Formazione carbonato di calcio in presenza di additivi biopolimerici

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per la precipitazione e la caratterizzazione di cristalli di carbonato di calcio che si formano in presenza di biopolimeri.

Abstract

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. Si tratta di un processo complesso e quindi è necessario un sistema semplice, in vitro, per comprendere l'effetto delle molecole isolate sul processo di biomineralizzazione. In molti casi, la biomineralizzazione è diretta da biopolimeri nella matrice extracellulare. Per valutare l'effetto dei biopolimeri isolati sulla morfologia e la struttura della calcite in vitro, abbiamo utilizzato il metodo di diffusione del vapore per la precipitazione del carbonato di calcio, la microscopia elettronica a scansione e il micro Raman per la caratterizzazione, e assorbimento visibile all'ultravioletto (UV/Vis) per misurare la quantità di un biopolimero nei cristalli. In questo metodo esponiamo i biopolimeri isolati, disciolti in una soluzione di cloruro di calcio, in ammoniaca gassosa e anidride carbonica che derivano dalla decomposizione del carbonato di ammonio solido. Nelle condizioni in cui viene raggiunto il prodotto di solubilità del carbonato di calcio, si formano precipitati e cristalli di carbonato di calcio. Il carbonato di calcio di calcio ha diversi polimorfi che differiscono nella loro stabilità termodinamica: carbonato di calcio amorfo, vaterite, aragonite e calcite. In assenza di biopolimeri, in condizioni pulite, il carbonato di calcio è presente principalmente nella forma di calcite, che è il polimorfo più termodinamicamente stabile del carbonato di calcio. Questo metodo esamina l'effetto degli additivi biopolimerici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. Qui, dimostriamo il protocollo attraverso lo studio di una proteina batterica extracellulare, TapA, sulla formazione di cristalli di carbonato di calcio. In particolare, ci concentriamo sull'impostazione sperimentale e sui metodi di caratterizzazione, come la microscopia ottica ed elettronica e la spettroscopia Raman.

Introduzione

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. La biomineralizzazione può essere intracellulare, come nella formazione di magnetite all'interno di batteri magnetotattici¹, o extracellulare, come nella formazione di carbonato di calcio nei picchi di riccio di mare², di idrossiapatite che è correlato con collagene in ossa³ e di smalto che è associato con amelogenin adenti⁴. La biomineralizzazione è un processo complesso che dipende da molti parametri nell'organismo vivente. Pertanto, al fine di semplificare il sistema in esame, è necessario valutare l'effetto di componenti separati sul processo. In molti casi, la biomineralizzazione è indotta dalla presenza di biopolimeri extracellulari. Lo scopo del metodo qui presentato è il seguente: (1) Formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di biopolimeri isolati in vitro, utilizzando un metodo di diffusione del vapore. (2) Studiare l'effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura del carbonato di calcio.

Tre metodi principali per precipitare carbonato di calcio in vitro in presenza di additivi organici sono utilizzati^5,6. Il primo metodo, che ci riferiremo come il metodo della soluzione, si basa sulla miscelazione di un sale solubile di calcio (ad esempio, CaCl₂) con un sale di carbonato solubile (ad esempio, carbonato di sodio). Il processo di miscelazione può essere eseguito in diversi modi: all'interno di un reattore con tre cellule separate da membrane porose⁷. Qui, ciascuna delle cellule esterne contiene un sale solubile e la cella centrale contiene una soluzione con l'additivo da testare. Calcio e carbonato si diffondono dall'esterno alla cellula centrale, causando la precipitazione del carbonato di calcio meno solubile quando le concentrazioni di calcio e carbonato superano il loro prodotto di sobrietà, K_sp ^2-]. Un ulteriore metodo di miscelazione è la procedura a doppio getto⁸. In questo metodo, ogni sale solubile viene iniettato da una siringa separata a una soluzione mescolata contenente l'additivo, dove precipita il carbonato di calcio. Qui, l'iniezione e quindi il tasso di miscelazione è ben controllato, in contrasto con il metodo precedente in cui la miscelazione è controllata dalla diffusione.

