Formação de carbonato de cálcio na presença de aditivos Biopoliméricos

Resumo

Descrevemos um protocolo para a precipitação e caracterização de cristais de carbonato de cálcio que se formam na presença de biopolímeros.

Resumo

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. É um processo complexo e, portanto, um sistema simples, in vitro, é necessário para compreender o efeito de moléculas isoladas no processo de biomineralização. Em muitos casos, a biomineralização é dirigida por biopolímeros na matriz extracelular. Para avaliar o efeito de biopolímeros isolados na morfologia e estrutura da calcita in vitro, utilizou-se o método de difusão de vapor para a precipitação de carbonato de cálcio, microscopia eletrônica de varredura e micro Raman para a caracterização, e absorvância ultravioleta-visível (UV/VIS) para medir a quantidade de um biopolímero nos cristais. Neste método, expõem-se os biopolímeros isolados, dissolvidos em solução de cloreto de cálcio, a amônia gasosa e dióxido de carbono que se originam da decomposição de carbonato de amônio sólido. Nas condições em que o produto de solubilidade do carbonato de cálcio é atingido, os precipitados de carbonato de cálcio e os cristais são formados. O carbonato de cálcio tem diferentes polimorfos que diferem em sua estabilidade termodinâmico: carbonato de cálcio amorfo, vaterita, aragonita e calcita. Na ausência de biopolímeros, em condições limpas, o carbonato de cálcio está principalmente presente na forma de calcita, que é o polimorfo mais termodinògica estável do carbonato de cálcio. Este método examina o efeito dos aditivos biopoliméricas na morfologia e na estrutura de cristais do carbonato de cálcio. Aqui, demonstramos o protocolo através do estudo de uma proteína bacteriana extracelular, TapA, sobre a formação de cristais de carbonato de cálcio. Especificamente, focamos no conjunto experimental, e métodos de caracterização, tais como microscopia óptica e eletrônica, bem como Espectroscopia Raman.

Introdução

A biomineralização é a formação de minerais na presença de moléculas orgânicas, muitas vezes relacionadas com papéis funcionais e/ou estruturais em organismos vivos. A biomineralização pode ser intracelular, como na formação de magnetita dentro de bactérias magnetotáticas¹, ou extracelular, como na formação de carbonato de cálcio em picos de ouriço-do-mar², de hidroxiapatita que está relacionada com colágeno em ossos³ e do esmalte que está associado com amelogenina nos dentes⁴. A biomineralização é um processo complexo que depende de muitos parâmetros no organismo vivo. Portanto, a fim de simplificar o sistema em estudo, é necessário avaliar o efeito de componentes separados no processo. Em muitos casos, a biomineralização é induzida pela presença de biopolímeros extracelulares. O objetivo do método aqui apresentado é o seguinte: (1) formar cristais de carbonato de cálcio na presença de biopolímeros isolados in vitro, utilizando um método de difusão de vapor. (2) estudar o efeito dos biopolímeros na morfologia e estrutura do carbonato de cálcio.

São utilizados três métodos principais para precipitar o carbonato de cálcio in vitro na presença de aditivos orgânicos^5,6. O primeiro método, que vamos referir como o método de solução, é baseado na mistura de um sal solúvel de cálcio (por exemplo, CaCl₂) com um sal solúvel de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio). O processo de mistura pode ser realizado de várias maneiras: dentro de um reator com três células separadas por membranas porosas⁷. Aqui, cada uma das células exteriores contém um sal solúvel e a célula central contém uma solução com o aditivo a ser testado. O cálcio e o carbonato difuso do exterior à pilha média, tendo por resultado a precipitação do carbonato de cálcio menos solúvel quando as concentrações de cálcio e de carbonato excedem seu produto da solubilidade, K_SP = [Ca^{2 +}] [co₃ ^2-]. Um método de mistura adicional é o procedimento de jato duplo⁸. Neste método, cada sal solúvel é injetado a partir de uma seringa separada para uma solução agitada contendo o aditivo, onde o carbonato de cálcio precipita. Aqui, a injeção e, portanto, a taxa de mistura é bem controlada, em contraste com o método anterior, onde a mistura é controlada pela difusão.

O segundo método usado para cristalizar CaCO₃ é o método Kitano⁹. Este método baseia-se no equilíbrio carbonato/carbonato de hidrogênio (2HCO₃^- _(AQ) + CA^{2 +}_(AQ) caco_{3 (s)} + co_{2 (g)} + H₂O _(l)). Aqui, o CO₂ é borbulhado em uma solução contendo caco₃ em uma forma sólida, deslocando o equilíbrio para a esquerda e, portanto, dissolvendo o carbonato de cálcio. O carbonato de cálcio não dissolvido é filtrado e os aditivos desejados são adicionados à solução rica em bicarbonato. O CO₂ é então autorizado a evacir, deslocando assim a reacção à direita, formando carbonato de cálcio na presença dos aditivos.

