סידן קרבונט היווצרות בנוכחות של תוספים Biopolymeric

Summary

אנו מתארים פרוטוקול למשקעים ואפיון של גבישי סידן פחמתי היוצרים בנוכחות biopolymers.

Abstract

ביומינרליזציה היא היווצרות של מינרלים בנוכחות של מולקולות אורגניות, הקשורות לעתים קרובות עם תפקידים פונקציונליים ו/או מבניים באורגניזמים חיים. זהו תהליך מורכב ולכן פשוט, בתוך מבחנה, מערכת נדרשת כדי להבין את ההשפעה של מולקולות מבודדות על תהליך ביומינרליזציה. במקרים רבים, ביומינרליזציה מופנית על ידי biopolymers במטריצה המלווה. כדי להעריך את ההשפעה של biopolymers מבודדים על המבנה ועל מבנה הקלציט במבחנה, השתמשנו בשיטת פיזור האדים למשקעים בסידן פחמתי, סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני ומיקרו ראמאן לאפיון, ואולטרה-סגול לעין (UV/Vis) ספיגת למדידת כמות הביופולימרים בגבישים. בשיטה זו, אנו חושפים את הbiopolymers הבודדות, המומסים בתמיסת סידן-כלוריד, לאמוניה בעלת גז ופחמן דו-חמצני שמקורם בפירוק של אמוניום פחמתי מוצק. תחת התנאים שבהם מגיעה התוצר המסיסות של סידן פחמתי, נוצרים סידן-פחמתי וגבישים. סידן פחמתי יש פולימורטים שונים הנבדלים ביציבות תרמודינמיים שלהם: סידן פחמתי אמורפיות, vaterite, ארגוניט, ו קלציט. בהעדר biopolymers, בתנאים נקיים, סידן קרבונט הוא בעיקר בצורת הקלציט, שהוא הפולימלדינמי ביותר של סידן פחמתי. שיטה זו בוחנת את השפעת התוספים הbiopolymeric על המבנה ועל מבנה גבישי הסידן פחמתי. כאן, אנו להדגים את הפרוטוקול באמצעות לימוד של חלבון בקטריאלי מתוך החילוץ, טאפה, על היווצרות של גבישי סידן פחמתי. ליתר דיוק, אנו מתמקדים בניסוי שהוגדר, ואפיון שיטות, כגון מיקרוסקופ אופטי ואלקטרוני, כמו גם ספקטרוסקופיית מסוג ראמאן.

Introduction

ביומינרליזציה היא היווצרות של מינרלים בנוכחות של מולקולות אורגניות, הקשורות לעתים קרובות עם תפקידים פונקציונליים ו/או מבניים באורגניזמים חיים. ביומינרליזציה עשויה להיות תאיים, כמו היווצרות של מגנטיט בתוך חיידקים מגנטוטקטיקה¹, או מסחטות, כמו היווצרות סידן פחמתי ב קיפוד ים קוצים², של הידרוקסיטיט הקשור קולגן ב עצמות³ ו האמייל כי הוא קשור amelogenin בשיניים⁴. ביומינרליזציה הוא תהליך מורכב שתלוי בפרמטרים רבים באורגניזם החי. לכן, על מנת לפשט את המערכת בלמידה, יש צורך להעריך את ההשפעה של רכיבים נפרדים בתהליך. במקרים רבים, ביומינרליזציה נגרמת על ידי נוכחות של biopolymers. מטרת השיטה המוצגת כאן היא כדלקמן: (1) כדי ליצור גבישי סידן פחמתי בנוכחות biopolymers מבודדים במבחנה, באמצעות שיטת דיפוזיה אדים. (2) ללמוד את השפעת הbiopolymers על המבנה ועל מבנה הסידן קרבונט.

