מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

Abstract

רוב המחקרים המעסיקים ליפוזומים כמו מערכות מודל ממברנה או ספקיות משלוח התרופות מסתמך על שיטות קריאה-out בצובר ובכך מיסודה מניח את כל ליפוזומים של ההרכב להיות זהה. עם זאת, פלטפורמות ניסיוני חדש מסוגל להתבונן ליפוזומים ברמת החלקיק היחיד הפכו את האפשרות לבצע מחקרים מתוחכמים ביותר וכמותיים על אינטראקציות חלבונים-קרום או הספק הסמים מאפיינים על ליפוזומים בודדים, וכך הימנעות שגיאות מהרכב בממוצע. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה, גילוי וניתוח של ליפוזומים בודדים באמצעות שיטת מיקרוסקופ מבוססת-פלואורסצנטית, הקלה על מדידות מסוג יחיד-חלקיק. ההתקנה מאפשרת הדמיה בודדים ליפוזומים בצורה מקבילה מסיבית והוא מועסק כדי לחשוף את הגודל הפנים לדוגמה ומלא הומופאות. בנוסף, הפרוטוקול מתאר את יתרונותיו של הלומדים ליפוזומים ברמה האחת, את מגבלות השיטת העבודה, ואת התכונות החשובות שיש לשקול בעת שינוי אותה כדי ללמוד שאלות מחקר אחרות.

Introduction

ליפוזומים הם שלפוחיות מבוססות פוספוליפיד כדוריים המשמשות בכבדות במחקר בסיסי ומיושם. הם מתפקדים כמו מערכות מודל מעולה ממברנה, מכיוון התכונות הפיזיוכימיות שלהם יכול להיות מניפולציות בקלות על ידי שינוי הרכיבים השומנים המרכיבים את ליפופי^1,2. גם, ליפוזומים מהווים את מערכת התרופות משלוח הסמים הנפוץ ביותר, מציע פרמקוקינטיקה משופרת, פרמקודינמיקה, כמו גם גבוהה תאימות³.

במשך שנים רבות, ליפוזומים כבר נחקרו בעיקר באמצעות שיטות בצובר, מתן גישה רק לערכי לקרוא ממוצע ההרכב. זה הוביל את רוב המחקרים האלה כדי להניח כי כל ליפוזומים בהרכב זהים. עם זאת, ערכי הרכב-ממוצעים נכונים רק אם ערכת הנתונים הבסיסית מופצת באופן אחיד סביב הערך הממוצע, אך יכולה לייצג מסקנה שקרית ומשוחדת אם ערכת הנתונים כוללת אוכלוסיות עצמאיות מרובות, לדוגמה. בנוסף, בהנחה כי ההרכב מתכוון לייצג את כל האוכלוסייה יכול להתעלם המידע שעמום בתוך האינגניות בין ליפוזומים. רק לאחרונה יש מספר כמותי התפתחה כי הם מסוגלים לחקור ליפוזומים בודד, חשיפת מיני הומומטר גדול בין ליפוזומים בודדים ביחס למאפיינים הפיזיקליים חשוב כולל ליפופי גודל⁴, הרכב ליפיד^5,6, ו-כימוס יעילות⁷, הדגשת החשיבות של ליפוזומים ברמת ליפו