Il secondo metodo utilizzato per cristallizzare CaCO₃ è il metodo Kitano⁹. Questo metodo si basa sull'equilibrio carbonato/idrogeno carbonato (2HCO₃^- _(aq) - Ca^2'_(aq) CaCO 3_(s) - CO 2_(g) - H₂O _(l)). Qui, CO₂ viene bollato in una soluzione contenente CaCO₃ in una forma solida, spostando l'equilibrio a sinistra e quindi sciogliendo il carbonato di calcio. Il carbonato di calcio non disciolto viene filtrato e gli additivi desiderati vengono aggiunti alla soluzione ricca di bicarbonato. Co₂ è quindi lasciato evaporare, spostando così la reazione a destra, formando carbonato di calcio in presenza degli additivi.

Il terzo metodo di cristallizzazione carbonata di calcio, che descriveremo qui, è il metodo di diffusione del vapore¹⁰. In questo set-up, l'additivo organico, sciolto in una soluzione di cloruro di calcio, viene posto in una camera chiusa vicino al carbonato di ammonio in forma di polvere. Quando la polvere di carbonato di ammonio si decompone in anidride carbonica e ammoniaca, si diffondono nella soluzione contenente ioni di calcio (ad esempio, CaCl₂), e il carbonato di calcio è precipitato (vedere la figura 1 a illustrazione). I cristalli di carbonato di calcio possono crescere da precipitazioni lente o da precipitazioni veloci. Per la lenta precipitazione, una soluzione contenente l'additivo nella soluzione CaCl₂ viene posta in un desiccatore accanto alla polvere di carbonato di ammonio. Nella precipitazione veloce, descritta in lunghezza nel protocollo, sia la soluzione additiva che il carbonato di ammonio vengono posizionati più vicini in una piastra multi-bene. Il metodo di precipitazione lenta produrrà meno centri di nucleazione e cristalli più grandi, e la precipitazione veloce si tradurrà in più centri di nucleazione e cristalli più piccoli.

I metodi sopra descritti differiscono nella loro complessità tecnica, nel livello di controllo e nella velocità del processo di precipitazione. Il metodo di miscelazione richiede un set-up speciale⁶ sia per il doppio getto che per il sistema a tre celle. Nel metodo di miscelazione, la presenza di altri controioni solubili (ad es., Na^,Cl^-)⁶ è inevitabile, mentre nel metodo Kitano, il calcio e il (bi) carbonato sono gli unici ioni in soluzione e non comporta la presenza di ulteriori ioni contatore (ad es., Na^,Cl^-). Inoltre, il metodo di miscelazione richiede volumi relativamente grandi e quindi non è adatto per lavorare con biopolimeri costosi. Il vantaggio del doppio getto è che è possibile controllare la velocità di iniezione della soluzione e che si tratta di un processo rapido rispetto ad altri metodi.

Il vantaggio del metodo Kitano e del metodo di diffusione del vapore è che la formazione di carbonato di calcio è controllata dalla diffusione di CO₂ in una soluzione CaCl_2, permettendo così di sondare processi di nucleazione e precipitazioni più lenti ^{11 Del} sistema di ^{, 12}. Inoltre, la formazione di carbonato di calcio per diffusione di CO₂ può assomigliare ai processi di calcificazione in vivo^13,14,15. In questo metodo, i cristalli ben definiti e separati sono formati¹⁶. Infine, è possibile testare l'effetto di biopolimeri singoli o multipli sulla formazione di carbonato di calcio. Ciò consente uno studio sistematico dell'effetto di una serie di concentrazioni additive sulla formazione di carbonato di calcio, nonché uno studio di miscele di biopolimeri - il tutto eseguito in modo controllato. Questo metodo è adatto per l'uso con una vasta gamma di concentrazioni e volumi di additivi. Il volume minimo utilizzato è di circa 50 gradi e quindi questo metodo è vantaggioso quando c'è una quantità limitata di biopolimeri disponibili. Il volume massimo dipende dall'accessibilità di un pozzo più grande o dal desiccatore in cui devono essere inseriti la piastra o il becher contenente CaCl 2. Il metodo descritto di seguito è stato ottimizzato per lavorare in una piastra di 96 pozze con un biopolimero scelto per essere la proteina TapA¹⁷.

