3D impresso celulose porosa nanocompósitos Hydrogel andaimes

Resumo

Os três passos críticos do presente protocolo i) desenvolvem-se a composição certa e consistência da tinta celulose hidrogel, ii) 3D impressão de andaimes em vário pore estruturas com fidelidade de boa forma e dimensões e iii) demonstração do Propriedades mecânicas em condições de corpo simulado para a regeneração da cartilagem.

Resumo

Este trabalho demonstra o uso da impressão (3D) tridimensional para produzir porosas andaimes cúbicos usando tinta de hidrogel de nanocompósitos celulose, com estrutura de poro controlado e propriedades mecânicas. Nanocristais de celulose (CNCs, 69,62% em peso) tinta com base de hidrogel com matriz (alginato de sódio e gelatina) foi desenvolvida e 3D impresso em andaimes, com estrutura de poros uniforme e gradiente (1.100-110 µm). Os andaimes mostraram módulo de compressão na faixa de 0,20-0.45 MPa quando testado em simulado condições in vivo (em água destilada a 37 ° C). O tamanho dos poros e o módulo de compressão de plataformas 3D combinado com os requisitos necessários para aplicações de regeneração de cartilagem. Este trabalho demonstra que a consistência da tinta pode ser controlada pela concentração dos precursores e porosidade pode ser controlada pelo processo de impressão 3D e ambos esses fatores em troca define o mecânico Propriedades da 3D impresso porosa andaime de hidrogel. Este método de processo, portanto, pode ser usado para fabricar andaimes estruturalmente e em termos de composição personalizados de acordo com as necessidades específicas dos pacientes.

Introdução

A celulose é um polissacarídeo que consiste de cadeias lineares de β (1-4) unidades de D-glicose ligadas. É o polímero natural mais abundante na terra e é extraído de uma variedade de fontes, incluindo fontes bacterianas, como até mesmo ameba (protozoários, fungos e algas (por exemplo, Valonia), plantas (por exemplo, madeira, algodão, palha de trigo) e animais marinhos (por exemplo, tunicados) )^1,2. Nanofibras de celulose (CNF) e nanocristais de celulose (CNC) ao menos uma dimensão na escala nanométrica são obtidos através de tratamentos mecânicos e hidrólise ácida de celulose. Eles não só possuam as propriedades de celulose, tais como potencial de modificação química, baixa toxicidade, biocompatibilidade, biodegradável e renovável, mas também tem características de nanoescala como alta área de superfície específica, altas propriedades mecânicas , propriedades reológicas e ópticas. Essas propriedades atraentes fizeram CNFs e CNCs apropriado para aplicações biomédicas, principalmente sob a forma de 3-dimensional (3D) hidrogel moldes³. Estes andaimes requerem dimensões personalizadas com porosidade controlada estrutura e porosidade interligada. O nosso grupo e outros relataram 3D celulose porosa nanocompósitos preparados através de fundição, eletrofiação e liofilização^4,5,6,7,8. No entanto, o controle sobre a estrutura dos poros e fabricação de geometria complexa não é alcançada através destas técnicas tradicionais.

Impressão 3D é uma técnica de fabricação aditiva, na qual os objetos 3D são criados camada por camada através da deposição controlada por computador do tinta⁹. As vantagens da impressão 3D sobre técnicas tradicionais inclui liberdade de design, controlada de macro e micro dimensões, fabricação de arquiteturas complexas, personalização e reprodutibilidade.  Além disso, a impressão 3D da CNFs e CNCs também oferece alinhamentos induzida por cisalhamento de nanopartículas, preferiu a direcionalidade, gradiente porosidade e pode ser facilmente estendida para 3D bioprinting^{10,11,12, 13 , 14 , 15}. a dinâmica do CNCs alinhamento durante a impressão 3D tem sido relatado recentemente,^16,17. Avanços no campo da bioprinting ter habilitar 3D impressos tecidos e órgãos apesar do desafio envolvido como escolha e concentração de células vivas e fatores de crescimento, composição da transportadora impressão de tinta, pressões e diâmetros do bocal^{18 ,19,20}.

A porosidade e a resistência à compressão de andaimes regenerativa de cartilagem são propriedades importantes que dita a sua eficiência e desempenho. Tamanho do pore desempenha um papel importante para a adesão, diferenciação e proliferação das células, bem como para a troca de nutrientes e resíduos metabólicos²¹. No entanto, não há nenhum tamanho de poro definitiva que pode ser considerado como um valor ideal, alguns estudos mostraram maior Bioatividade com poros menores enquanto outros mostraram melhor regeneração de cartilagem com poros maiores. Macroporos (< 500 µm) facilitar a mineralização do tecido, fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos, enquanto os microporos (150-250 µm) facilitam a fixação da célula e melhores propriedades mecânicas^22,23. O andaime implantado deve ter suficiente integridade mecânica do tempo de manipulação, implantação e até a conclusão de sua finalidade pretendida. O módulo agregado à compressão para cartilagem articular natural é relatado para estar na faixa de 0,1-2 MPa, dependendo da idade, sexo e local testado^{4,24,25,26,27 ,28,29}.

