3D impreso celulosa poroso nanocompuesto hidrogel andamios

Resumen

Los tres pasos críticos de este protocolo son i) el desarrollo de la correcta composición y consistencia de la tinta de hidrogel de celulosa, ii) 3D impresión de andamios en vario poro estructuras con fidelidad de buena forma y dimensiones y iii) demostración de la propiedades mecánicas en condiciones simuladas de cuerpo para la regeneración del cartílago.

Resumen

Este trabajo muestra el uso de la impresión tridimensional (3D) para producir andamios porosos cúbicos usando tinta de hidrogel de nanocompuestos de celulosa, con propiedades mecánicas y estructura de poro controlado. Nanocristales de celulosa (CNCs, 69,62% peso) tinta de hidrogel basado con el matriz (alginato de sodio y gelatina) fue desarrollada y 3D impreso en andamios con estructura de poro uniforme y degradado (1.100 110 μm). Los andamios demostraron módulo de compresión en el rango de 0.20-0.45 MPa en simula condiciones en vivo (en agua destilada a 37 ° C). Los tamaños de poro y el módulo de compresión de los andamios 3D con los requisitos necesarios para los usos de la regeneración de cartílago. Este trabajo demuestra que la consistencia de la tinta puede ser controlada por la concentración de los precursores y porosidad puede ser controlada por el proceso de impresión 3D y a cambio de estos factores define la mecánica propiedades del 3D impresión poroso andamio de hidrogel. Por lo tanto, este método de proceso puede utilizarse para fabricar andamios estructuralmente y compositivamente modificado para requisitos particulares según las necesidades específicas de los pacientes.

Introducción

La celulosa es un polisacárido formado por cadenas lineales de β (1-4) unidades de D-glucosa enlazadas. Es el polímero natural más abundante en la tierra y se extrae de una variedad de fuentes, incluyendo fuentes bacterianas, como las algas (por ejemplo, Valonia), hongos e incluso amebas (protozoos, animales marinos (e.g., tunicados) y plantas (por ejemplo, madera, algodón, paja de trigo) )^1,2. Nanofibras de celulosa (CNF) y celulosa nanocristales (CNC) con al menos una dimensión de nanoescala se obtienen a través de tratamientos mecánicos y la hidrólisis ácida de la celulosa. No sólo poseen las propiedades de la celulosa, tales como potencial de modificación química, baja toxicidad, biocompatibilidad, biodegradable y renovable, pero también tiene características de la nanoescala como superficie específica alta, altas características mecánicas , propiedades reológicas y el ópticos. Estas propiedades atractivas han hecho CNFs y CNCs conveniente para aplicaciones biomédicas, principalmente en forma de 3 dimensiones (3D) hidrogel andamios³. Los andamios requieren dimensiones modificadas para requisitos particulares con estructura de poro controlado y porosidad interconectada. Nuestro grupo y otros han reportado 3D celulosa porosa nanocompuestos preparados por fundición, electrospinning y liofilización^4,5,6,7,8. Sin embargo, control sobre la estructura de poro y fabricación de geometría compleja no se logra a través de estas técnicas tradicionales.

La impresión 3D es una técnica de fabricación aditiva, en el cual se crean objetos 3D capa por capa a través de la deposición controlada por ordenador de los de tinta⁹. Las ventajas de la impresión 3D sobre técnicas tradicionales incluye libertad de diseño, control macro y micro dimensiones, fabricación de arquitecturas complejas, personalización y reproducibilidad.  Además, la impresión 3D de la CNFs y CNCs ofrece alineaciones por cizalla de nanopartículas, prefirió direccionalidad, porosidad gradiente y puede ampliarse fácilmente a 3D bioprinting^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. la dinámica de la CNCs alineación durante la impresión en 3D ha sido divulgado recientemente,^16,17. Han permitido avances en el campo de bioprinting 3D impresos tejidos y órganos a pesar del desafío involucrado como elección y concentración de las células vivas y factores de crecimiento, composición del portador de la impresión de tinta, presiones y diámetros de boquilla^{18 ,19,20}.

