien für das zukünftige Plotten.
4. Über die Jog-Steuerelemente Kreuzkopf Platte so nah wie möglich zur Platte Basis zu senken vorgegeben Sie den Nullpunkt Erweiterung.
5. Messen Sie und notieren Sie die Abmessungen des zu testenden Proben.
6. Wenn die Wassertemperatur auf 37 ° C erreicht, legen Sie die Probe auf der Grundplatte.  Sichern Sie die Probe durch Verschieben der Kreuzkopf-Platte, so dass es beginnt zu tippen Sie auf die Probe.
7. Das Wasserbad, verschieben, so dass die Platten mit dem Probe-dazwischen sie in mitten sind Wasser.
8. Geben Sie Beispielnamen und Dimensionen. Starten Sie den Test.
9. Nachdem der Test abgeschlossen ist, zuerst verschieben Sie das Wasserbad nach unten und heben Sie dann die Kreuzkopf-Platte.
10. Entfernen Sie die Probe und seine Stücke, wenn vorhanden, beide Platten reinigen und laden Sie eine neue Probe.
11. Nachdem alle Proben getestet werden, exportieren Sie die raw-Daten. Plotten Sie Druckspannung vs. Druckspannung Kurven und bestimmen Sie die Druckfestigkeit tangentiale Elastizitätsmodul bei Belastung Werten von 1-5 % und 25-30 %.
    Hinweis: Setzen Sie Gradienten Würfel so, dass die größere Bohrungen Grundplatte Briefpapier zeigen.
    Sichern Sie zuerst das Gerüst zwischen den Griffen und dann Start/Stopp der Mess.

Ergebnisse

CNC-Maschinen basierten Nanocomposites Hydrogel Tinte zeigt eine starke nicht-newtonsches Scherung Ausdünnung Verhalten (Abbildung 2eine). Die scheinbare Viskosität von 1,55 × 10⁵ Pa.s bei einer niedrigen Scherrate (0,001 s^-1) sinkt um fünf Größenordnungen auf einen Wert von 22.60 Pa.s bei einer Scherrate von 50 s^-1 (≈50 s^-1 wird eine typische Scherraten während 3D-Druck erfahren)³¹ . Die Hydrogel-T...

Diskussion

3D Druck erfordert geeignete rheologische Eigenschaften der Tinte Hydrogel. Die hohe Viskosität Tinte wird extreme Belastungen für die Extrusion erfordern, während niedrige Viskosität Tinte nicht seine Form nach Extrusion zu halten. Die Viskosität der Druckfarbe Hydrogel kann durch die Konzentration der Inhaltsstoffe gesteuert werden. Im Vergleich zu unserer bisherigen Arbeit¹¹ist der Feststoffgehalt der Hydrogel Tinte stieg von 5,4 auf 9,9 Gew.-% wodurch konzentrierte Hydrogel-Tinte, die hil...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%