A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.

Résumé

La plupart des recherches utilisant des liposomes comme systèmes de modèles membranaires ou porteurs de médicaments s'appuient sur des techniques de lecture en vrac et supposent donc intrinsèquement que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Cependant, de nouvelles plates-formes expérimentales capables d'observer les liposomes au niveau d'une seule particule ont permis d'effectuer des études très sophistiquées et quantitatives sur les interactions protéines-membranes ou les propriétés des porteurs de médicaments sur des liposomes individuels, évitant ainsi les erreurs de la moyenne d'ensemble. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation, la détection et l'analyse de liposomes simples à l'aide d'un test de microscopie à base de fluorescence, facilitant ces mesures à partiilule unique. La configuration permet d'imagerie liposomes individuels d'une manière massive parallèle et est utilisé pour révéler la taille intra-échantillon et les inhomogénéités de composition. En outre, le protocole décrit les avantages de l'étude des liposomes au niveau liposome unique, les limites de l'assay, et les caractéristiques importantes à considérer lors de sa modification pour étudier d'autres questions de recherche.

Introduction

Les liposomes sont des vésicules sphériques à base de phospholipides qui sont fortement utilisées à la fois dans la recherche fondamentale et appliquée. Ils fonctionnent comme d'excellents systèmes de modèle membranaire, parce que leurs propriétés physiochimiques peuvent être facilement manipulées en variant les composants lipidiques composant le liposome^1,2. En outre, les liposomes constituent le système de nanoporteur de livraison de médicaments le plus utilisé, offrant une pharmacocinétique et une pharmacodynamiie améliorées ainsi qu'une biocompatibilité élevée³.

Pendant de nombreuses années, les liposomes ont principalement été étudiés à l'aide de techniques en vrac, ne donnant accès qu'aux valeurs moyennes de lecture de l'ensemble. Cela a conduit la majorité de ces études à supposer que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Toutefois, ces valeurs moyennes d'ensemble ne sont correctes que si l'ensemble de données sous-jacent est uniformément réparti autour de la valeur moyenne, mais peut représenter une conclusion fausse et biaisée si l'ensemble de données comprend plusieurs populations indépendantes, par exemple. En outre, en supposant que l'ensemble signifie représenter l'ensemble de la population peut négliger l'information contenue dans l'inhomogénéité entre les liposomes. Ce n'est que récemment que des essais quantitatifs ont émergé qui sont capables de sonder les liposomes simples, révélant de grandes inhomogénéités entre les liposomes individuels en ce qui concerne les propriétés physicochimiques importantes, y compris la taille liposome⁴, composition lipidique^5,6, et l'efficacité de l'encapsulation⁷, soulignant l'importance d'étudier les liposomes au niveau liposome unique.

Un domaine de recherche où la moyenne d'ensemble des propriétés liposome a été montrée aux résultats de biais est étudiant les interactions de protéine-membrane dépendantes de liposome^8,9. Traditionnellement, les chercheurs qui étudient de tels processus ont été limités à la préparation de liposomes avec différents diamètres moyens d'ensemble par extrusion à travers des filtres avec différentes tailles de pores⁹. Cependant, l'extraction du diamètre des liposomes individuels à l'aide d'essais liposome simples a révélé de grands chevauchements de population, avec des liposomes extrudés utilisant des filtres de 100 nm et 200 nm affichant jusqu'à 70% de chevauchement dans leur distribution de taille⁴. Ceci pourrait sérieusement biaiser des mesures en vrac des interactions protéine-membrane dépendantes de la taille liposome^10. En effectuant les études d'interaction membrane-protéine à l'aide de l'analyse liposome unique, les chercheurs ont plutôt profité de la taille-polydispersity dans l'échantillon, leur permettant d'étudier un large éventail de diamètres de liposome dans chaque expérience, facilitant de nouvelles découvertes de la façon dont la courbure et la composition de membrane peuvent affecter le recrutement de protéine aux membranes^4,11,12. Un autre domaine où l'application d'essais liposome simples a prouvé instrumental est dans les études mécanistes de la fusion de membrane protéine-négociée^13,14. Pour de telles mesures cinétiques, la capacité d'étudier des événements individuels de fusion a atténué le besoin de synchronisation expérimentale du processus de fusion, permettant de nouvelles perspicacités mécanistes qui auraient autrement été perdues dans la moyenne spatiotemporale faite dans les mesures d'ensemble en vrac. En outre, les liposomes simples ont été employés comme échafaudage de membrane, permettant la mesure des protéines individuelles et offrant de nouvelles connaissances sur la dynamique structurale de protéine transmembrane^15,16. En outre, ces configurations à base de protéoliposome ont permis d'étudier la fonction des transporteurs transmembranaires individuels¹⁷ et les complexes protéiques de formation de pores¹⁸ ainsi que le mécanisme des peptides bioactifs de la^{membrane-perméabilisant19.} Les liposomes simples ont également été utilisés comme nanofluidiques de matière molle avec des liposomes simples immobilisés de surface servant de chambres pour des réactions enzymatiques dans des volumes de 10^-19 L, augmentant le débit et la complexité des essais de criblage avec la consommation minimale de produit^20.