Em nosso trabalho anterior¹¹, impressão em 3D foi usada para fabricar bioscaffolds poroso de uma dupla ligação cruzada interpenetração polímeros (IPN) de uma tinta de hidrogel contendo CNCs reforçados em uma matriz de alginato de sódio e gelatina. O caminho de impressão 3D foi otimizado para alcançar andaimes 3D com estruturas de poro uniforme e gradiente (80-2.125 µm) onde nanocristais de preferência orientam na direção da impressão (grau de orientação entre 61-76%). Aqui, nós apresentamos a continuação deste trabalho e demonstra o efeito da porosidade sobre as propriedades mecânicas do 3D impresso hidrogel andaimes em condições de corpo simulado. CNCs usados aqui, anteriormente foram relatados por nós para ser cytocompatible e non-toxic (i.e., crescimento celular após 15 dias de incubação foi confirmada³⁰). Além disso, andaimes preparado através de liofilização usar o mesmo CNCs, alginato de sódio e gelatina mostraram alta porosidade, alta absorção de solução salina tampão de fosfato e cytocompatibility em direção a células-tronco mesenquimais⁵. O objetivo deste trabalho é demonstrar o processamento de tinta de hidrogel, impressão 3D de andaimes porosos e o teste de compressão. Esquemas da rota de processamento é mostrado na Figura 1.

Protocolo

1. preparação de precursores

1. Preparação da suspensão de nanocristais de celulose
   Nota: O isolamento dos nanocristais de celulose é feito de acordo com o procedimento relatado por Mathew, et al³⁰.
   1. Diluído 17 wt % suspensão de nanocristais de celulose para 2% em peso, adicionando água destilada para fazer um volume total de 2 L. Mix completamente usando ultra sonication e uso lotes menores (250-300 mL) para a mistura eficiente.
   2. Passe a suspensão sonified através do homogenizador 10 vezes a uma pressão de 500-600 bar. Neste ponto, um gel transparente grosso de 2 wt % celulose nanocristais é obtido.
   3. Concentre-se 2 celulose de % wt nanocristais do gel para 11% em peso através de centrifugações a 24.500 x g durante 1,5 h. decantar a água para fora entre cada 30 min.
      Nota: Experimento pode ser uma pausa aqui.
2. Preparação das fases da matriz
   1. Prepare uma solução homogênea de 6 wt % de alginato de sódio (SA) em água destilada a 60 ° C, sob agitação contínua.
   2. Prepare uma solução homogênea de 12 wt % de gelatina (Gel) em água destilada a 60 ° C, sob agitação contínua.
      Nota: Preparar um volume de 20 mL para soluções de matriz e guarde na geladeira.
3. Preparação de crosslinkers
   1. Prepare a solução de 3 wt % cloreto de cálcio em água destilada à temperatura ambiente sob agitação contínua.
   2. Prepare a solução de 3 wt % de glutaraldeído em água destilada à temperatura ambiente sob agitação contínua.
      Nota: Preparar um volume de 50 mL para soluções de reticulação e armazenar em temperatura ambiente. Consulte a Tabela de materiais , para obter informações do fornecedor. Experimento pode ser pausado aqui.

2. preparação do hidrogel tinta

1. Prepare-se 40 mL de tinta de hidrogel em um recipiente de poliestireno através da mistura de 11% em peso do CNC, 6 wt % SA e 12 wt % Gel para obter um molhado (% em peso) composição do CNC/SA/Gel/água: 6.87/1.50/1.50/90.12.
2. Aqueça a mistura de 40 ° C e misturar com uma espátula até obter uma pasta lisa.
3. Transfira a mistura em uma seringa de 60 mL. Passe a mistura através de uma série de bicos com diâmetros diferentes em outra seringa de 60 mL, com a ajuda de fixação mecânica. Repita o processo até filamentos lisamente extrudidos de hidrogel tinta são obtidos. Comece com bocal com diâmetro maior de 800 µm, seguido por 600 µm e 400 µm.
4. Delicadamente centrífuga (4.000 x g) a seringa preenchida com tinta de hidrogel para remover presos ar.
   Nota: Experimento pode ser uma pausa aqui.