O terceiro método de cristalização do carbonato de cálcio, que descreveremos aqui, é o método de difusão de vapor¹⁰. Nesta set-up, o aditivo orgânico, dissolvido em uma solução de cloreto de cálcio, é colocado em uma câmara fechada perto de carbonato de amônio em forma de pó. Quando o pó de carbonato de amônio se decompõe em dióxido de carbono e amônia, eles se difusas na solução contendo íons de cálcio (por exemplo, CaCl₂), e o carbonato de cálcio é precipitado (ver Figura 1 para ilustração). Os cristais do carbonato de cálcio podem crescer pela precipitação lenta ou pela precipitação rápida. Para a precipitação lenta, uma solução que contenha o aditivo na solução de CAcl₂ é coloc em um exsicador ao lado do pó do carbonato de amónio. Na precipitação rápida, descrita de comprimento no protocolo, tanto a solução aditiva quanto o carbonato de amônio são colocados mais próximos em uma placa de múltiplos poços. O método de precipitação lenta produzirá menos centros de nucleação e cristais maiores, e a precipitação rápida resultará em mais centros de nucleação e cristais menores.

Os métodos descritos acima diferem em sua complexidade técnica, no nível de controle e na taxa do processo de precipitação. O método de mistura requer uma set-up especial⁶ para o jato duplo e o sistema de três células. No método de mistura, a presença de outros íons contrários solúveis (por exemplo, na⁺, CL^-)⁶ é inevitável, enquanto que no método Kitano, o cálcio e (BI) carbonato são os únicos íons em solução e não envolve a presença de adicionais contra íons (por exemplo, na⁺, CL^-). Além disso, o método de mistura requer volumes relativamente grandes e, portanto, não é adequado para trabalhar com biopolímeros caros. A vantagem do jato dobro é que é possível controlar a taxa de injeção da solução e que é um processo rápido em comparação com outros métodos.

A vantagem do método de Kitano e o método de difusão de vapor é que a formação de carbonato de cálcio é controlada pela difusão de CO₂ em/fora de uma solução CAcl₂ , permitindo assim a sonda de nucleação mais lenta e processos de precipitação ¹¹ anos de ^{, 12}. Além disso, a formação de carbonato de cálcio por difusão de co₂ pode assemelhar-se a processosde calcificação in vivo^13,14,15. Neste método, os cristais bem definidos e separados são formados¹⁶. Por último, o efeito de biopolímeros únicos ou múltiplos na formação de carbonato de cálcio pode ser testado. Isto permite um estudo sistemático do efeito de uma série de concentrações aditivas na formação de carbonato de cálcio, bem como um estudo de misturas de biopolímeros-todos realizados de forma controlada. Este método é adequado para uso com uma grande variedade de concentrações e volumes de aditivos. O volume mínimo utilizado é de aproximadamente 50 μL e, portanto, este método é vantajoso quando há uma quantidade limitada de biopolímeros disponíveis. O volume máximo depende da acessibilidade de uma placa de poço maior, ou do dessecador em que a placa ou taça contendo CaCl₂ devem ser inseridos. O método descrito abaixo foi otimizado para trabalhar em uma placa 96-well com um biopolímero escolhido para ser a proteína TapA¹⁷.

