Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.

Zusammenfassung

Die meisten Forschungen, die Liposomen als Membranmodellsysteme oder Arzneimittelzufuhrträger einsetzen, basieren auf Massenauslesetechniken und gehen daher von einer identischen Liposomen des Ensembles aus. Neue experimentelle Plattformen, die Liposomen auf Einteilchenebene beobachten können, haben es jedoch ermöglicht, hochentwickelte und quantitative Studien über Protein-Membran-Wechselwirkungen oder Wirkstoffträgereigenschaften an einzelnen Liposomen durchzuführen. fehlervermeidung durch Ensemble-Mittelung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung, Detektion und Analyse einzelner Liposomen mit hilfe eines fluoreszenzbasierten Mikroskopie-Assays vor, der solche Einzelpartikelmessungen erleichtert. Das Setup ermöglicht die massive parallele Abbildung einzelner Liposomen und wird eingesetzt, um die Größe der Intra-Proben und kompositorische Inhomogenitäten aufzudecken. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Vorteile der Untersuchung von Liposomen auf der ebene Liposomenebene, die Grenzen des Assays und die wichtigen Merkmale, die bei der Änderung berücksichtigt werden müssen, um andere Forschungsfragen zu untersuchen.

Einleitung

Liposomen sind sphärische Phospholipid-basierte Vesikel, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung stark verwendet werden. Sie fungieren als ausgezeichnete Membranmodellsysteme, da ihre physiochemischen Eigenschaften leicht durch Variation der Lipidkomponenten, aus denen das Liposome^{n 1,2}besteht, manipuliert werden können. Auch Liposomen bilden das am häufigsten verwendete Nanocarrier-System für die Arzneimittelabgabe und bieten eine verbesserte Pharmakokinetik und Pharmakodynamik sowie eine hohe Biokompatibilität³.

Seit vielen Jahren werden Liposomen hauptsächlich mit Massentechniken untersucht, so dass nur Zugang zu ensembledurchschnittlichen Auslesewerten besteht. Dies hat dazu geführt, dass die meisten dieser Studien davon ausgegangen sind, dass alle Liposomen im Ensemble identisch sind. Solche ensemble-gemittelten Werte sind jedoch nur dann korrekt, wenn das zugrunde liegende Dataset gleichmäßig um den Mittelwert verteilt ist, kann jedoch eine falsche und verzerrte Schlussfolgerung darstellen, wenn das Dataset z. B. mehrere unabhängige Ebenen enthält. Darüber hinaus kann die Annahme, dass das Ensemble die gesamte Bevölkerung repräsentieren soll, die Informationen übersehen, die in der Inhomogenität zwischen Liposomen enthalten sind. Erst vor kurzem sind quantitative Assays aufgetaucht, die in der Lage sind, einzelne Liposomen zu untersuchen, die große Inhomogenitäten zwischen einzelnen Liposomen in Bezug auf wichtige physikalisch-chemische Eigenschaften wie Liposomengröße^4,Lipidzusammensetzung^5,6und Verkapselungseffizienz⁷aufdecken, was die Bedeutung der Untersuchung von Liposomen auf der Ebene der einzelnen Liposomen unterstreicht.

Ein Forschungsgebiet, in dem die Ensemble-Mittelung der Liposomen-Eigenschaften gezeigt wurde, um Verzerrungergebnisse zu untersuchen, ist die Untersuchung von Liposomengrößenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen^8,9. Traditionell beschränkten sich Forscher, die solche Prozesse untersuchen, auf die Herstellung von Liposomen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Ensembledurchmessern durch Extrusion durch Filter mit unterschiedlichen Porengrößen⁹. Die Extraktion des Durchmessers einzelner Liposomen mit einzelnen Liposomen-Assays hat jedoch große Populationsüberlappungen ergeben, wobei Liposomen mit 100 nm und 200 nm Filtern extrudiert werden, die bis zu 70 % überlappen in ihrer Größenverteilung⁴. Dies könnte Massenmessungen von liposomen größenabhängigen Protein-Membran-Wechselwirkungen stark verzerrt¹⁰. Durch die Durchführung der Membran-Protein-Interaktionsstudien mit dem einzigen Liposomen-Assay nutzten die Forscher stattdessen die Größen-Polydispersität innerhalb der Probe, so dass sie eine breite Palette von Liposomendurchmessern in jedem einzelnen Experiment untersuchen konnten, was neue Entdeckungen darüber ermöglichte, wie Membrankrümmung und -zusammensetzung die Proteinrekrutierung an Membranen^4,11,12beeinflussen können. Ein weiteres Feld, in dem sich die Anwendung einzelner Liposomen-Assays als instrumentelle Seithers erwiesen hat, ist die mechanistische Entwicklung der proteinvermittelten Membranfusion^13,14. Für solche kinetischen Messungen hat die Fähigkeit, einzelne Fusionsereignisse zu untersuchen, die Notwendigkeit einer experimentellen Synchronisation des Fusionsprozesses verringert und neue mechanistische Einsichten ermöglicht, die sonst in der räumzeitlichen Mittelung in Massenensemblemessungen verloren gegangen wären. Zusätzlich wurden einzelne Liposomen als Membrangerüst eingesetzt, das die Messung einzelner Proteine ermöglichte und neue Erkenntnisse über die Transmembranproteinstrukturdynamik^15,16. Darüber hinaus ermöglichten solche proteoliposome-basierten Setups die Untersuchung der Funktion einzelner Transmembrantransporter¹⁷ und porenbildender Proteinkomplexe¹⁸ sowie des Mechanismus bioaktiver membranpermeabilisierender Peptide¹⁹. Einzelne Liposomen wurden auch als Weichstoff-Nanofluidik mit oberflächenimmobilisierten Einzelliposomen verwendet, die als Kammern für enzymatische Reaktionen in Volumen von 10^-19 L dienten, wodurch der Durchsatz und die Komplexität der Screening-Assays mit minimalem Produktverbrauch²⁰erhöht werden.