Protocollo

1. Cristallizzazione carbonata di calcio di calcio

1. Preparazione e ottimizzazione dei controlli
   1. Preparare pezzi di vetro puliti. Utilizzare la stessa procedura di pulizia per pulire la vetreria.
      1. Utilizzare una penna a diamante per tagliare pezzi di un vetrino del microscopio in vetro in modo che si adattino in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti.
         NOTA: i pezzi da 5 mm x 5 mm devono adattarsi in gran parte.
      2. Mettere i pezzi di vetro in un becher con tripla acqua distillata (TDW) in modo che l'acqua copra gli scivoli di vetro e sonica in un toelettatore da bagno per 10 min.
      3. Decant l'acqua, aggiungere etanolo per coprire gli scivoli di vetro, e sonicare in un toelista bagno per 10 min.
      4. Asciugare i vetrini e le vetrerie con un flusso di gas di azoto e metterli in un detergente al plasma d'aria per 10 min a 130 W.
   2. Ottimizzare la concentrazione del CaCl₂ utilizzato negli esperimenti di calcificazione eseguiti nelle condizioni sperimentali desiderate per ottenere un campione ricco di cristalli di calcite sfaccettati (senza o almeno con un numero scarso di vaterite cristalli).
      1. Riempire i pozze agli angoli di una piastra di 96 pozze con polvere di carbonato di ammonio e sigillare la piastra utilizzando un foglio di alluminio; coprire la pellicola con pellicola di paraffina. Pulire qualsiasi carbonato di ammonio residuo utilizzando gas di azoto.
         AVVISO: il carbonato di ammonio irrita naso e polmoni; utilizzare solo all'interno del cofano del fume.
      2. Preparare una soluzione di riserva di 0,5 M CaCl₂. Questa soluzione stock sarà utilizzata per preparare un gradiente di concentrazioni di soluzioni CaCl₂ nella piastra multi-bene.
         NOTA: una soluzione di riserva da 10 mL è sufficiente per l'intero esperimento.
      3. Collocare i pezzi di vetro precedentemente tagliati e puliti in cinque pozzi diversi. Utilizzare i pozzi più vicini al centro.
      4. Riempire ogni pozzetto con un pezzo di vetro con 100 gradi di una soluzione CaCl₂ ¹⁶. Mescolare TDW e 0,5 M CaCl₂ (stock) per ottenere un gradiente di concentrazione crescente di CaCl₂ attraverso i diversi pozzi. Se viene utilizzata una piastra di dimensioni diverse, regolare la concentrazione di CaCl₂ per ottenere cristalli di calcite separati (passaggio 1.1.2.10 e vedere sezione Discussione).
         NOTA: in questo protocollo viene utilizzata una sfumatura CaCl₂ crescente di 10, 20, 30, 40,50 mM in pozze separate. Per aumentare l'intervallo di concentrazione o il numero di concentrazioni testate, utilizzare pozzi aggiuntivi.
      5. Forare il coperchio di ciascuno dei pozzi contenenti carbonato di ammonio 3x con un ago.
      6. Rimettere il coperchio, sigillare i bordi con pellicola di paraffina e tenerlo a 18 gradi centigradi in un'incubatrice per 20 h.
      7. Dopo l'incubazione, aprire il coperchio con attenzione all'interno di un cappuccio fume e rimuovere i cristalli formati all'interfaccia acqua/aria con un anello.