שלוש שיטות עיקריות לזרז סידן פחמתי בתוך מבחנה בנוכחות תוספים אורגניים משמשים^5,6. השיטה הראשונה, שנתייחס אליה כאל שיטת הפתרון, מבוססת על ערבוב מלח מסיס של סידן (כגון CaCl₂) עם מלח מסיס של קרבונט (למשל, נתרן פחמתי). תהליך ערבוב יכול להתבצע במספר דרכים: בתוך הכור עם שלושה תאים המופרדים על ידי נקבובי ממברנות⁷. כאן, כל אחד מהתאים החיצוניים מכיל מלח מסיס והתא המרכזי מכיל פתרון עם התוסף שייבדק. סידן פחמתי לפזר מן החיצוני לתא האמצעי, וכתוצאה מכך את המשקעים של קרבונט מסיסים פחות סידן כאשר ריכוזי סידן פחמתי לחרוג מוצר מסיסות שלהם, K_sp = [Ca^{2 +}] [שיתוף₃ ^2-]. שיטת ערבוב נוספת היא הפרוצדורה כפולה מטוס⁸. בשיטה זו, כל מלח מסיסים מוזרק ממזרק נפרד לפתרון מעורבב המכיל את התוסף, שבו סידן קרבונט מזרז. כאן, ההזרקה ולכן שיעור ערבוב הוא נשלט היטב, לעומת השיטה הקודמת שבה ערבוב נשלט על ידי דיפוזיה.

השיטה השנייה המשמשת כדי להתגבש CaCO₃ היא שיטה הקיטאנו⁹. שיטה זו מבוססת על שיווי משקל פחמתי/מימן פחמתי (2hco₃^- _(aq) + Ca^{2 +}_(aq) caco_{3 (עם)} + CO_{2 (g)} + H₂O _(l)). כאן, CO₂ הוא בעבע לתוך פתרון המכיל caco₃ בצורה מוצקה, העברת שיווי משקל שמאלה ולכן המסת סידן פחמתי. קרבונט הסידן הבלתי מומס מסונן והתוספים הרצויים נוספים לפתרון הביקרבונט-עשיר. CO₂ מותר אז להתאדות, ובכך להעביר את התגובה ימינה, ויוצרים סידן פחמתי בנוכחות של התוספים.

השיטה השלישית של התגבשות סידן פחמתי, אשר נתאר כאן, היא שיטת פיזור האדים¹⁰. בהגדרה זו, התוסף האורגני, הנמס בתמיסה של סידן כלוריד, מוצב בתא סגור ליד אמוניום פחמתי בצורת אבקה. כאשר האבקה אמוניום פחמתי מפרקת לתוך פחמן דו חמצני ו אמוניה, הם מפוזר לתוך הפתרון המכיל יוני סידן (למשל, CaCl₂), סידן פחמתי הוא זירז (ראה איור 1 להמחשה). גבישי הסידן פחמתי יכולים לצמוח באמצעות משקעים איטיים או משקעים מהירים. עבור משקעים איטיים, פתרון המכיל את התוסף ב-CaCl₂ פתרון ממוקם בdesiccator ליד אבקת אמוניום פחמתי. במשקעים מהירים, המתוארים באורך הפרוטוקול, הן הפתרון התוסף והן האמוניום קרבונט ממוקמים קרוב יותר בצלחת מרובת הצלחות. שיטת המשקעים האיטית תיצור פחות מרכזי התגררות וקריסטלים גדולים יותר, והמשקעים המהירים יגרמו ליותר מרכזי התגרמות וקריסטלים קטנים יותר.

השיטות המתוארות לעיל שונות במורכבות הטכנולוגית שלהם, ברמת השליטה ובקצב המשקעים. שיטת הערבוב מחייבת הערכה מיוחדת⁶ עבור הסילון הכפול ומערכת שלושה תאים. בשיטת הערבוב, נוכחותם של יונים מונים מסיסים אחרים (למשל, Na⁺, Cl^-)⁶ היא בלתי נמנעת, ואילו בשיטת הקיטאנו, הסידן (bi) פחמתי הם היונים היחידים בתמיסה, והיא אינה כרוכה בנוכחות נוספים יונים מונים (לדוגמה, Na⁺, קלרנית^-). יתרה מזאת, שיטת הערבוב דורשת כמויות גדולות יחסית ולכן היא אינה מתאימה לעבודה עם biopolymers יקר. היתרון של הסילון הכפול הוא שניתן לשלוט על קצב הזרקת הפתרון וכי הוא תהליך מהיר בהשוואה לשיטות אחרות.