אזור מחקר שבו אנסמבל ממוצע של ליפוכמה נכסים הוכח לתוצאות הטיה הוא לומד ליפופי מספר אינטראקציות חלבונים-ממברנה תלויי-גודל^8,9. באופן מסורתי, החוקרים לומדים תהליכים כאלה הוגבלה להכנת ליפוזומים עם קטרים שונים הממוצע האנסמבל ידי שחול באמצעות מסננים עם מידות נקבוביות שונות⁹. עם זאת, לחילוץ הקוטר של ליפוזומים בודדים באמצעות ליפולי בודד כמה בחני חשף האוכלוסייה הגדולה חופפים, עם הבלטת ליפוזומים באמצעות 100 ננומטר ו 200 ננומטר מסננים המציגים עד 70% חופפים בהתפלגות גודלם⁴. זה יכול באופן חמור הטיה מדידות בצובר של ליפוכמה בגודל תלויי חלבון ממברנה אינטראקציות¹⁰. ביצוע לימודי האינטראקציה עם חלבון הממברנה באמצעות ליפובי היחיד, החוקרים במקום ניצל את גודל-פולידידיש בתוך המדגם, ומאפשר להם ללמוד מגוון רחב של ליפופי קטרים בתוך כל ניסוי בודד, הקלה תגליות חדשות של איך עקמומיות ממברנה הרכב יכול להשפיע על גיוס חלבונים לממברנות^4,11,12 שדה נוסף שבו היישום של ליפולי בודד כמה בחני יש הוכיחה אינסטרומנטלי הוא במחקרים מכניסטיים של חלבון מתווכת ממברנה פיוז'ן^13,14. עבור מדידות קינטית כזו, היכולת ללמוד אירועי היתוך בודדים להקל על הצורך בסנכרון ניסיוני של תהליך היתוך, ומאפשר תובנות מכניסטיות חדשות שאחרת אבדו בחישוב ממוצע הזמן הזמני של הרכב בכמויות גדולות. בנוסף, ליפוזומים בודדים שימשו כפיגום קרום, המאפשר את המדידה של חלבונים בודדים ומציע ידע חדשעל הדינמיקה הקונסטרוקטיבית חלבון^{מבנית 15,16}. יתר על כן, הגדרות כגון פרוטאוליפוכמה מבוסס מבוססי שאפשרו ללמוד את הפונקציה של מובילים בודדים חלבון טראנסממברנלי¹⁷ הנקבוביות מכלולי חלבון מתחמי¹⁸ , כמו גם את המנגנון של ביואקטיבית ממברנה החדירות-פפטידים¹⁹. ליפוזומים בודדים יש גם בשימוש כמו nanofluiאידיקה של חומר רך עם פני השטח ליפוזומים יחיד לשמש לתאי התגובות אנזימטיות בכרכים של 10^-19 L, הגדלת התפוקה והמורכבות של בחני ההקרנה הקרנת המוצר עם צריכת מוצר מינימלי²⁰.

לאחרונה, ליפולי בודד מסוימים שימשו לאפיון ליפוזומים של משלוחי סמים ברמת פירוט בעבר לא מראש. החוקרים היו מסוגלים לכמת משמעותי המגון eities בכמות של פולימר מחובר למשטח של ליפוזומים בודדים²¹. ליפומים בודדים כמה בחני מותר גם מדידות של ליפוזומים משלוח סמים במדיה מורכבת, כגון פלזמה דם, חשיפת כיצד אלמנטים מעוגן ליפופי כמה משטח באמצעות עוגנים שומנים בדם יכול להיות פגיע לדיסוציאציה כאשר ליפוזומים חשופים לתנאים לחקות אותם מנוסים במהלך vivo מחזור²². בסך הכל, צדדיות והשימושיות של ליפופי בודד מתימוכין על ידי מגוון גדול של בעיות כיוונונים אלה המועסקים לכתובת, ואנו לדמיין כי המתודולוגיה תמשיך להתפתח ולמצוא שימוש בתחומים מדעיים חדשים.

כאן אנו מתארים ליפוכי מיקרוסקופ בודד מבוסס על בסיס אחד מסוים המאפשר ליפוזומים בודדים ללמוד באופן תפוקה גבוהה (איור 1). כדי להמחיש את השיטה, אנו משתמשים בו כדי לכמת את הגודל והסדר הפנימי בין ליפוזומים נפרדים בתוך הרכב. המנה מעסיקה הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ליפוזומים בודדים מקיבוע על משטח זכוכית פסיבי. אנו מתארים תחילה את השלבים הקריטיים בליפומה תהליך הייצור המבטיח ליפובי פלורסנט מתאים לתיוג ולשתק. לאחר מכן, אנו מתארים את ההכנה לפני השטח הדרוש כדי להקל על היפוטיזציה לפני חלוקת ההליך להבטחת ליפומים מתאימים בצפיפות המשטח. אנו דנים בפרמטרי המיקרוסקופיה החשובים לרכישת תמונות באיכות גבוהה ולתיחום כיצד לבצע ניתוח נתונים פשוט, ולאפשר הוצאה של ליפופי גודל והומוגניות. פרוטוקול גנרי זה אמור לספק בסיס טוב לחוקר המעוניין לפתח את הבדיקה הנוספת לעניין המחקר הספציפי שלו.