La porosidad y resistencia a la compresión de andamios regenerador de cartílago son propiedades importantes que dicta su eficiencia y rendimiento. Tamaño de poro desempeña un papel importante para la adhesión, diferenciación y proliferación de las células, así como para el intercambio de nutrientes y residuos metabólicos²¹. Sin embargo, no hay ningún tamaño de poro definido que puede ser considerado como un valor ideal, algunos estudios demostraron mayor bioactividad con poros más pequeños, mientras que otros mostraron mejor regeneración del cartílago con poros más grandes. Macroporos (< 500 μm) facilitan la mineralización del tejido, fuente de nutrientes y eliminación de desechos, mientras que microporos (150-250 μm) facilitan el accesorio de celular y mejores propiedades mecánicas^22,23. El andamio implantado debe tener suficiente integridad mecánica desde los tiempos de manejo, implantación y hasta la realización de su propósito deseado. El módulo de compresión agregado para cartílago articular natural se divulga para estar en el rango de 0.1-2 MPa dependiendo de la edad, sexo y ubicación probado^{4,24,25,26,27 ,28,29}.

En nuestro anterior trabajo¹¹, impresión 3D se utilizó para fabricar bioscaffolds porosa de un reticulado doble compenetrados red de polímero (IPN) de una tinta de hidrogel que contiene CNCs reforzados en una matriz de alginato de sodio y gelatina. La vía de impresión 3D se ha optimizado para conseguir andamios 3D con las estructuras de poro uniforme y degradado (2.125 80 μm) donde nanocristales se orientan preferentemente en la dirección de la impresión (grado de orientación entre 61-76%). Aquí te presentamos la continuación de este trabajo y demuestra el efecto de la porosidad en las propiedades mecánicas de 3D impreso andamios de hidrogel en condición corporal simulado. CNCs utilizados aquí, antes informaron nos cytocompatible y no tóxico (es decir, crecimiento de la célula después de 15 días de incubación fue confirmado³⁰). Por otra parte, andamios preparan mediante liofilización usando el mismo CNCs, alginato de sodio y gelatina demostraron alta porosidad, alta absorción de la solución salina buffer fosfato y cytocompatibility hacia las células madre mesenquimales⁵. El objetivo de este trabajo es demostrar el proceso de la tinta de hidrogel, impresión 3D de andamios porosos y la prueba de compresión. Esquemas de la ruta de procesamiento se muestra en la figura 1.

Protocolo

1. preparación de precursores

1. Preparación de la suspensión de nanocristales de celulosa
   Nota: El aislamiento de celulosa nanocristales se realiza de acuerdo al procedimiento reportado por Mathew, y otros³⁰.
   1. Diluir 17 wt % suspensión de nanocristales de celulosa al 2% de peso mediante la adición de agua destilada agua para hacer un volumen total de mezcla de L. 2 con ultra sonicación y uso lotes más pequeños (250-300 mL) para la mezcla eficaz.
   2. Pasar la suspensión sonified por el homogeneizador 10 veces a una presión de 500-600 bar. En este punto, se obtiene un gel transparente grueso de 2 wt % celulosa nanocristales.
   3. Se concentran 2 wt % de celulosa gel de nanocristales a 11% de peso a través de centrifugados a 24.500 x g de 1,5 h. decantar agua entre cada 30 minutos.
      Nota: Experimento puede hacer una pausa aquí.
2. Preparación de las fases de la matriz
   1. Preparar una solución homogénea de peso 6% alginato de sodio (SA) en agua destilada a 60 º C bajo agitación continua.
   2. Preparar una solución homogénea de 12 wt % de gelatina (Gel) en agua destilada a 60 º C bajo agitación continua.
      Nota: Preparar un volumen de 20 mL para las soluciones de matrix y almacenar en el refrigerador.
3. Preparación de reticulantes
   1. Preparar la solución 3 wt % de cloruro de calcio en agua destilada a temperatura ambiente con agitación continua.
   2. Preparar la solución de glutaraldehído de % wt 3 en agua destilada a temperatura ambiente con agitación continua.
      Nota: Preparar un volumen de 50 mL para soluciones de reticulación y almacenar en temperatura ambiente. Consulte la Tabla de materiales para la información del vendedor. Experimento puede hacer una pausa aquí.

2. preparación de la tinta de hidrogel

1. Preparar 40 mL de tinta de hidrogel en un contenedor de poliestireno mediante la mezcla de 11% en CNC, 6 wt % SA y 12% en Gel para obtener un mojado (wt %) composición de la CNC, SA, Gel, agua: 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. Calienta la mezcla a 40 ° C y mezclar con una espátula hasta obtener una pasta suave.
3. Transferir la mezcla en una jeringa de 60 mL. Pasar la mezcla a través de una serie de boquillas de diferentes diámetros en otra jeringa de 60 mL, con la ayuda de la abrazadera mecánica. Repita el proceso hasta que se obtienen filamentos suavemente sacados de hidrogel tinta. Comience con la boquilla con diámetro mayor de 800 μm, seguido de 600 μm y μm 400.
4. Suavemente la centrifugadora (4.000 x g) la jeringa llena de tinta de hidrogel para eliminar aire atrapado.
   Nota: Experimento puede hacer una pausa aquí.