Récemment, des essais de liposome simples ont été employés pour caractériser des liposomes d'administration de drogue à un niveau précédemment non-precendented de détail. Les chercheurs ont été en mesure de quantifier des inhomogénéités significatives dans la quantité de polymère attachée à la surface des liposomes individuels²¹. Les essais de liposome simples ont également permis des mesures des liposomes d'administration de drogue dans les médias complexes, tels que le plasma sanguin, révélant comment les éléments ancrés à la surface de liposome par des ancres de lipide peuvent être susceptibles à la dissociation quand les liposomes sont exposés aux conditions imitant ceux éprouvés pendant la circulation in vivo^22. Dans l'ensemble, la polyvalence et l'utilité des essais de liposome unique sont corroborées par la grande variété de problèmes que ces configurations ont été employées pour traiter, et nous prévoyons que la méthodologie continuera d'être développée et de trouver l'utilisation dans de nouveaux domaines scientifiques.

Ici, nous décrivons un test de liposome unique à base de fluorescence qui permet d'étudier les liposomes individuels d'une manière à haut débit (figure 1). Pour illustrer la méthode, nous l'utilisons pour quantifier la taille et l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels au sein d'un ensemble. L'assay utilise l'imagerie au microscope à fluorescence de liposomes simples immobilisés sur une surface de verre passivated. Nous décrivons d'abord les étapes critiques dans le processus de fabrication de liposome qui assure l'étiquetage fluorescent approprié et l'immobilisation. Ensuite, nous décrivons la préparation de surface nécessaire pour faciliter l'immobilisation de liposome avant d'exposer la procédure pour assurer les densités appropriées de surface de liposome. Nous discutons des paramètres de microscopie importants pour l'acquisition d'images de haute qualité et délinuons comment effectuer l'analyse simple de données, permettant l'extraction de la taille de liposome et de l'inhomogénéité compositionnelle. Ce protocole générique devrait fournir une bonne base pour le chercheur intéressé de développer l'essai plus loin pour son intérêt spécifique de recherche.

Protocole

1. Préparation Liposome

REMARQUE : En bref, la préparation des liposomes comprend habituellement trois étapes cruciales : 1) la préparation des films secs de lipide de la composition désirée de lipide ; 2) réhydratation des lipides pour la formation des liposomes ; et 3) contrôlant la taille et la lamillarité de la population liposome.