Protocol

1. ליפומין הכנה

הערה: בקצרה, הכנת ליפוזומים כוללת בדרך כלל שלושה צעדים קריטיים: 1) הכנת סרטי השומנים היבשים של הרכב השומנים הרצוי; 2) הסבה של השומנים להיווצרות ליפוזומים; ו-3) שליטה על הגודל ועל הליגליות של האוכלוסייה ליפוכמה.

1. שוקלים את השומנים וממיסים אותם ב tert-butanol: מים (9:1) בבקבוקונים זכוכית.
   1. התמוססות POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-גליקו-3-פוספולולין; MW = 760 g/מול) עד 50 mM.
   2. התמוססות הכולסטרול (MW = 387 g/מול) עד 25 מ"מ.
   3. התמוססות סמים-Atto488 (1, 2-dioleoyl-sn-גלילארו-3-פוספופאנאואמין-Atto488; MW = 1,316 g/מול) עד 0.1 mM.
   4. התמוססות סמים-Atto655 (1, 2-dioleoyl-sn-גלילארו-3-פוספופאנאואמין-Atto655; MW = 1,368 g/מול) עד 0.1 mM.
   5. התמוססות DSPE-PEG2000-ביוטין (1, 2-distearyl-sn-מלגליקו-3-פוספולטאואמין-N-[ביוטיקסיל (פוליאתילן גליקול)-2000]; MW = 3,017 g/מול) עד 0.1 mM.
      הערה: מחממים את השומנים עד 55 ° צ' ומשתמשים בערבוב מגנטי כדי להבטיח פירוק מלא של השומנים. לחלופין, השתמשו באמבט sonication. מניות השומנים שאינם בשימוש ניתן לאחסן ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
2. לערבב את המניות ליפיד שהוכנו בשלב 1.1 ליחס מולרי של popc: כולסטרול: סמים-Atto488: סמים-Atto655: סמים-יתד-biotin 68.95:30:0.5:0.5, על ידי הוספת 138 μl של popc, 120 μl של כולסטרול, 500 μl של כל fluorescently תווית השומנים, ו-50 μ DSPE-פג-biotin לבקבוקון זכוכית טרי.
   הערה: ליפוזה המדויק הרכב ניתן לשנות בקלות כדי לטפל בשאלה ספציפית של עניין. ראה דיון לפרטים נוספים.
3. שחרר את המכסה של בקבוקון הזכוכית, והקפא את הבקבוקון בחנקן נוזלי.
4. ליאופליז תערובת השומנים הקפואה בלילה.
5. הוסף 1 מ מ של 200 mM D-sorbitol מאגר (sorbitol מאגר) לשומנים יבש.
6. מחממים את התערובת ל 45 ° c וחושפים את החום המגנטי לפחות 1 h.
   הערה: על המאגר לשקף את השאלה הספציפית הנדונה (למשל, תנאים פיסיולוגיים ללימוד אינטראקציות ממברנה-חלבון, או מאגר ספציפי מאושר קליני לחקר ליפוזומים באספקת סמים). עם זאת, אם מאגר מסוים אינו נדרש לצורך המחקר, ניתן להחיל מאגר ללא יונים על מנת להקטין את הריבוי של הליזומים.
7. להקפיא את ההשעיה ליפיד על ידי טבילה במבחנה בחנקן נוזלי, ולחכות עד ההשעיה קפואה לחלוטין.
8. טובלים את ההשעיה הקפואה באמבט חימום ב-55 ° c עד שהתערובת מופפה לחלוטין.
9. חזור על שלבים 1.7 ו 1.8 עד ליפוכמה ההשעיה נחשף סך של 11 מחזורי הקפאה/הפשרה.
   הערה: מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרות ונשנות הראו להפחית את הלייפוזציה²³, שהיא בעלת חשיבות עליונה לדיוק של ליפובי היחיד, כאשר ליפוזומים רב למינלי יהיה להטות את עוצמת הקרינה לעומת ליפוקו יחס גודל של ליפוזומים. מרבית המלונות בדרך כלל מאוד נמוכים כאשר כוללים יותר מ-0.5% השומנים בניסוח (כגון נעשה בדרך כלל בליזומים לאספקת סמים)²⁴.
10. הבלטת ליפומה ההשעיה פעם אחת דרך מסנן פוליקרבונט 800 ננומטר באמצעות ערכת הבלטה מיני. בצע את הוראות היצרן להרכבת ערכת ההבלטה (ראה טבלת חומרים).
11. אחסן את הליזומים ב -4 ° c בלילה.