3. medición de propiedades reológicas de hidrogel

NTE: Llevar a cabo las propiedades reológicas con una geometría de cono sobre la placa lisa, CP25-2-SN7617, diámetro 25 mm, 2 ° ángulo nominal y altura del entrehierro 0,05 mm a 25 ° C.

1. Encienda el Reómetro, compresor de aire y caja de control de temperatura. Inicializar el software.
2. Monte el aparato de medición en el Reómetro y ajuste zero-gap.
3. Extraer aproximadamente 1 mL de la tinta de hidrogel en la plataforma de reómetro.
4. Medir la viscosidad en función de la tarifa del esquileo. Seleccione el rango de velocidad de cizalla de 0,001 a 1000.
5. Después de la medición, limpie la plataforma del reómetro y herramienta de medición. 1 mL de tinta de hidrogel fresco otra vez en la plataforma de reómetro de extrusión.
6. Medir módulos de almacenamiento de información (G′) y módulos de pérdida (G″) como una función de la tensión de esquileo en una frecuencia de 1 Hz. Seleccione el rango de tensión de esquileo de 10³ 10⁷.
7. Una vez finalizadas las pruebas, copiar los datos en archivo de texto y trazar curvas reológicas en escala logarítmica.

4. preparación para la impresión 3D de archivos

Nota: Cura 2.4.0 software se utiliza para el diseño 3D andamios (20 mm³) tiene tres tipos de poros. 1-uniforme poros de 0,6 mm, 2-uniforme poros de 1,0 mm y poros 3-degradado de rango 0.5-1 mm.

1. Descargar archivo de la estereolitografía (stl) de un cubo sólido de thingsinverse.com y abra el archivo en la Cura.
2. Haga clic en el modelo cargado y a X/Y/Z: 0/0/0 mm. Haga clic en escala, desmarque la casilla de escala uniforme y establecer las dimensiones en X/Y/Z: 20/20/20 mm. Haga clic en girar y girar el cubo de 45 ° en plano XY.
3. En el panel lateral, en Material y boquilla, seleccione 0,4 mm y el perfil de la goma. Seleccione Discov3ry completa como la impresora.
4. En el lado del panel, seleccione personalizada para la Configuración de impresión. En la sección de calidad , entre 0,2 mm para todas las secciones de la sub. En la sección Shell , introduzca 0 mm para todas las secciones de la sub. En la sección de Material , introduzca 26 ° C de temperatura, fluyen de 1 mm de diámetro y 100%. Tramo de velocidad , introduzca 30 mm/s Velocidad de impresión y 120 mm/s como Velocidad de desplazamiento. En la sección de apoyo , desmarque la casilla para Activar. En la sección Construir placa de adherencia , seleccione falda, entrar en 3 mm como la Distancia de la falda y 150 mm longitud de la Falda/borde mínimo.
5. Para andamios con tamaño de poro uniforme, ingrese 0.6 o 1 mm de Distancia de línea de relleno y seleccione el Patrón de relleno de cuadrícula.
6. Para andamios de porosidad gradiente, fusión y agrupación de herramienta se utilizan. Haga clic con el botón derecho el modelo cargado, seleccione Múltiples modelos, escriba 2 y pulse OK. Escala de cada modelo como X/Y/Z: 7/20/20 mm. Coloque los modelos encima de la otra. Entrar en Distancia de línea de relleno como 0.3, 0.5 y 0.7 mm para el modelo inferior, medio y superior, respectivamente. Seleccione los tres modelos (Ctrl + A), haga clic derecho y haga clic en Grupo de modelos.
7. Guardar los modelos de la tarjeta Digital segura (SD). Cura automáticamente guardar el archivo como gcode que es leída por la impresora.