1. Peser les lipides et les dissoudre dans tert-butanol:water (9:1) dans des flacons de verre.
   1. Dissoudre le POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW de 760 g/mol) à 50 mm.
   2. Dissoudre le cholestérol (MW à 387 g/mol) à 25 mm.
   3. Dissoudre DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto488; MW de 1 316 g/mol) à 0,1 mm.
   4. Dissoudre DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto655; MW de 1 368 g/mol) à 0,1 mm.
   5. Dissoudre DSPE-PEG2000-biotine (1,2-distearyl-sn-glycero-3-phosphatethanolamine-N-[biotinyl(polyéthylène glycol)-2000]; MW de 3 017 g/mol) à 0,1 mm.
      REMARQUE : Chauffez les lipides à 55 oC et utilisez l'agitation magnétique afin d'assurer la dissolution complète des lipides. Vous pouvez également utiliser un bain de sonication. Les stocks lipidiques inutilisés peuvent être stockés à -20 oC pendant plusieurs mois.
2. Mélanger les stocks lipidiques préparés à l'étape 1.1 à un rapport molaire de POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotine 68.95:30:0.5:0.5:0.05, en ajoutant 138 'L de POPC, 120 'L de cholestérol, 500 'L de chaque lipide fluorescent, et 50 'L de lipide fluorescent, et 50 'L de DSPE-PEG-biotine à une fiole de verre frais.
   REMARQUE : La composition exacte du liposome peut facilement être modifiée afin d'aborder la question spécifique d'intérêt. Voir la discussion pour plus de détails.
3. Desserrer le couvercle de la fiole de verre, et casser le flacon dans l'azote liquide.
4. Lyophiliser le mélange de lipides congelés pendant la nuit.
5. Ajouter 1 ml de tampon D-sorbitol de 200 mM (tampon sorbitol) aux lipides secs.
6. Chauffer le mélange à 45 oC et exposer à l'agitation magnétique pendant au moins 1 h.
   REMARQUE : Le tampon doit refléter la question spécifique qui est abordée (p. ex., les conditions physiologiques pour l'étude des interactions membrane-protéine, ou un tampon spécifique approuvé cliniquement pour étudier les liposomes d'administration de médicaments). Toutefois, si un tampon spécifique n'est pas nécessaire pour l'étude, un tampon sans ions peut être appliqué pour la réhydratation afin de réduire la multilamellarity des liposomes.
7. Congelez la suspension lipidique en trempant le flacon dans de l'azote liquide et attendez que la suspension soit complètement gelée.
8. Tremper la suspension congelée dans un bain chauffant à 55 oC jusqu'à ce que le mélange soit complètement décongelé.
9. Répétez les étapes 1.7 et 1.8 jusqu'à ce que la suspension liposome ait été exposée à un total de 11 cycles de gel/dégel.
   REMARQUE : Les cycles répétés de gel/dégel ont montré pour réduire la multilamellarity^{liposome 23,}qui est primordiale pour la précision de l'essai unique de liposome, car les liposomes de multilamellar fausseront l'intensité de fluorescence contre le rapport de taille de liposome des liposomes. La multilamellarity est habituellement basse en incluant plus de 0.5% lipide PEGylated dans la formulation (tel que généralement fait dans les liposomes pour l'administration de drogue)²⁴.
10. Extrudez la suspension liposome une fois à travers un filtre en polycarbonate de 800 nm à l'aide d'un mini kit d'extrusion. Suivez les instructions du fabricant pour l'assemblage du kit d'extrusion (voir Tableau des matériaux).
11. Conserver les liposomes à 4 oC pendant la nuit.

2. Préparation de surface de la chambre d'imagerie

1. Préparer l'albumine de sérum bovin (BSA; 1 mg/mL), la BSA-biotine (1 mg/mL) et la streptavidine (0,025 mg/mL) dans 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide) 95 mM NaCl buffer (HEPES buffer).
   REMARQUE : Pour prévenir l'éclatement liposomique, le tampon sorbitol utilisé pour la réhydratation et le tampon HEPES utilisé pour la préparation de surface doivent être isotoniques. Il est donc recommandé de vérifier l'osmolarité des tampons avant l'expérience.
2. Mélanger 1 200 l de BSA et 120 l de BSA-biotine et ajouter 300 l de mélange à chaque puits dans une glissière de 8 puits pour la microscopie.
   REMARQUE: Ici, nous utilisons un microscope à 8 puits disponible dans le commerce avec un fond de verre (voir tableau des matériaux),mais le protocole peut facilement être adapté à des chambres de microscope personnalisées.
3. Incuber la glissière pendant 20 min à température ambiante (RT).
4. Laver la glissière 8x avec 300 l de tampon HEPES.
   REMARQUE : Veillez à ne pas laisser les puits sans tampon pendant plus de quelques secondes, car le dessèchement de la surface l'endommagera. En outre, veillez à ne pas rayer la surface avec la pointe de pipette car cela l'endommagera également. Ainsi, lors de l'aspiration tampon d'un puits, le faire à partir du bord ou du coin.
5. Ajouter 250 l de streptavidin e et incuber pendant 10 min à RT.
6. Répétez les 8 lavages décrits à l'étape 2.4.
7. Entreposer la lame du microscope avec 300 l de tampon de sorbitol dans chaque puits à 4 oC. L'évaporation du solvant endommagera la surface, alors mettez la lame de microscope dans un plat De Petri et scellez-la avec du parafilm à moins que la glissière préparée ne soit utilisée immédiatement.