היתרון של שיטת קיטאנו ואת שיטת דיפוזיה אדים היא כי היווצרות של סידן פחמתי נשלטת על ידי הדיפוזיה של CO₂ לתוך/מתוך פתרון cacl₂ , ובכך מאפשר לחקור התגררות איטי תהליכי משקעים מיכל בן ^{11 , 12}. יתר על כן, סידן קרבונט היווצרות על ידי דיפוזיה של CO₂ עשוי להידמות לתהליכי הסתיידות ב vivo^13,14,15. בשיטה זו, קריסטלים מוגדרים היטב ומופרדים, נוצרים¹⁶. אחרון, ההשפעה של biopolymers יחיד או מרובים על היווצרות סידן פחמתי ניתן לבדוק. זה מאפשר מחקר שיטתי של ההשפעה של סדרה של ריכוזי התוסף על היווצרות סידן פחמתי, כמו גם מחקר של תערובות של biopolymers-all בוצע באופן מבוקר. שיטה זו מתאימה לשימוש עם מגוון רחב של ריכוזים וכמויות גדולות של תוספים. אמצעי האחסון המינימלי המשמש הוא כ 50 μL ולכן שיטה זו היא יתרון כאשר יש כמות מוגבלת של biopolymers זמין. אמצעי האחסון המקסימלי תלוי בנגישות של צלחת היטב גדולה יותר, או הdesiccator שאליה מוכנסים הלוחית או המבחנה המכילה את ה-CaCl₂ . השיטה המתוארת להלן ממוטבת לעבודה בצלחת 96-באר עם ביופולימרים נבחר להיות החלבון טאפה¹⁷.