Protocolo

1. cristalização do carbonato de cálcio

1. Preparação e otimização de controle
   1. Prepare peças de vidro limpas. Use o mesmo procedimento de limpeza para limpar os copos.
      1. Use uma pena do diamante para cortar partes de uma corrediça de vidro do microscópio de modo que caiam em um poço de uma placa 96-well.
         Nota: 5 mm x 5 mm peças devem caber em grande parte.
      2. Coloc as partes de vidro em um copo com água destilada tripla (TDW) de modo que a água cubra as corrediças de vidro e proceda em um sonicador do banho por 10 minutos.
      3. Decantar a água, adicionar etanol para cobrir as lâminas de vidro, e proceda em um banho sonicador por 10 min.
      4. Seque as lâminas e os copos com um fluxo de gás nitrogênio e coloque-os em um limpador de plasma de ar por 10 min a 130 W.
   2. Otimize a concentração do CAcl₂ usado nos experimentos de calcificação realizados as condições experimentais desejadas para atingir uma amostra rica com cristais de calcita liso-facetados (sem ou pelo menos com um número escasso de vaterita cristais).
      1. Encha os poços nos cantos de uma placa 96-well com o pó do carbonato do amónio e sele a placa usando a folha de alumínio; Cubra a folha com película de parafina. Limpe qualquer carbonato de amónio residual com gás nitrogénio.
         PRECAUÇÃO: o carbonato de amónio irrita o nariz e os pulmões; Use somente dentro da capa das emanações.
      2. Prepare uma solução de estoque de 0,5 M CaCl₂. Esta solução de ações será usada para preparar um gradiente de concentrações de CaCl₂ soluções na placa de multi-bem.
         Nota: uma solução de 10 mL é suficiente para todo o experimento.
      3. Coloque as peças de vidro previamente cortadas e limpas em cinco poços diferentes. Use os poços mais próximos para o centro.
      4. Encha cada poço com uma peça de vidro com 100 μL de uma solução de CaCl₂ ¹⁶. Misture TDW e 0,5 M CaCl₂ (estoque) para alcançar um gradiente de concentração crescente de CAcl₂ nos diferentes poços. Se um bem-placa de tamanho diferente é usado, ajuste a concentração de CAcl₂ para conseguir cristais separados da calcita (etapa 1.1.2.10, e veja seção da discussão).
         Nota: um gradiente crescente de CaCl₂ de 10, 20, 30, 40, 50 mm concentrações em poços separados é usado neste protocolo. Para aumentar o intervalo de concentração ou o número de concentrações testadas, use poços adicionais.
      5. Perfure a tampa de cada um dos poços contendo carbonato de amónio 3x com uma agulha.
      6. Põr para trás a tampa, sele as beiras com película de parafina e mantenha-a em 18 ° c em uma incubadora por 20 h.
      7. Após a incubação, abra a tampa cuidadosamente dentro de uma capa de fumaça e retire os cristais formados na interface água/ar com um loop.
      8. Use um pinça para transferir as partes de vidro em um copo que contem a água destilada dobro (DDW). Retire as amostras do copo e use uma fita dupla face para fixar as peças de vidro na parte inferior da placa de Petri.
      9. Seque a água excessiva tocando nas bordas da corrediça com lenços de tecido. Cubra a placa de Petri e colocá-lo em um dessecador para 24 h.
      10. Observe os cristais formados nas peças de vidro com um estereoscópio (ampliação de 3,5 x) e/ou um microscópio óptico vertical (ampliação de 10x-40x). Se as soluções de controle estiverem limpas, cristais romboédricos (provavelmente calcita) serão observados com um microscópio óptico (Figura 2a).
      11. Se, além dos cristais romboédricos, o controle contiver cristais esféricos (provavelmente vaterita, Figura 2B), ou se as imagens de microscópio eletrônico de varredura (MEV) mostrarem cristais romboédricos com faces ásperas em vez de suaves ( Figura 3 A , B), repita o protocolo de cristalização certificando-se de que a etapa de limpeza (1.1.1) é executada corretamente. Além disso, fazer melhor cuidado que não há carbonato de amônia em áreas na placa que não sejam os poços dedicados. Caso contrário, avance para o passo seguinte.
2. Cristalização na presença dos aditivos
   1. Para estudar o efeito dos aditivos na cristalização do CaCO₃, configurar uma placa multipoços que contenha (em diferentes poços), uma solução de controle CAcl₂ sem os aditivos, e soluções CAcl₂ com os aditivos. Use a concentração óptima de CaCl₂ encontrada na seção 1.1.2 para o experimento.
      Observação: o protocolo abaixo usa condições ideais como as relatadas em um estudo anterior¹⁶.
   2. Repita a etapa 1.1.2.2.
   3. Coloque o pó de carbonato de amónio nos cantos da chapa, conforme descrito no passo 1.1.2.1.
   4. Em cada poço onde a precipitação ocorrerá, coloc uma parte de vidro que seja cortada e limpada como descrito na seção 1.1.1.
   5. Para preparar poços de controle, pipete 90 μL de TDW nos poços de controle. Prepare pelo menos uma réplica de cada poço, incluindo o controle. Se o aditivo utilizado estiver em uma solução tampão, em seguida, pipetar 90 μL de tampão em vez de água TDW.
   6. Prepare os poços contendo aditivos. Repita o passo 1.2.5 adicionando 90 μL da solução aditiva em água. Se o aditivo estiver em buffer (em vez de TDW), pré-ajuste a concentração do aditivo com tampão para atender a concentração final desejada. Manter um volume total de 90 μL; pipeta primeiro o aditivo, em seguida, o tampão.
      Nota: uma concentração final de 10 μM da proteína TapA em 100 mM NaCl, 25 mM TRIS pH 8,0 buffer¹⁶ é utilizado neste protocolo.
   7. Adicionar 10 μL da solução de 0,5 M CaCl₂ (preparada na etapa 1.2.2) para ambos os controles e os poços contendo aditivos para atingir uma concentração final de 50 mm CAcl₂.
   8. Repita os passos 1.1.2.5-1.1.2.9.