3. medição de propriedades reológicas de hidrogel

NTE: Realizar as propriedades reológicas por meio de uma geometria cone-na-cabeça lisa, CP25-2-SN7617, diâmetro 25mm, 2 ° nominal ângulo e altura lacuna 0,05 mm a 25 ° C.

1. Ligue o rheometer, compressor de ar e caixa de controle de temperatura. Inicialize o software.
2. Monte o instrumento de medição no rheometer e ajustar distância do zero.
3. EXTRUDE aproximadamente 1 mL da tinta para a plataforma rheometer hidrogel.
4. Medir a viscosidade em função da taxa de cisalhamento. Selecione o intervalo de taxa de cisalhamento de 0.001 a 1.000.
5. Após a medição, limpe a plataforma rheometer e ferramenta de medição. EXTRUDE 1ml de tinta fresca hidrogel novamente na plataforma rheometer.
6. Medir o módulo de armazenamento (G′) e módulo de perdas (G″) como uma função da tensão de cisalhamento em uma frequência de 1 Hz. Selecione o intervalo de tensão de cisalhamento de 10³ 10⁷.
7. Uma vez que os testes sejam concluídos, copie os dados para arquivo texto e plotar curvas reológicas em escala logarítmica.

4. preparação para impressão 3D de arquivo

Nota: O software de Cura 2.4.0 é usado para projetar andaimes 3D (20 mm³) tendo três tipos de poros. 1-uniforme poros de 0.6 mm, 2-uniforme poros de 1,0 mm e 3-gradiente poros do intervalo de 0,5-1 mm.

1. Baixar arquivo de estereolitografia (stl) de um cubo sólido de thingsinverse.com e abra o arquivo em Cura.
2. Clique o modelo carregado e movê-lo para X/Y/Z: 0/0/0 mm. clique em escala, desmarque a caixa para dimensionamento uniforme e definir as dimensões de X/Y/Z: 20/20/20 mm. clique em girar e girar o cubo em 45 ° no plano XY.
3. No painel lateral, no bocal & Material, selecione 0,4 mm e cole no perfil. Selecione Discov3ry completa como a impressora.
4. No painel lateral, selecione Custom para Configuração de impressão. Sob a seção de qualidade , digite 0,2 mm para todas as sub seções. Sob a seção de Shell , digite 0 mm para todas as sub seções. Sob a seção de Material , digite 26 ° C de temperatura, 1 mm de diâmetro e 100% de fluxo. Sob a seção de velocidade , digite 30 mm/s como Velocidade de impressão e 120 mm/s como Velocidade de viagem. Sob a seção de suporte , desmarque a caixa para Ativar o suporte. Sob a seção de Construir a aderência de placa , selecione saia, digite 3 mm como Distância de saia e 150 mm como o comprimento da saia/Brim mínimo.
5. Para andaimes com tamanho de poro uniforme, entre 0,6 ou 1 mm de Distância de linha de preenchimento e selecione o Padrão de preenchimento de grade.
6. Para andaimes de porosidade gradiente, mesclando e ferramenta de agrupamento é usado. Botão direito do mouse o modelo carregado, selecione Vários modelos, digite 2 e pressione Okey. Escala de cada modelo como X/Y/Z: 7/20/20 mm. Coloque os modelos em cima do outro. Digite Infill linha distância como 0.3, 0.5 e 0.7 mm para o modelo inferior, médio e superior, respectivamente. Selecione todos os três modelos (Ctrl + A), botão direito do mouse e clique em Modelos de grupo.
7. Salve os modelos do cartão de certeza Digital (SD). Cura, automaticamente, salve o arquivo como gcode que é lido pela impressora.

5. 3D impressão porosas andaimes

1. Insira o tubo de transferência o bocal e conectá-lo 400 µm de bocal. Nivele a placa de compilação para obter a distância correta entre a placa de compilação e o bocal.
2. Carregar a seringa centrifugada no cartucho e conectá-lo ao outro lado do tubo de transferência.
3. Insira o cartão SD na impressora, selecione limpar rápido e começar a purgar a tinta de hidrogel, até que ele começa a extrusão do bocal. Continue a purga para 2-3 minutos obter um fluxo homogêneo.
4. O cartão SD, selecione os arquivos gravados para andaimes de porosidade uniforme e gradiente e iniciar a impressão. Fique de olho na taxa de extrusão. Se necessário, ajuste a taxa de fluxo e velocidade em conformidade. Para o menor tamanho do pore, maior velocidade de uso combinado com baixa taxa de fluxo (50 mm/s e 70%).
   Nota: Não toque os andaimes impressos 3D.