2. הכנת פני שטח לחדר הדמיה

1. להכין סרום האלסמין (BSA; 1 מ"ג/mL), BSA-biotin (1 מ"ג/mL) ו streptavidin (0.025 mg/mL) ב 10 מ"מ HEPES (4-(2-הידרולוקסיל) -1-החומצה הפפרילאנאנייתהסינית) 95 מ"מ מאגר (מאגר HEPES).
   הערה: כדי למנוע פרץ ליפוזומתית, מאגר סורביטול המשמש לשימוש חוזר ומאגר hepes המשמש להכנה לפני השטח צריך להיות איזוטוניק. לכן מומלץ לבדוק את האוסמגליות של המאגרים לפני הניסוי.
2. מערבבים 1,200 μL של BSA ו 120 μL של BSA-biotin ולהוסיף 300 μL של התערובת לכל טוב ב 8 שקופית גם עבור מיקרוסקופ.
   הערה: כאן אנו משתמשים מסחרית זמין 8 מיקרוסקופ טוב עם תחתית זכוכית (ראה שולחן חומרים), אבל הפרוטוקול יכול בקלות להתאים לתאי מיקרוסקופ מותאמים אישית.
3. מודיית את השקופית במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. שטוף את השקופית 8x עם 300 μL של מאגר HEPES.
   הערה: היזהרו לא לעזוב את הבארות ללא מאגר במשך יותר מכמה שניות, כמו לייבש את פני השטח יפגע בו. יתר על כן, להיזהר לא לשרוט את פני השטח עם העצה הפיפטה כמו זה יהיה גם נזק זה. לכן, כאשר משפל את החוצץ מבאר, עשה זאת מהקצה או מהפינה.
5. הוסף 250 μL של streptavidin ו-דגירה עבור 10 דקות ב RT.
6. חזור על 8 שוטף המתואר בשלב 2.4.
7. אחסן את שקופית המיקרוסקופ עם 300 μl של מאגר סורביטול בכל באר ב-4 ° c. אידוי של הממס יפגע את פני השטח, כך לשים את שקופית המיקרוסקופ בצלחת פטרי ולחתום אותו עם parafilm אלא אם השקופית מוכנה משמש מיד.

3. ליפוזציה

1. לדלל את הליפוכמה השעיה על 20 μm סה כ השומנים במאגר סורביטול. ההליך בסעיף 1 תניב ליפוכמה השעיה של כ 10 מ"מ השומנים הכולל.
2. מניחים את השקופית על המיקרוסקופ ומתמקדים על פני השטח של התא באמצעות אות השתקפות לייזר מוגבר מממשק זכוכית/מאגר כמדריך.
3. רוחצים את חדר 4x עם 300 μL של מאגר HEPES טרי.
4. הוסף 10 μL של ליפומטר מדולל מניות (20 μM השומנים הכולל) לצינור מיקרוצנטריפוגה.
5. להוציא 100 μL של מאגר מהתא, להוסיף את צינור מיקרוצנטריפוגה מוכן בשלב 3.4, לערבב כראוי, ולשים את 110 μL חזרה לתוך החדר.
6. לשים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ, ולהשתמש הגדרת מיקרוסקופ רודינטלית מסוגל לזהות אות מתוך ליפופי כמה fluorophore (s) כדי להתבונן ליפוזומים להיות מנופף על פני השטח.
7. המטרה עבור ליפוכמה צפיפות פני השטח כי הוא בו דליל מספיק כדי להשבית ליפוזומים בודדים צפוף מספיק כדי לסייע מדידות תפוקה גבוהה. בדרך כלל שימוש בשדה מ50 יקרומטר x 50 יקרומטר של השקפה, 300 ליפוזומים לכל מסגרת מיטבית (איור 2). ניתן להשיג זאת בדרך כלל תוך 5 עד 10 דקות.
   הערה: אם מזוהים רק חלקיקי פלורסנט הנעים במהירות בשדה הראייה, היעדרות או ריכוז נמוך מדי של כל אחד מהרכיבים הקריטיים לתהליך השתק (BSA-biotin, streptavidin, סמים-יתד-biotin) עשוי להיות הגורם. אם לא מזוהים ליפוזומים זה יכול להיות קשור לריכוז נמוך של ליפוזומים, הגדרות לא נאות עבור גילוי הקרינה, או להדמיה עם מטוס מוקד לא במשטח הזכוכית.
8. לאחר ליפופי מתאים מסוימים צפיפות המשטח הוא הגיע, לשטוף את חדר 3x עם 200 μL של מאגר HEPES.
   הערה: הקפד לשים לב כי הקינטיקה המשתק תלויה גם ביפופי מאפיינים כגון גודל וחיוב, ולכן צריך תמיד להיות ממוטב עבור כל ליפושים בניסוח.

