A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d'une manière parallèle massive à l'aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l'inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.

Résumé

La plupart des recherches utilisant des liposomes comme systèmes de modèles membranaires ou porteurs de médicaments s'appuient sur des techniques de lecture en vrac et supposent donc intrinsèquement que tous les liposomes de l'ensemble sont identiques. Cependant, de nouvelles plates-formes expérimentales capables d'observer les liposomes au niveau d'une seule particule ont permis d'effectuer des études très sophistiquées et quantitatives sur les interactions protéines-membranes ou les propriétés des porteurs de médicaments sur des liposomes individuels, évitant ainsi les erreurs de la moyenne d'ensemble. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation, la détection et l'analyse de liposomes simples à l'aide d'un test de microscopie à base de fluorescence, facilitant ces mesures à partiilule unique. La configuration permet d'imagerie liposomes individuels d'une manière massive parallèle et est utilisé pour révéler la taille intra-échantillon et les inhomogénéités de composition. En outre, le protocole décrit les avantages de l'étude des liposomes au niveau liposome unique, les limites de l'assay, et les caractéristiques importantes à considérer lors de sa modification pour étudier d'autres questions de recherche.

Introduction

Les liposomes sont des vésicules sphériques à base de phospholipides qui sont fortement utilisées à la fois dans la recherche fondamentale et appliquée. Ils fonctionnent comme d'excellents systèmes de modèle membranaire, parce que leurs propriétés physiochimiques peuvent être facilement manipulées en variant les composants lipidiques composant le liposome^1,2. En outre, les liposomes constituent le système de nanoporteur de livraison de médicaments le plus utilisé, offrant une pharmacocinétique et une pharmacodynamiie améliorées ainsi qu'une biocompatibilité élevée³.

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Protocole

1. Préparation Liposome

REMARQUE : En bref, la préparation des liposomes comprend habituellement trois étapes cruciales : 1) la préparation des films secs de lipide de la composition désirée de lipide ; 2) réhydratation des lipides pour la formation des liposomes ; et 3) contrôlant la taille et la lamillarité de la population liposome.

1. Peser les lipides et les dissoudre dans tert-butanol:water (9:1) dans des flacons de verre.
   1. Dissoudre le POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW de 760 g/mol) à 50 mm.
   2. Dissoudre le cholestérol (MW à 387 g/mol) à 25 mm.
   3. Dissoudre DOPE-Atto488 (1,2-dioleoy....

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Résultats

En suivant le protocole décrit, il est possible d'imager des liposomes uniques d'une manière parallèle massive (figure 1). L'immobilisation réussie de surface des liposomes devrait être immédiatement apparente lors de l'ajout de la solution liposome à la chambre (étape 3.6 dans le protocole) car les taches d'intensité limitée de diffraction devraient apparaître dans l'image(figure 1B et

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Discussion

Il est important de noter que si nous décrivons en détail comment l'analyse des liposomes simples peut être utilisée pour étudier l'inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels, la plate-forme est très polyvalente. Comme indiqué précédemment et discuté dans l'introduction, le protocole peut facilement être adapté pour étudier des aspects de la fusion membrane-membrane, des interactions protéine-membrane, ou de la caractérisation liposomique de porteur de drogue. Pour toutes les questions.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65 °C
Heating plate with Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65 °C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