3. Immobilisation Liposome

1. Diluer la suspension liposome à environ 20 m lipides totaux dans le tampon sorbitol. La procédure dans la section 1 donnera une suspension liposome d'environ 10 mM lipidique total.
2. Placez la diapositive sur le microscope et concentrez-vous sur la surface de la chambre en utilisant le signal de réflexion laser accru de l'interface verre/tampon comme guide.
3. Laver la chambre 4x avec 300 l de tampon HEPES frais.
4. Ajouter 10 liposomes dilués (20 m lipides totaux) à un tube de microcentrifuge.
5. Sortir 100 l de tampon de la chambre, ajouter au tube de microcentrifuge préparé à l'étape 3.4, mélanger correctement, et remettre les 110 l dans la chambre.
6. Mettez le spécimen sous le microscope, et utilisez un réglage rudimentaire de microscope capable de détecter le signal du fluorophore liposome(s) pour observer les liposomes étant immobilisés sur la surface.
7. Visez une densité de surface liposome qui est à la fois assez clairsemée pour indentifier les liposomes individuels et assez dense pour faciliter les mesures à haut débit. En règle générale, l'utilisation d'un champ de vision de 50 m x 50 m, 300 à 400 liposomes par image est optimale (figure 2). Ceci peut généralement être réalisé dans un délai de 5 à 10 minutes.
   REMARQUE : Si seulement des particules fluorescentes en mouvement rapide sont détectées dans le champ de vision, une absence ou une concentration trop faible de l'un des composants essentiels au processus d'immobilisation (BSA-biotine, streptavidin, DOPE-PEG-biotine) pourrait en être la cause. Si aucun liposomes n'est détecté, il pourrait être lié à une faible concentration de liposomes, à des réglages inappropriés pour la détection de la fluorescence, ou potentiellement à l'imagerie avec un plan focal qui n'est pas à la surface du verre.
8. Une fois qu'une densité de surface liposome appropriée est atteinte, lavez la chambre 3x avec 200 l de tampon HEPES.
   REMARQUE : Soyez conscient que la cinétique d'immobilisation dépend également des propriétés liposome telles que la taille et la charge et devrait donc toujours être optimisée pour chaque formulation de liposome.

4. Acquisition d'images

REMARQUE : Cette section dépendra beaucoup du système de microscope à la disposition du chercheur qui effectue l'expérience. Ainsi, des lignes directrices générales sur la façon d'effectuer l'imagerie seront décrites. Cependant, les paramètres exacts et la façon de les appliquer varient entre les différentes configurations de microscope. Par exemple, certains systèmes permettent de choisir n'importe quelle combinaison de filtre d'émission souhaitée, tandis que d'autres microscopes sont équipés de filtres préréglés spécifiques.

1. Installez le microscope pour l'imagerie de liposomes simples. Pour assurer une qualité d'image optimale et une analyse de données ultérieure, utilisez une résolution à haute échelle grise et un schéma de pixels qui permet de suréchantillonner les liposomes individuels. Une profondeur de 16 et au moins 1 024 x 1 024 pixels pour une surface de 50 m x 50 m est recommandée. S'il est disponible, la moyenne des lignes peut être appliquée de façon bénéfique pour réduire le bruit (p. ex., 3 scans par ligne).
2. Sélectionnez une puissance laser d'excitation qui assure à la fois un blanchiment non significatif d'un cadre à l'image et un signal assez fort pour discriminer clairement les liposomes individuels de l'arrière-plan. Le réglage optimal dépendra du microscope spécifique utilisé ainsi que de la combinaison fluorophore. Assurez-vous que les détecteurs ne sont pas saturés, car cela va biaiser la quantification de l'intensité.
3. L'imagerie des fluorophores DOPE-Atto488 et DOPE-Atto655 dans les liposomes nécessite l'imagerie de plusieurs canaux. Ainsi, assurez-vous que chaque canal est image de façon séquentielle pour éviter la contre-excitation. Par exemple, prenez d'abord une image en excitant à 488 nm et en lisant l'émission à 495 à 560 nm. Par la suite, prendre une autre image en excitant à 633 nm, mais la lecture de l'émission seulement à 660-710 nm. Les détails dépendront du système de microscope (p. ex., quels lasers et filtres) disponibles.
4. Assurez-vous de couvrir différentes zones de la surface, en acquérant au moins 10 images de l'échantillon, donc l'imagerie d'au moins 3.000 liposomes individuels. Si la densité de surface est inférieure à 300 liposomes/frame, acquérir plus d'images. Assurez-vous de recentrer le microscope pour chaque nouvelle image.
   REMARQUE : Pour l'imagerie à deux canaux, assurez-vous de nommer les fichiers d'image afin que des paires d'images avec les mêmes liposomes dans différents canaux de fluorescence puissent facilement être identifiées lors de l'analyse des données.
5. Afin de quantifier l'incertitude expérimentale liée à la mesure de l'homogénéité de la composition, imagez la même zone de liposomes avant et après le recentrage (voir la figure 3 et la description dans le texte).
6. Exportez les images du logiciel de microscope en tant que fichiers .tiff. Exporter les deux canaux des mêmes liposomes individuellement.