4. רכישת תמונה

הערה: סעיף זה יהיה תלוי הרבה על מערכת המיקרוסקופ זמין לחוקר ביצוע הניסוי. לפיכך, ההנחיות הכלליות לביצוע ההדמיה יוסברו. עם זאת, את ההגדרות המדויקות וכיצד להחיל אותם ישתנו בין הגדרות המיקרוסקופ השונים. לדוגמה, מערכות מסוימות מאפשרות בחירה בכל שילוב של מסנני פליטה הרצויה, בעוד שיקרוסקופים אחרים מצוידים במסננים ספציפיים ומוגדרים מראש.

1. הגדר את המיקרוסקופ ליצירת ליפוזומים בודדים. כדי להבטיח איכות תמונה אופטימלית וניתוח נתונים בעקבות השימוש ברזולוציה גבוהה של גוני אפור וערכת פיקסל המאפשרת ליפוזומים בודדים. עומק קצת של 16 ו לפחות 1,024 x 1,024 פיקסלים עבור 50 יקרומטר x 50 האזור יקרומטר מומלץ. אם זמין, קו-ממוצע יכול טובה להיות מוחל על הפחתת רעש (למשל, 3 סריקות לכל שורה).
2. בחר כוח לייזר עירור ששניהם מבטיח מסגרת למסגרת משמעותית הלבנת ואות חזקה מספיק כדי להפלות באופן ברור ליפוזומים בודדים מהרקע. ההגדרה האופטימלית תהיה תלויה במיקרוסקופ הספציפי המשמש כמו גם שילוב fluorophore. ודאו שגלאי הגלאים אינם רוויים, משום שפעולה זו מהווה הטיה בעוצמת הקוונדות.
3. הדמיה הן סמים-Atto488 ו-סמים-Atto655 fluorophores ב ליפוזומים דורש הדמיה של ערוצים מרובים. לכן, ודא שכל אחד מהערוצים מחושב ברצף כדי להימנע מעירור צולב. לדוגמה, ראשית לצלם תמונה אחת על ידי מרגש ב 488 ננומטר ופליטת הקריאה ב 495-560 nm. לאחר מכן, לקחת תמונה נוספת על ידי מרגש ב 633 ננומטר אבל קריאה בלבד 660-710 nm. הפרטים יהיו תלויים במערכת המיקרוסקופ (למשל, אשר לייזרים ומסננים) זמין.
4. הקפידו לכסות אזורים שונים של פני השטח, לרכוש לפחות 10 תמונות של המדגם, ובכך הדמיה לפחות 3,000 ליפוזומים בודדים. אם צפיפות פני השטח נמוכה מ 300 ליפוזומים/מסגרת, לרכוש תמונות נוספות. הקפד למקד מחדש את המיקרוסקופ עבור כל תמונה חדשה.
   הערה: עבור הדמיה של שני ערוצים, הקפד לתת שם לקבצי התמונה כך שזוגות של תמונות עם ליפוזומים זהים בערוצי הזריחה השונים יכולים להיות מזוהים בקלות במהלך ניתוח נתונים.
5. כדי לכמת את חוסר הוודאות הניסיוני הנוגע למדידה של הומוגניות, התמונה באותו אזור של ליפוזומים לפני ואחרי התמקדות מחדש (ראה איור 3 ותיאור בטקסט).
6. לייצא את התמונות מתוכנת המיקרוסקופ כמו קבצי tiff. לייצא את שני הערוצים של ליפוזומים אותו בנפרד.