5. 3D impresión andamios porosos

1. Inserte el tubo de transferencia en el portainyector y conectarse 400 μm boquilla. Nivel de la placa de la construcción para obtener la distancia correcta entre la acumulación de placa y la boquilla.
2. Cargar la jeringa de centrifugado en el cartucho y conectarlo al otro lado del tubo de transferencia.
3. Inserte la tarjeta SD en la impresora, seleccione purgar rápidamente y empezar a purgar el hidrogel de tinta hasta que comience a sacar de la boquilla. Continuar la purga durante 2-3 minutos obtener un flujo homogéneo.
4. Desde la tarjeta SD, seleccione los archivos guardados para andamios de porosidad uniforme y degradado y comenzar la impresión. Mantener un ojo en la tasa de extrusión. Si es necesario, ajustar la velocidad de flujo y velocidad por consiguiente. De tamaño de poro más pequeño, usar una velocidad más rápida combinada con bajo caudal (50 mm/s y el 70%).
   Nota: No toque los andamios impresos 3D.

6. entrecruzamiento de 3D impreso andamios

1. Una vez finalizada la impresión 3D, suavemente añadir gotas de 3% en peso de CaCl₂ al andamio hasta que esté completamente húmeda. Espere 5 minutos.
2. Transferencia muy cuidadosamente el andamio de la impresora a un recipiente de 50 mL con 3% en peso de CaCl₂. Dejarlo durante la noche.
3. Lave bien con agua destilada y transferir al cadalso a un recipiente de 50 mL llenado de glutaraldehído de % wt 3. Dejarlo durante la noche.
4. Lave bien y almacenar el andamio impreso 3D en agua destilada.

7. ensayos de compresión de

Nota: Realizar pruebas de compresión con célula de carga de 100 N en agua a 37 ° C.

1. Llenar el contenedor equipado con placa base compresión sumergible con 2 L de agua y empezar el sistema de calefacción para alcanzar los 37 ° C.
2. Software Bluehill Universal de inicializar y configurar el método de prueba. Seleccione la geometría rectangular de la muestra y elegir la opción de introducir dimensiones antes de probar cada muestra.  Establecer el grado de deformación de 2 mm/min y al final del resultado como 80% tensión compresiva junto con N de fuerza de 90.
3. En la sección de medición , seleccione fuerza, desplazamiento, esfuerzo de compresión y tensión a la compresión. Elija la opción de exportar datos a archivos de texto para un futuro.
4. Establecer el punto cero extensión mediante los controles de avance lento para bajar la placa de la cruceta lo más cerca posible a la placa base.
5. Mida y tenga en cuenta las dimensiones de las muestras a ensayar.
6. Cuando la temperatura del agua llega a 37 ° C, coloque la muestra en la placa base.  Fije la muestra moviendo la placa de la cruceta para que comience a tocar la muestra.
7. Mueva la bañera de agua, para que las placas con el medio de la muestra ellos se sumergen en agua.
8. Entrar en dimensiones y nombre de la muestra. Iniciar la prueba.
9. Una vez finalizada la prueba, primero baje el baño de agua y entonces levante la placa de la cruceta.
10. Retire la muestra y sus piezas, si, limpiar las placas de ambos y una nueva muestra de la carga.
11. Después de todas las muestras se prueban, exportar los datos en bruto. Diagrama de esfuerzo de compresión vs curvas de deformación compresiva y determinar el módulo tangente a la compresión en los valores de tensión de 1-5% y un 25-30%.
    Nota: Coloque el cubo degradado de tal manera que los agujeros más grandes frente a la placa base de escritorio.
    Primero fijar el andamio entre los puños y luego iniciar/detener la medida.

Resultados

CNCs base de nanocompuestos hidrogel tinta muestra un fuerte esquileo no newtonianos del adelgazamiento del comportamiento (figura 2a). La viscosidad aparente de 1.55 x 10⁵ Pa.s a una velocidad de corte baja (0,001 s^-1) cae en cinco órdenes de magnitud a un valor de 22,60 Pa.s a una velocidad de corte de 50 s^-1 (≈50 s^-1 siendo una tarifa del esquileo típica experimentada durante la impresión en 3D)³¹ . ...

Discusión

Impresión 3D requiere adecuadas propiedades reológicas de la tinta de hidrogel. La tinta de alta viscosidad requiere presiones extremas para su extrusión mientras que tinta de baja viscosidad no mantiene su forma después de la extrusión. La viscosidad de la tinta del hidrogel puede controlarse a través de la concentración de los ingredientes. En comparación con nuestro anterior trabajo¹¹, el contenido de sólidos de la tinta de hidrogel aumenta de 5.4 a 9,9% de peso, dando por resultado la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%