      8. Utilizzare una pinzetta per trasferire i pezzi di vetro in un becher contenente doppia acqua distillata (DDW). Togliere i campioni dal becher e utilizzare un nastro a due lati per fissare i pezzi di vetro sul fondo della piastra Petri.
      9. Asciugare l'acqua eccessiva toccando i bordi del vetrino con salviette tissutali. Coprire il piatto di Petri e metterlo in un desiccatore per 24 ore.
      10. Osservare i cristalli formati sui pezzi di vetro con uno stereoscopio (ingrandimento 3,5x) e/o un microscopio ottico verticale (ingrandimento 10x-40x). Se le soluzioni di controllo sono pulite, i cristalli romboedri (molto probabilmente calcite) saranno osservati con un microscopio ottico (Figura 2A).
      11. Se oltre ai cristalli romboedri, il controllo contiene cristalli sferici (molto probabilmente vaterite, Figura 2B),o se le immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) mostrano cristalli romboedri con facce ruvide piuttosto che lisce ( Figura 3 A,B), ripetere il protocollo di cristallizzazione assicurandosi che la fase di pulizia (1.1.1) venga eseguita correttamente. Inoltre, fare meglio cura che non c'è carbonato di ammonio in aree sulla piastra diversa dai pozzi dedicati. In caso contrario, continuare con il passaggio successivo.
2. Cristallizzazione in presenza degli additivi
   1. Per studiare l'effetto degli additivi sulla cristallizzazione di CaCO₃, impostare una piastra multi-bene che contiene (in diversi pozzi), un controllo CaCl₂ soluzione senza gli additivi, e CaCl₂ soluzioni con gli additivi. Utilizzare la concentrazione ottimale di CaCl₂ trovata nella sezione 1.1.2 per l'esperimento.
      NOTA: il protocollo riportato di seguito utilizza condizioni ottimali come quelle riportate in uno studio precedente¹⁶.
   2. Ripetere il passaggio 1.1.2.2.
   3. Collocare la polvere di carbonato di ammonio negli angoli della piastra come descritto al punto 1.1.2.1.
   4. In ogni pozzo in cui si verificheranno le precipitazioni, posizionare un pezzo di vetro che è stato tagliato e pulito come descritto nella sezione 1.1.1.
   5. Per preparare i pozzi di controllo, pipetta 90 -L di TDW nei pozzetti di controllo. Preparare almeno una replica di ogni pozzo, incluso il controllo. Se l'additivo utilizzato si trova in una soluzione di buffer, la pipetta è 90 - di tampone invece di acqua TDW.
   6. Preparare i pozzi contenenti additivi. Ripetere il passaggio 1.2.5 aggiungendo 90 gradi l della soluzione additiva in acqua. Se l'additivo è in tampone (invece di TDW), preregolare la concentrazione dell'additivo con buffer per soddisfare la concentrazione finale desiderata. Mantenere un volume totale di 90 l; pipetta prima l'additivo, poi il buffer.
      NOTA: In questo protocollo viene utilizzata una concentrazione finale di 10M della proteina TapA in 100 mM NaCl, 25 mM tris pH 8.0 buffer^16.
   7. Aggiungere 10 l della soluzione di riserva CaCl₂ da 0,5 M (preparata al punto 1.2.2) sia ai controlli che ai pozze di cassa contenenti additivi per raggiungere una concentrazione finale di 50 mM CaCl₂.
   8. Ripetere i passaggi 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. Caratterizzazione dei cristalli di carbonato di calcio