5. ניתוח נתונים

הערה: מתוכנן במיוחד רוטינות התאמה גאוסיאנית אוטומטיות מיוחדות שהועסקו בעבר^6,11,12. עם זאת, כדי להגביר את ישימות השיטה, תהליך ניתוח נתונים שניתן ליישם בקלות בכל המעבדות מתואר.

1. טען את הזוג המתאים של תמונות. tiff של שני ערוצי זריחה שונים באותו שדה הדמיה לתוכנה של פיג'י (פיג'י Is רק ImageJ).
2. בתפריט ' תמונה ', בחרו ' צבע' והשתמשו בפונקציה ' מזג ערוץ ' ליצירת שילוב של שני הערוצים.
3. בדוק אם ליפוזומים התמונה בשני ערוצים שונים להציג לוקליזציה טובה או אם הסחף גלוי התרחש.
   הערה: במקרה של הסחף בין שני ערוצי הזריחה (המזוהה כהיסט X שיטתי ושווה בין האות בשני הערוצים), ניתן לתרגם את אחת המסגרות באמצעות שינוי הצורה ≫ תרגם פונקציה בתפריט תמונה של פיג'י. עם זאת, טיפול צריך להילקח עם מניפולציה תמונה כזאת. לכן מומלץ במקום זאת להימנע מסחיפה ככל האפשר בעת הדמיה של ליפוזומים.
4. ודא שתוסף ה-ComDet (v. 0.3.6.1 או חדש) מותקן, או בצע פעולה זו בתפריט התוספים .
5. פתח את תוסף ComDet כדי לזהות חלקיקים על ידי הולך לתפריט תוספים ובחירה comdet v. 0.3.6.1 ≫ לזהות חלקיקים.
6. ב ComDet, הקפד לבחור את לזהות חלקיקים על שני הערוצים פונקציה בנפרד . הגדר את המרחק המירבי בין נקודות מקומיות משותפות בדומה לגודל החלקיקים המשוער. בדרך כלל, 4 פיקסלים מתאימים להגדרות המתוארות כאן.
7. היחס אות לרעש צריך לאפשר זיהוי של חלקיקים אפילו עמום עם כמות נמוכה של זריחה. ב ComDet, להגדיר את היחס הזה ל 3 על ידי הגדרת רגישות של איתור בשני הערוצים חלקיקים עמום מאוד (SNR = 3).
   הערה: בעוד ערך SNR זה מתאים בדרך כלל, ייתכן שיהיה צורך להגדיר אותו גבוה יותר (למשל, אם יש הרבה רעש התמונה שניתן לזהות כמו ליפוזומים ולהוביל חיוביים שווא).
8. ודא שהתיבות המכילות את ההתאמה לשפות אחרות וחלקיקים שאותרו בשני הערוצים נבדקים, לפני שתקיש על אישור.
9. לאחר הפעלת הניתוח, יופיעו שני חלונות מוקפצים עם תוצאות ותקציר . יצא את תוצאות טבלת הנתונים המכילות את נתוני הלוקליזציה (קואורדינטות חלקיקים ועוצמה משולבת של כל חלקיק שזוהה) לתוכנת טיפול בנתונים של בחירה על-ידי שמירת הטבלה כקובץ. txt וייבואם לתוכנה.
10. ודא כי כל ליפוכמה נכלל רק פעם אחת בערכת הנתונים ולא הן channel1/channel2, כמו גם channel2/channel1 יחס. לכן, סנן את הנתונים כך שרק Abs_frame = 1 יותוו בשלב 5.11.
    הערה: על-ידי בחירת מקומי = 1, ניתן להסיר תוצאות חיוביות שגויות מרעש בתמונות מהניתוח. עם זאת, כל ליפוזומים עם רק אחד משני רכיבי פלורסנט הנוכחי יהיה גם נשלל מהניתוח, ובכך פוטנציאל הסרת נקודות נתונים חשובים מהניתוח.
11. התווה היסטוגרמה של העמודה עם נתונים המכילים את יחס העוצמה עבור כל ליפומה שאותר.
12. מידת ההומוגניות עבור מערכת ליפוזומלית למדה מיוצגת על ידי רוחב של התפלגות יחס אינטנסיביות. כדי לכמת את הסטיות, התאם את יחס העוצמה להיסטוגרמה באמצעות פונקציה גאוסיאנית וחלץ את הממוצע (μ) ואת סטיית התקן (סיגמא). עיין בסעיף תוצאות הנציג.
13. כעת ניתן לחשב ערך עבור מידת האינגניות (DI) באמצעות מקדם הווריאציה המוגדרת כ-DI = סיגמא/μ.