Kürzlich wurden einzelne Liposomen-Assays zur Charakterisierung von Wirkstoffabgabe-Liposomen auf einer bisher unvorhergesagten Detaillierungsebene verwendet. Die Forscher konnten signifikante Inhomogenitäten in der Menge an Polymer quantifizieren, die an der Oberfläche einzelner Liposomen befestigt ist²¹. Die einzelnen Liposomen-Assays erlaubten auch Messungen von Liposomen der Arzneimittelabgabe in komplexen Medien wie Blutplasma, die aufzeigen, wie Elemente, die durch Lipidanker an der Liposomenoberfläche verankert sind, anfällig für Dissoziation sein können, wenn Liposomen Bedingungen ausgesetzt sind, die jene imitieren, die während der in vivo Zirkulation nachgeahmt werden²². Insgesamt werden die Vielseitigkeit und Nützlichkeit der einzelnen Liposomen-Assays durch die große Vielfalt der Probleme belegt, die diese Setups angehen, und wir gehen davon aus, dass die Methodik weiter entwickelt wird und in neuen wissenschaftlichen Bereichen Anwendung findet.

Hier beschreiben wir einen fluoreszenzmikroskopischen Einzelliposomen-Assay, der es ermöglicht, einzelne Liposomen in einer Hochdurchsatz-Manier zu untersuchen (Abbildung 1). Um die Methode zu veranschaulichen, verwenden wir sie, um die Größe und kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen innerhalb eines Ensembles zu quantifizieren. Der Test verwendet Fluoreszenzmikroskop-Bildgebung von einzelnen Liposomen, die auf einer passivierten Glasoberfläche immobilisiert sind. Wir beschreiben zunächst die kritischen Schritte im Liposomen-Herstellungsprozess, der eine ordnungsgemäße fluoreszierende Liposomenkennzeichnung und Immobilisierung sicherstellt. Anschließend beschreiben wir die Oberflächenvorbereitung, die erforderlich ist, um die Liposomenimmobilisierung zu erleichtern, bevor wir das Verfahren zur Sicherstellung geeigneter Liposomenoberflächendichten skizzieren. Wir besprechen die Mikroskopieparameter, die für den Erwerb hochwertiger Bilder wichtig sind, und zeigen, wie eine einfache Datenanalyse durchgeführt werden kann, die die Extraktion von Liposomengröße und kompositorische Inhomogenität ermöglicht. Dieses generische Protokoll sollte dem interessierten Forscher eine gute Grundlage bieten, um den Assay für sein spezifisches Forschungsinteresse weiterzuentwickeln.

Protokoll

1. Liposomen-Vorbereitung

HINWEIS: Kurz gesagt, die Herstellung von Liposomen umfasst in der Regel drei entscheidende Schritte: 1) Herstellung von trockenen Lipidfilmen der gewünschten Lipidzusammensetzung; 2) Rehydratation der Lipide zur Bildung von Liposomen; und 3) Kontrolle der Größe und Lamellenität der Liposomenpopulation.