2. caracterização de cristais de carbonato de cálcio

1. Com um microscópio eletrônico de varredura, observar os cristais de carbonato de cálcio formados na presença dos aditivos em uma resolução maior do que o obtido por microcopia óptica (ver passo 1.1.2.10).
   1. Monte as peças de vidro contendo os cristais em um topo de alumínio com fita dupla face de carbono.
   2. Casaco com uma camada de au/PD para 40-50 s.
   3. Adquira as imagens em tensão de aceleração de 5 kV.
      Nota: a Figura 3a mostra uma imagem sem representante de cristais de carbonato de cálcio formado em um experimento de controle adequado, enquanto a Figura 4 mostra imagens representativas de cristais de carbonato de cálcio formados na presença da proteína TapA .
2. Realize micro Espectroscopia Raman para determinar os polimoros de carbonato de cálcio formados. O micro Raman permite a coleção de um espectro de Raman dos únicos cristais um pouco do que de um pó inteiro.
   1. Use um objetivo 20x do microscópio para escolher o cristal do interesse.
   2. Colete o espectro Raman em uma escala de 100 − 3200 cm^-1 usando um laser do argônio de 514 nanômetro.
      Nota: A Figura 5 mostra espectros representativos de calcita (A) e vaterita (B). Para o espectro de aragonite, refira a referência¹⁸.
3. Quantificação da percentagem de massa dos aditivos nos precipitados do CaCO₃
   1. Verificar/medir o coeficiente de extinção (ε) do aditivo utilizado. O coeficiente de extinção de uma proteína pode ser administrado por servidores online¹⁹. Se o coeficiente de extinção for desconhecido, meça a absorvência do aditivo em diferentes concentrações, plotar a absorvência versus a concentração e calcular o coeficiente de extinção a partir da inclinação da curva.
   2. Pesar as peças de vidro onde os cristais formados, de preferência usar um microbalance.
   3. Sucata de cristais fora do vidro em 1,2 ml de 0,1 M solução de ácido acético, vortex e proceda a amostra. Guarde a amostra à temperatura ambiente durante 24 h.
      PRECAUÇÃO: o ácido acético é muito perigoso em caso de contacto com a pele ou os olhos; Manuseie com cautela e descarte seguindo os regulamentos.
   4. Pesar a corrediça de vidro após a raspagem fora dos cristais.
   5. Medir o espectro de absorvância UV/VIS (a) da solução. Se o aditivo for uma proteína, meça a absorvância a 280 nm e calcule a sua concentração (C), utilizando a equação de Beer-Lambert:
      
      onde l é o caminho óptico dentro da cubeta.
   6. Use a concentração (C) encontrada em 2.3.5 e o volume utilizado (V = 1,2 ml) para calcular a massa (m) dos aditivos em/sobre os cristais. Se a concentração estiver em mg/ml, use a equação C ● V = m.
      1. Se a concentração estiver em mol/L, então Calcule as moles (n) aplicando C ● V = n. Em seguida, use o peso molecular (MW) para calcular a massa (m) dos aditivos(m = n ● MW).
   7. Calcule a percentagem de peso dos aditivos em/sobre os cristais usando a equação: , onde m é a massa dos aditivos, e δm_s é a massa dos cristais de carbonato de cálcio que foram desmantelados fora do vidro Pedaço.

Resultados

Um esquema do conjunto experimental é mostrado na Figura 1. Resumidamente, o método de difusão é utilizado para formar cristais de carbonato de cálcio em placas de 96 poços e testar o efeito de biopolímeros na morfologia e estrutura dos cristais de carbonato de cálcio. Nesses experimentos, o carbonato de amônio é decomposto em amônia e CO₂, que se difunde em soluções de carbonato de cálcio, resultando na formação de cristais de carbonato de cálcio (

Discussão

O método aqui descrito destina-se a formar cristais de carbonato de cálcio na presença de aditivos orgânicos e avaliar o efeito de biopolímeros orgânicos na morfologia e estrutura de cristais de carbonato de cálcio in vitro. O método é baseado na comparação dos cristais formados na presença dos aditivos orgânicos aos cristais de calcita formados no experimento de controle. Nós mostramos como usar o método de difusão para formar os cristais de carbonato de cálcio, como caracterizar sua morfologia usando m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model