5. Analyse des données

REMARQUE : Des routines d'ajustement 2D Gaussian automatisées spécialement développées ont déjà été employées^6,11,12. Cependant, pour augmenter l'applicabilité de la méthode, un processus d'analyse de données qui peut être facilement mis en œuvre dans tous les laboratoires est décrit.

1. Chargez la paire correspondante d'images .tiff de deux canaux de fluorescence différents dans le même champ d'imagerie dans le logiciel FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
2. Dans le menu Image, choisissez Couleuret utilisez la fonction Merge Channel pour créer un composite des deux canaux.
3. Observez si les liposomes représentés dans deux canaux différents affichent une bonne colocalisation ou si la dérive visible s'est produite.
   REMARQUE: En cas de dérive entre les deux canaux de fluorescence (reconnu comme un décalage systématique et égal X-Y entre le signal dans les deux canaux), l'un des cadres peut être traduit à l'aide de la fonction Transformer 'gt; Traduire dans le menu Image de FIJI. Cependant, il faut faire attention à une telle manipulation d'image. Il est donc recommandé d'éviter la dérive autant que possible lors de l'imagerie des liposomes.
4. Assurez-vous que le plugin ComDet (v.0.3.6.1 ou plus récent) est installé, ou faites-le dans le menu Plugins.
5. Ouvrez le plugin ComDet pour détecter les particules en allant au menu Plugins et en choisissant ComDet v.0.3.6.1 .
6. Dans ComDet, assurez-vous de choisir les particules de détection sur les deux canaux fonction individuelle. Définir la distance maximale entre les taches co-localisées similaires à la taille approximative des particules. Habituellement, 4 pixels est approprié pour les paramètres décrits ici.
7. Le rapport signal-bruit devrait permettre de détecter même les particules sombres avec une faible quantité de fluorescence. Dans ComDet, réglez ce rapport à 3 en définissant la sensibilité de détection dans les deux canaux à des particules très dim (SNR 3).
   REMARQUE : Bien que cette valeur SNR soit habituellement appropriée, il pourrait être nécessaire de la fixer plus haut (par exemple, s'il y a beaucoup de bruit d'image qui peut être identifié comme liposomes et conduire à de faux positifs).
8. Assurez-vous que les cases avec Calcul Colocalisation et Plot Detected Particles in Both Channels sont vérifiés, avant d'appuyer sur OK.
9. Après l'exécution de l'analyse, deux fenêtres pop-up avec Résultats et Résumé s'affichent. Exportation de la table de données Résultats contenant les données de colocalisation (coordonnées de particules et intensité intégrée de chaque particule détectée) vers un logiciel de traitement des données de choix en sauvant la table comme fichier .txt et en l'important dans le logiciel.
10. Assurez-vous que chaque liposome n'est inclus qu'une seule fois dans l'ensemble de données et non à la fois le canal1/canal2 ainsi que le ratio canal2/canal1. Ainsi, filtrer les données de sorte que seule Abs_frame 1 est tracée à l'étape 5.11.
    REMARQUE : En choisissant Colocalized 1, les faux positifs du bruit dans les images peuvent être supprimés de l'analyse. Cependant, tout liposomes avec un seul des deux composants fluorescents présents sera également exclu de l'analyse, ce qui pourrait supprimer des points de données importants de l'analyse.
11. Tracez un histogramme de la colonne avec des données contenant le ratio d'intensité pour chaque liposome détecté.
12. Le degré d'inhomogénéité de composition pour le système liposomique étudié est représenté par la largeur de la distribution du rapport d'intensité. Pour quantifier l'inhomogénéité, adaptez l'histogramme du rapport d'intensité à une fonction gaussienne et extrayez la moyenne et l'écart standard (sigma). Voir la section Résultats représentatifs.
13. Une valeur pour le degré d'inhomogénéité (DI) peut maintenant être calculée en utilisant le coefficient de variation défini comme DI - sigma / .