1. Die Lipide abwägen und in tert-butanol:wasser (9:1) in Glasfläschchen auflösen.
   1. POPC auflösen (1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin; MW = 760 g/mol) bis 50 mM.
   2. Cholesterin (MW = 387 g/mol) bis 25 mM auflösen.
   3. DOPE-Atto488 (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-Atto488 auflösen; MW = 1.316 g/mol) bis 0,1 mM.
   4. DOPE-Atto655 (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphoethanolamin-Atto655 auflösen; MW = 1.368 g/mol) bis 0,1 mM.
   5. DSPE-PEG2000-Biotin (1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phosphatethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) bis 0,1 mM.
      HINWEIS: Erhitzen Sie Lipide auf 55 °C und verwenden Sie magnetisches Rühren, um eine vollständige Auflösung der Lipide zu gewährleisten. Alternativ können Sie ein Beschallungsbad verwenden. Nicht verwendete Lipidbestände können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
2. Mischen Sie die in Schritt 1.1 hergestellten Lipidbestände zu einem Molarenverhältnis von POPC:cholesterin:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0.05, durch Zugabe von 138 l POPC, 120 l Cholesterin, 500 l jedes fluoreszierend markierten Lipids und 50 DSPE-PEG-Biotin zu einer frischen Glasdurchstechflasche.
   HINWEIS: Die genaue Liposomenzusammensetzung kann leicht geändert werden, um die spezifische Frage des Interesses zu adressieren. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.
3. Lösen Sie den Deckel der Glasdurchstechflasche und frieren Sie die Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff ein.
4. Lyophilisieren Sie die gefrorene Lipidmischung über Nacht.
5. 1 ml 200 mM D-Sorbitolpuffer (Sorbitolpuffer) zu den trockenen Lipiden hinzufügen.
6. Das Gemisch auf 45 °C erhitzen und mindestens 1 h dem magnetischen Rühren aussetzen.
   HINWEIS: Der Puffer sollte die spezifische Frage widerspiegeln, die behandelt wird (z. B. physiologische Bedingungen für die Untersuchung von Membran-Protein-Wechselwirkungen oder einen spezifischen klinisch zugelassenen Puffer für die Untersuchung von Liposomen der Arzneimittelabgabe). Wenn jedoch kein spezifischer Puffer für die Studie benötigt wird, kann ein Puffer ohne Ionen für die Rehydratation angewendet werden, um die Multilamellarität der Liposomen zu reduzieren.
7. Die Lipidsuspension einfrieren, indem Sie die Durchstechflasche in flüssigen Stickstoff tauchen, und warten Sie, bis die Suspension vollständig eingefroren ist.
8. Die gefrorene Suspension in einem Heizbad bei 55 °C tauchen, bis das Gemisch vollständig aufgetaut ist.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8, bis die Liposomensuspension insgesamt 11 Frost-/Tauzyklen ausgesetzt ist.
   HINWEIS: Wiederholte Frost-/Tauzyklen haben gezeigt, dass liposome multilamellarity²³reduziert wird, was für die Genauigkeit des einzelnen Liposomen-Assays von größter Bedeutung ist, da multilamellare Liposomen die Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Liposomengrößenverhältnis der Liposomen verzerren. Die Multilamellarität ist in der Regel von Natur aus niedrig, wenn mehr als 0,5% PEGylyliertes Lipid in der Formulierung (wie üblich in Liposomen für die Medikamentenabgabe)²⁴.
10. Extrudieren Sie die Liposomensuspension einmal durch einen 800 nm Polycarbonatfilter mit einem Mini-Extrusionskit. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Montage des Extrusionskits (siehe Tabelle der Materialien).
11. Die Liposomen über Nacht bei 4 °C lagern.

2. Oberflächenvorbereitung der Bildgebungskammer

1. Rinderserumalbumin (BSA; 1 mg/ml), BSA-Biotin (1 mg/ml) und Streptavidin (0,025 mg/ml) in 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure) 95 mM NaCl-Puffer (HEPES-Puffer) zubereiten.
   HINWEIS: Um liposomalen Ausbruch zu verhindern, sollten der Für die Rehydratation verwendete Sorbitolpuffer und der HEPES-Puffer, der für die Oberflächenvorbereitung verwendet wird, isotonisch sein. Es wird daher empfohlen, die Osmolarität der Puffer vor dem Experiment zu überprüfen.
2. Mischen Sie 1.200 l BSA und 120 l BSA-Biotin und fügen Sie jedem Bohrgut 300 l des Gemischs in einem 8-Well-Dia für die Mikroskopie hinzu.
   HINWEIS: Hier verwenden wir ein handelsübliches 8-Well-Mikroskop-Dia mit Einem Glasboden (siehe Materialtabelle), aber das Protokoll kann leicht an kundenspezifische Mikroskopkammern angepasst werden.
3. Inkubieren Sie die Rutsche für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
4. Waschen Sie das Dia 8x mit 300 l HEPES Puffer.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Brunnen nicht für mehr als ein paar Sekunden ohne Puffer zu lassen, da das Austrocknen der Oberfläche sie beschädigen wird. Achten Sie außerdem darauf, die Oberfläche nicht mit der Pipettenspitze zu zerkratzen, da dies auch sie beschädigen wird. Wenn Sie also Puffer von einem Brunnen aus ansaugen, tun Sie dies von der Kante oder Ecke aus.
5. Fügen Sie 250 L Streptavidin hinzu und brüten Sie 10 min bei RT.
6. Wiederholen Sie die in Schritt 2.4 beschriebenen 8 Wähbe.
7. Bewahren Sie das Mikroskopschlitten mit 300 l Sorbitolpuffer in jedem Brunnen bei 4 °C auf. Die Verdunstung des Lösungsmittels wird die Oberfläche beschädigen, so setzen Sie das Mikroskop-Dia in eine Petrischale und versiegeln Sie es mit Parafilm, es sei denn, der vorbereitete Schlitten wird sofort verwendet.