6. ליפופי גודל כיול

1. להוציא חלק ליפוכמה מלאי, ו הבלטת 21x דרך מסנן פוליקרבונט 50 ננומטר כמתואר בשלב 1.10.
2. לדלל את ליפוזומים על ידי הוספת 10 μl של ליפופי כמה ההשעיה כדי 800 μl של מאגר סורביטול בשפופרת מיקרוצנטריפוגה.
3. להעביר את ליפוזה מדולל מדגם לקובט לשימוש יחיד פוליפרופילן.
4. מדדו את הגודל באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). לבצע לפחות שלושה מסלולים עצמאיים כדי למדוד את גודל ומפזרים של ליפוכמה ההשעיה.
   הערה: במקרה הצורך, השתמש ביפופה מרוכז יותר למדידה. חלופות DLS (למשל, ניתוח מעקב ננו-חלקיק) ניתן גם להחיל על מדידת הגודל של ליפוזומים. תיאור של אופן הביצוע של קביעת גודל החלקיקים הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
5. תמונה ליפוזומים כיול על המיקרוסקופ תוך שימוש בדיוק באותן הגדרות נסיוניות כפי שהוגדרו בשלבים 4.1 ו 4.2.
6. לחלץ את העוצמה המשולבת עבור כל ליפופי כיול בתמונות כיול: לחלץ את גיליון התוצאות מסוננים המכיל ליפוכמה עוצמות הזריחה כפי שמתואר בשלבים 5.1-5.10. מטבלת התוצאות, חלץ את העמודה "אינטנט Int".
7. בגלל העוצמה המשולבת הכולל של ליפוכמה המסומנים בקרום שלה הוא פרופורציונלי לאזור פני השטח של ליפוכמה, ולכן הוא פרופורציונלי לריבוע הקוטר שלה, העלילה השורש הריבועי בעוצמה היסטוגרמה של העוצמה הפלואורסצנטית של ה ליפוזומים כיול.
8. להתאים את היסטוגרמה עוצמה משולבת המיוצר בשלב 6.7 עם התפלגות רגילה יומן ולחלץ את העוצמה הפלואורסצנטית הממוצע של ליפוזומים כיול.
9. כדי לקבוע את הקשר בין עוצמת השורש הריבועי (Int_Sqrt) ליפופי גודל, לחשב את פקטור תיקון (ג) באמצעות ליפופי ממוצע בקוטר (Dia) שוקלת את המספר שהתקבל מדידות DLS: Dia = c x int_sqrt הוא שווה ל C = Dia/int_sqrt.
10. חישוב ערכי Int_Sqrt עבור היפוזומים בניסוי ההומוגניות והמירו אותם לקטרים על-ידי הכפלה בפקטור התיקון.
11. התווה את ערך יחס העוצמה כפונקציה של קוטר ליפוזומים המתנומיים של הקומורים, ובכך משיג את האינוגניות כפונקציה של ליפופי גודל עבור אוכלוסייה של ליפוזומים המשתרעים על-פני כ-800 ננומטר על-ידי 50 ננומטר.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המתואר מאפשר לדמות ליפוזומים בודדים בצורה מקבילה מסיבית (איור 1). השטח המוצלח של ליפוזומים צריך להיות מיידי בבירור על התוספת של הפתרון ליפופי לחדר (שלב 3.6 בפרוטוקול) כנקודות עקיפה מוגבלת בעוצמה להופיע בתמונה (איור 1B

Discussion

חשוב לציין כי בעוד אנו מתארים בפרוטרוט כיצד שיטת ליפוזומים בודדים ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההומוגניות בין ליפוזומים בודדים, הפלטפורמה היא מאוד צדדי. כפי שהוצג בעבר ונדונו במבוא, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי ללמוד היבטים של היתוך קרום קרום, החלבונים-ממברנה האינטראקציות, או ליפוזומ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