6. Calibration de taille de Liposome

1. Retirez une partie du stock de liposome et extrudez 21x à travers un filtre en polycarbonate de 50 nm tel que décrit à l'étape 1.10.
2. Diluer les liposomes en ajoutant 10 L de la suspension liposome à 800 ll de tampon sorbitol dans un tube microcentrifuge.
3. Transférer l'échantillon dilué de liposome dans une cuvette à usage unique en polypropylène.
4. Mesurer la taille à l'aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Effectuez au moins trois courses indépendantes pour mesurer la taille et la polydispersité de la suspension liposome.
   REMARQUE : Si nécessaire, utilisez une suspension liposome plus concentrée pour la mesure. Des alternatives au DLS (p. ex., l'analyse du suivi des nanoparticules) peuvent également être appliquées pour mesurer la taille des liposomes. Une description de la façon d'exécuter une telle détermination de la taille des particules dépasse le cadre de ce protocole.
5. Imagez les liposomes d'étalonnage au microscope en utilisant exactement les mêmes paramètres expérimentaux tels que définis dans les étapes 4.1 et 4.2.
6. Extraire l'intensité intégrée pour chaque liposome d'étalonnage dans les images d'étalonnage : Extraire la feuille de résultats filtrés contenant des intensités de fluorescence liposome telles que décrites dans les étapes 5.1-5.10. À partir du tableau des résultats, extraire la colonne "IntegratedInt".
7. Étant donné que l'intensité totale intégrée d'un liposome étiqueté dans sa membrane est proportionnelle à la surface du liposome et est donc proportionnelle au carré de son diamètre, tracez un histogramme d'intensité de racine carrée de l'intensité de fluorescence du liposomes d'étalonnage.
8. Adaptez l'histogramme d'intensité intégré produit à l'étape 6.7 avec une distribution normale de journal et extrayez l'intensité moyenne de fluorescence des liposomes d'étalonnage.
9. Pour déterminer la relation entre l'intensité de la racine carrée (Int_Sqrt) et la taille du liposome, calculez le facteur de correction (C) en utilisant le diamètre liposome moyen (Dia) pesé par le nombre obtenu à partir des mesures DLS: Dia ' C x Int_Sqrt est équivalent à C ' Dia / Int_Sqrt.
10. Calculez les valeurs int_Sqrt pour les liposomes dans l'expérience d'homogénéité compositionnelle et convertissez-les en diamètres en se multipliant avec le facteur de correction.
11. Tracer la valeur du rapport d'intensité en fonction du diamètre pour les liposomes d'homogénéité compositionnelle, atteignant ainsi l'inhomogénéité en fonction de la taille du liposome pour une population de liposomes s'étendant d'environ 50 nm-800 nm.

Résultats

En suivant le protocole décrit, il est possible d'imager des liposomes uniques d'une manière parallèle massive (figure 1). L'immobilisation réussie de surface des liposomes devrait être immédiatement apparente lors de l'ajout de la solution liposome à la chambre (étape 3.6 dans le protocole) car les taches d'intensité limitée de diffraction devraient apparaître dans l'image(figure 1B et

Discussion

Il est important de noter que si nous décrivons en détail comment l'analyse des liposomes simples peut être utilisée pour étudier l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels, la plate-forme est très polyvalente. Comme indiqué précédemment et discuté dans l'introduction, le protocole peut facilement être adapté pour étudier des aspects de la fusion membrane-membrane, des interactions protéine-membrane, ou de la caractérisation liposomique de porteur de drogue. Pour toutes les questions...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