6. a reticulação de 3D impresso andaimes

1. Após concluir a impressão 3D, delicadamente adicione gotas de 3 wt % de CaCl₂ para o cadafalso até que se torne completamente molhada. Espere por 5 min.
2. Transferi com muito cuidado o andaime da impressora para um recipiente de 50 mL com 3 wt % de CaCl₂. Deixá-lo durante a noite.
3. Lavar cuidadosamente com água destilada e transferir o andaime para um recipiente de 50 mL com 3 glutaraldeído de wt %. Deixá-lo durante a noite.
4. Lave bem e armazenar o andaime 3D impresso em água destilada.

7. teste de compressão

Nota: Executar testes de compressão com célula de carga 100 N na água a 37 ° C.

1. Encher o recipiente equipado com placa de base de compressão submersível com 2 L de água e inicie o sistema de aquecimento para alcançar a 37 ° C.
2. Inicializar o software de Bluehill Universal e configurar o método de teste. Selecione a geometria retangular espécime e escolher a opção de inserir dimensões antes de testar cada amostra.  Defina a taxa de deformação de 2 mm/min e o fim do resultado como 80% tensão compressiva juntamente com a força de 90 N.
3. Na seção de medição , selecione força, deslocamento, tensão de compressão e tensão compressiva. Escolha a opção de exportar dados como arquivos de texto para plotagem de futuro.
4. Defina o ponto zero extensão usando os controles de jog para abaixar a placa do crosshead tão perto como possível à placa de base.
5. Meça e anote as dimensões das amostras a serem testadas.
6. Quando a temperatura da água atinge 37 ° c, coloca a amostra na placa base.  Fixe a amostra, movendo a placa do crosshead, para que ele começa a tocar a amostra.
7. Subir o banho de água, para que as placas com meio amostra eles estão imersos em água.
8. Digite dimensões e nome de amostra. Inicie o teste.
9. Após concluir o teste, primeiro mover o banho de água para baixo e em seguida levante a placa do crosshead.
10. Retire a amostra e suas peças, se houver, limpe ambas as placas e carregar uma nova amostra.
11. Depois de todas as amostras são testadas, exporte os dados brutos. Plotar o esforço compressivo vs curvas deformação compressiva e determinar o módulo de elasticidade tangente compressivo em valores de tensão de 15% e 25-30%.
    Nota: Coloque o cubo gradiente de tal forma que os furos maiores enfrentam a placa base de artigos de papelaria.
    Primeiro segurar o andaime entre as alças e em seguida iniciar/parar a medição.

Resultados

CNCs baseados nanocompósitos hidrogel tinta mostra um forte cisalhamento não-newtonianos, diluindo o comportamento (Figura 2a). A viscosidade aparente de 1,55 × 10⁵ PA. s a uma taxa de baixo cisalhamento (0.001 s^-1) gotas por cinco ordens de magnitude para um valor de 22.60 PA. s a uma taxa de cisalhamento de 50 s^-1 (≈50 s^-1 sendo uma taxa de cisalhamento típico experiente durante a impressão 3D)³¹ . ...

Discussão

Impressão 3D requer Propriedades reológicas adequadas da tinta hidrogel. A tinta de alta viscosidade exigirá pressões extremas para sua extrusão enquanto tinta de baixa viscosidade não manterá sua forma após a extrusão. A viscosidade da tinta hidrogel pode ser controlada através da concentração dos ingredientes. Em comparação com o nosso trabalho anterior¹¹, o teor de sólidos da tinta hidrogel é aumentou de 5,4 para 9,9% em peso resultando em hidrogel concentrada a tinta que ajuda ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mL syringe	Structur3D Printing
Alginic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	9005-38-3
Anhydrous calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Clamps, three pronged, Talon	VWR	241-0404	102 mm, Dual adjustment clamp, large, clamp extension 127 mm
Cura 2.4.0	Ultimaker		Free slicing software
Discov3ry Complete	Structur3D Printing		Ultimaker 2+ 3D printer integrated with Discov3ry paste extruder
Gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Glutaraldehyde solution 50 wt. % in H2O	Sigma-Aldrich	111-30-8
homogenizer	SPX	APV-2000
Instron 5960	Instron		Instron 5960, Biopuls Bath, 100 N load cell, 37 °C,
Physica MCR 301 rheometer	Anton Paar		CP25-2-SN7617, gap height 0.05 mm, 25 °C
Sorvall Lynx 6000 centrifuge	AB Ninolab	s/n 41881692	F12-rotor (6x500 ml)
stainless steel nozzle	Structur3D Printing		800, 600 and 400 µm
thingsinverse	MakerBot's		sharing and downloading 3D printable things in form of stl files
ultra sonication	Qsonica, LLC	Q500
Unbarked wood chips	Norway spruce(Picea abies)		dry matter content of 50–55%