1. Con un microscopio elettronico a scansione, osservare i cristalli di carbonato di calcio formati in presenza degli additivi ad una risoluzione superiore a quella ottenuta dalla microscopia ottica (vedi passo 1.1.2.10).
   1. Montare i pezzi di vetro contenenti i cristalli su uno stub di alluminio con nastro di carbonio a doppia lato.
   2. Cappotto con strato di Au/Pd per 40-50 s.
   3. Acquisire le immagini a 5 kV di tensione di accelerazione.
      NOTA: La figura 3A mostra un'immagine SEM rappresentativa dei cristalli di carbonato di calcio formatisi in un corretto esperimento di controllo, mentre la Figura 4 mostra immagini rappresentative di cristalli di carbonato di calcio formati si formano in presenza della proteina TapA .
2. Eseguire la spettroscopia micro Raman per determinare i polimorfi di carbonato di calcio formati. Micro Raman permette la raccolta di uno spettro Raman da singoli cristalli piuttosto che da una polvere intera.
   1. Utilizzare un obiettivo 20x del microscopio per scegliere il cristallo di interesse.
   2. Raccogliere lo spettro Raman in un range di 100-3200 cm^-1 utilizzando un laser argon 514 nm.
      NOTA: la figura 5 mostra gli spettri rappresentativi della calcite (A) e del vaterite (B). Per lo spettro dell'aragonite, fare riferimento al riferimento¹⁸.
3. Quantificazione della percentuale di massa degli additivi nei precipitati CaCO₃
   1. Verificare/misurare il coefficiente di estinzione dell'additivo utilizzato. Il coefficiente di estinzione di una proteina può essere somministrato dai server online¹⁹. Se il coefficiente di estinzione è sconosciuto, misurare l'assorbimento dell'additivo a diverse concentrazioni, tracciare l'assorbimento rispetto alla concentrazione e calcolare il coefficiente di estinzione dalla pendenza della curva.
   2. Pesare i pezzi di vetro dove si sono formati i cristalli, preferibilmente utilizzare un microequilibrio.
   3. Raschiare i cristalli dal vetro in 1,2 mL di 0,1 M soluzione di acido acetico, vortice e sonicare il campione. Conservare il campione a temperatura ambiente per 24 ore.
      DATIERAzione: l'acido acetico è molto pericoloso in caso di contatto con la pelle o con gli occhi; essere prudenti e disporre seguendo le normative.
   4. Pesare lo scivolo di vetro dopo aver raschiato i cristalli.
   5. Misurare lo spettro uv/vis absorbance (A) della soluzione. Se l'additivo è una proteina, misurare l'assorbimento a 280 nm e calcolarne la concentrazione (C), utilizzando l'equazione di Beer-Lambert:
      
      dove l è il percorso ottico all'interno della cuvette.
   6. Utilizzare la concentrazione (C) che si trova nella versione 2.3.5 e il volume utilizzato (V : 1,2 mL) per calcolare la massa (m) degli additivi nei cristalli. Se la concentrazione è in mg/mL, utilizzare l'equazione C
      1. Se la concentrazione è in mol/L, calcolare le talpe (n) applicando C Quindi utilizzare il peso molecolare (Mw) per calcolare la massa (m) degli additivi (m
   7. Calcolare la percentuale di peso degli additivi nei cristalli utilizzando l'equazione: , dove m è la massa degli additivi, e _s è la massa dei cristalli di carbonato di calcio che sono stati demoliti dal vetro pezzo.

Risultati

Uno schema del set up sperimentale è illustrato nella Figura 1. In breve, il metodo di diffusione viene utilizzato per formare cristalli di carbonato di calcio in piastre di 96 pozze e testare l'effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. In questi esperimenti, il carbonato di ammonio viene decomposto in ammoniaca e CO₂, che si diffondono in soluzioni di carbonato di calcio, con conseguente formazione di cristalli di carbonato di ...

Discussione

Il metodo qui descritto è volto a formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di additivi organici e a valutare l'effetto dei biopolimeri organici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio in vitro. Il metodo si basa sul confronto dei cristalli formati in presenza degli additivi organici ai cristalli di calcite formati nell'esperimento di controllo. Abbiamo dimostrato come utilizzare il metodo di diffusione per formare i cristalli di carbonato di calcio, come caratterizzare la loro mo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model