Protocol

1. התגבשות סידן פחמתי

1. הכנה ואופטימיזציה של השליטה
   1. הכינו חתיכות זכוכית נקיות. השתמש באותו תהליך ניקוי כדי לנקות את כלי הזכוכית.
      1. השתמש בעט יהלום כדי לגזור פיסות של שקופית זכוכית מיקרוסקופ כך שהם מתאימים היטב של צלחת 96-באר.
         הערה: 5 מ"מ x 5 מילימטר חתיכות צריך להתאים במידה רבה.
      2. מניחים את חתיכות זכוכית בגביע עם מים מזוקקים משולשת (TDW) כך מים מכסה את שקופיות זכוכית sonicate באמבטיה sonicator עבור 10 דקות.
      3. Decant את המים, להוסיף אתנול לכסות את שקופיות זכוכית, ו sonicate באמבטיה sonicator עבור 10 דקות.
      4. יבש את השקופיות ואת כלי הזכוכית עם זרם של גז חנקן ולמקם אותם במנקה אוויר פלזמה 10 דקות ב 130 W.
   2. מיטוב הריכוז של ה-CaCl₂ המשמש בניסויי הסתיידות שבוצעו תחת התנאים הניסיוניים הרצויים כדי להשיג מדגם עשיר בגבישי קלציט חלקים (ללא או לפחות עם מספר נדיר של vaterite קריסטלים).
      1. ממלאים את הבארות בפינות של צלחת 96-באר עם אבקת אמוניום פחמתי לאטום את הצלחת באמצעות רדיד אלומיניום; כסות את רדיד הנייר בסרט פרפין. נקו כל שרידי אמוניום פחמתי. באמצעות גז חנקן
         התראה: אמוניום פחמתי מרגיז האף והריאות; השתמש רק בתוך מכסה המנוע.
      2. הכינו פתרון מניות של 0.5 M CaCl₂. פתרון מניות זה ישמש כדי להכין הדרגתי של ריכוזים של CaCl₂ פתרונות בצלחת מרובת היטב.
         הערה: פתרון מניות של 10 מ"ל מספיק עבור הניסוי כולו.
      3. מניחים את חתיכות זכוכית שנוקו בעבר לחמש בארות שונות. השתמשו בבארות הקרובות ביותר למרכז.
      4. מילוי כל טוב הנושאת פיסת זכוכית עם 100 μL של CaCl₂ פתרון¹⁶. מערבבים TDW ו 0.5 M CaCl₂ (מניות) כדי להשיג הדרגתי ריכוז הולך וגובר של cacl₂ על פני בארות שונות. אם נעשה שימוש בצלחת בגודל שונה, התאימו את הריכוז של CaCl₂ כדי להשיג קריסטלים של קלציט נפרדים (שלב 1.1.2.10, וראה מקטע דיונים).
         הערה: הדרגה הגדלה של CaCl₂ של 10, 20, 30, 40, 50 מ"מ ריכוזים בבארות נפרדות משמשת בפרוטוקול זה. כדי להגביר את טווח הריכוז או את מספר הריכוזים שנבדקו, השתמשו בבארות נוספות.
      5. נקב את המכסה של כל הבארות המכילות אמוניום פחמתי 3x עם מחט.
      6. לשים בחזרה את המכסה, לאטום את הגבולות עם סרט פרפין ולשמור אותו ב 18 ° c באינקובטור במשך 20 h.
      7. לאחר הדגירה, לפתוח את המכסה בזהירות בתוך מכסה המנוע ולהסיר את הקריסטלים הנוצרים על ממשק המים/האוויר עם לולאה.
      8. השתמש בטוויזר כדי להעביר את חתיכות הזכוכית לתוך גביע המכיל מים כפולים בעלי החמצן (DDW). הסר את הדגימות מהגביע והשתמש בקלטת דו צדדית כדי לתקן את חתיכות הזכוכית על החלק התחתון של צלחת פטרי.
      9. מים יבשים מוגזמת נוגעים בגבולות השקופית עם מגבונים לרקמות. כסו את צלחת הפטרי והניחו אותה בdesiccator למשך 24 שעות.
      10. צפו בקריסטלים הנוצרים על פיסות הזכוכית באמצעות סטריאוסקופ (הגדלה של 3.5 x) ו/או מיקרוסקופ אופטי זקוף (הגדלה בגודל 10x-40x). אם פתרונות הבקרה נקיים, גבישים מעוכי מודרתיים (כנראה קלציט) יהיו מצופים במיקרוסקופ אופטי (איור 2א).
      11. אם בנוסף לקריסטלים מנגד, השליטה מכילה גבישים כדוריים (הסביר ביותר, איור 2ב'), או אם סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) מראה גבישים מעוכתיים עם פרצופים גסים ולא חלקים ( איור 3 A, B), חזור על פרוטוקול התגבשות וודא ששלב הניקוי (1.1.1) מבוצע כראוי. יתר על כן, לדאוג יותר כי אין אמוניום פחמתי באזורים על הצלחת פרט לבארות ייעודי. אחרת, המשך לשלב הבא.
2. התגבשות בנוכחות התוספים
   1. כדי ללמוד את ההשפעה של התוספים על התגבשות של CaCO₃, להגדיר צלחת מרובת היטב המכילה (בבארות שונות), שליטה cacl₂ פתרון ללא תוספים, ו-cacl₂ פתרונות עם התוספים. השתמש בריכוז האופטימלי של CaCl₂ שנמצא בסעיף 1.1.2 עבור הניסוי.
      הערה: הפרוטוקול שלהלן משתמש בתנאים אופטימליים כפי שדווחו במחקר הקודם¹⁶.
   2. חזור על שלב ה1.1.2.2.
   3. מניחים אבקה אמוניום פחמתי בפינות הלוחית כמתואר בשלב 1.1.2.1.
   4. בכל הבאר שבה יתרחש משקעים, הניחו פיסת זכוכית שנחתכה ונוקתה כמתואר בסעיף 1.1.1.
   5. כדי להכין בארות שליטה, פיפטה 90 μL של TDW לתוך בארות הבקרה. הכינו לפחות שכפול אחד של כל היטב כולל השליטה. אם התוסף המשמש בפתרון מאגר, אז פיפטה 90 μL של מאגר במקום המים TDW.
   6. הכן את הבארות המכילות את התוסף. חזור על שלב 1.2.5 על-ידי הוספת 90 μL של הפתרון התוסף במים. אם התוסף נמצא במאגר (במקום TDW), התאם מראש את ריכוז התוסף עם המאגר כדי לעמוד בהתרכזות הסופית הרצויה. שמור על נפח כולל של 90 μL; , קודם התוסף. ואז המאגר
      הערה: ריכוז סופי של 10 μM של טאפה חלבון ב 100 mM הנאקל, 25 mM טריס pH 8.0 מאגר¹⁶ משמש בפרוטוקול זה.
   7. הוסף 10 μL של 0.5 M CaCl₂ מניות פתרון (מוכן בשלב 1.2.2) הן הפקדים ואת התוספים המכילים בארות כדי להגיע לריכוז הסופי של 50 MM cacl₂.
   8. חזור על שלבים 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. אפיון גבישי סידן פחמתי

1. עם מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה, להתבונן בגבישים פחמתי סידן שנוצרו בנוכחות התוספים ברזולוציה גבוהה יותר מאשר מושגת על ידי מיקרוהעתק אופטי (ראה שלב 1.1.2.10).
   1. הר את חתיכות זכוכית המכילה את הקריסטלים על stub אלומיניום עם נייר פחמן דו צדדי.
   2. מעיל עם שכבה של Au/משטרת עבור 40-50 s.
   3. השיגו את התמונות. במתח של 5 kV
      הערה: איור 3מראה תמונת SEM מייצגת של גבישי סידן פחמתי הנוצרת בניסוי שליטה נאות, בעוד שאיור 4 מראה תמונות מייצגות של גבישי סידן פחמתי שנוצרו בנוכחות החלבון טאפה .
2. בצע ספקטרוסקופיית מיקרו כדי לקבוע את הסידן פחמתי פולימלי נוצר. מיקרו ראמאן מאפשר את האוסף של ספקטרום ראמאן מקריסטלים בודדים ולא מאבקה שלמה.
   1. השתמש במטרה 20x של המיקרוסקופ כדי לבחור את הקריסטל של הריבית.
   2. לאסוף את הספקטרום ראמאן בטווח של 100-3200 ס מ^-1 באמצעות לייזר ארגון 514 ננומטר.
      הערה: איור 5 מראה ספקטרום ייצוגי של קלציט (א) ו-vaterite (ב). עבור הספקטרום של ארגוניט, התייחס להפניה¹⁸.
3. כימות האחוז ההמוני של התוספים ב-CaCO₃ מאיצים
   1. אמת/מדידה של מקדם המחיקה (ε) של התוסף שבשימוש. מקדם הכחדה של חלבון יכול להינתן על ידי שרתים מקוונים¹⁹. אם מקדם ההכחדה אינו ידוע, יש למדוד את ספיגת התוסף בריכוזים שונים, להתוות את ספיגת לעומת ריכוז ולחשב את מקדם ההשמדה משיפוע העקומה.
   2. שוקלים את חתיכות הזכוכית שבהן נוצרו הקריסטלים, רצוי להשתמש במיקרו-איזון.
   3. גרוטאות הגבישים את הזכוכית לתוך 1.2 mL של 0.1 M חומצה אצטית תמיסה, מערבולת וsonicate את המדגם. לאחסן את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 24 שעות.
      התראה: חומצה אצטית מסוכנת מאוד במקרה של העור או מגע העין; לטפל בזהירות ולהיפטר בהתאם לתקנות.
   4. שוקלים את שקופית הזכוכית. לאחר גירוד הקריסטלים
   5. מדוד את הספקטרום האולטרא-סגול (A) של הפתרון. אם התוסף הוא חלבון, למדוד את ספיגת ב 280 ננומטר ולחשב את הריכוז שלה (ג), באמצעות משוואת בירה-למברט:
      
      כאשר l הוא הנתיב האופטי בתוך קובט.
   6. השתמשו בריכוז (C) שנמצאו ב2.3.5 ובאמצעי האחסון שבשימוש (V = 1.2 mL) כדי לחשב את המסה (m) של התוספים ב/על הקריסטלים. אם הריכוז הוא mg/mL, השתמש במשוואה C ● V = m.
      1. אם הריכוז הוא מול/L, אז לחשב את שומות (n) החלת C ● V = n. לאחר מכן השתמש במשקל המולקולרי (Mw) כדי לחשב את המסה (m) של התוספים (m = n ● Mw).
   7. לחשב את אחוז המשקל של התוספים ב/על הקריסטלים באמצעות המשוואה:, כאשר m הוא מסה של התוספים, ו Δm_s הוא מסה של גבישי הסידן פחמתי שהיו מכוסות בזכוכית חתיכת.

תוצאות

סכימטי של הערכה הניסיונית מוצג באיור 1. בקצרה, שיטת דיפוזיה משמש כדי ליצור גבישי סידן פחמתי ב 96-היטב צלחות ולבדוק את ההשפעה של biopolymers על המבנה ומבנה של גבישי סידן פחמתי. בניסויים אלה, אמוניום פחמתי מפורקת לתוך אמוניה ושות₂, אשר מפוזר לתוך פתרונות סידן פחמתי, וכתוצאה מכך ...

Discussion

השיטה המתוארת כאן מיועדת ליצירת גבישי סידן פחמתי בנוכחות תוספים אורגניים והערכת ההשפעה של biopolymers אורגני על מורפולוגיה ומבנה של גבישי סידן פחמתי ב מבחנה. השיטה מבוססת על השוואת הקריסטלים הנוצרים בנוכחות התוספים האורגניים לקריסטלים הקלציט שנוצרו בניסוי השליטה. הצגנו כיצד להשתמש בשיטת הדי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model