3. Liposome immobilisieren

1. Verdünnen Sie die Liposomensuspension im Sorbitolpuffer auf ca. 20 M Gesamtfett. Das Verfahren in Abschnitt 1 ergibt eine Liposomensuspension von ca. 10 mM Gesamtlipid.
2. Platzieren Sie das Dia auf dem Mikroskop und fokussieren Sie sich auf die Oberfläche der Kammer mit dem erhöhten Laserreflexionssignal von der Glas-Puffer-Schnittstelle als Führung.
3. Waschen Sie die Kammer 4x mit 300 l frischem HEPES-Puffer.
4. Fügen Sie einem Mikrozentrifugenröhrchen 10 l verdünnten Liposomenbestand (20 M Gesamtfett) hinzu.
5. Nehmen Sie 100 l Puffer aus der Kammer heraus, fügen Sie dem in Schritt 3.4 hergestellten Mikrozentrifugenrohr das Mikrozentrifugenrohr hinzu, mischen Sie es richtig, und legen Sie die 110 l wieder in die Kammer.
6. Stellen Sie die Probe unter das Mikroskop, und verwenden Sie eine rudimentale Mikroskopeinstellung, die in der Lage ist, Signale aus dem/den Liposomenfluorophor(en) zu erkennen, um zu beobachten, wie die Liposomen auf der Oberfläche immobilisiert werden.
7. Ziel einer Liposomen-Oberflächendichte, die gleichzeitig spärlich genug ist, um einzelne Liposomen zu entuten und so dicht genug ist, dass sie Messungen mit hohem Durchsatz ermöglicht. In der Regel ist die Verwendung eines Sichtfelds von 50 x 50 m optimal (Abbildung 2). Dies kann in der Regel innerhalb von 5 x 10 min erreicht werden.
   HINWEIS: Wenn nur schnell bewegliche Fluoreszenzpartikel im Sichtfeld nachgewiesen werden, könnte eine Abwesenheit oder zu geringe Konzentration einer der für den Immobilisierungsprozess kritischen Komponenten (BSA-Biotin, Streptavidin, DOPE-PEG-Biotin) die Ursache sein. Wenn keine Liposomen nachgewiesen werden, könnte es entweder mit einer geringen Konzentration von Liposomen, unsachgemäßen Einstellungen für die Fluoreszenzdetektion oder möglicherweise mit einer Fokalebene, die nicht an der Glasoberfläche liegt, zusammenhängen.
8. Sobald eine entsprechende Liposomen-Oberflächendichte erreicht ist, waschen Sie die Kammer 3x mit 200 l HEPES-Puffer.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass die Immobilisierungskinetik auch von Liposomeneigenschaften wie Größe und Ladung abhängt und daher immer für jede Liposomenformulierung optimiert werden sollte.

4. Bildaufnahme

HINWEIS: Dieser Abschnitt hängt stark vom Mikroskopsystem ab, das dem Forscher zur Durchführung des Experiments zur Verfügung steht. Daher werden allgemeine Richtlinien für die Durchführung der Bildgebung beschrieben. Die genauen Einstellungen und deren Anwendung variieren jedoch zwischen den verschiedenen Mikroskop-Setups. Beispielsweise ermöglichen einige Systeme die Auswahl beliebiger Emissionsfilterkombinationen, während andere Mikroskope mit speziellen, voreingestellten Filtern ausgestattet sind.

1. Richten Sie das Mikroskop für die Abbildung einzelner Liposomen ein. Um eine optimale Bildqualität und anschließende Datenanalyse zu gewährleisten, verwenden Sie eine hohe Graustufenauflösung und ein Pixelschema, das ein Oversampling einzelner Liposomen ermöglicht. Es wird eine Bittiefe von 16 und mindestens 1.024 x 1.024 Pixel für eine Fläche von 50 x 50 mm empfohlen. Falls verfügbar, kann die Line-Mittelung vorteilhaft angewendet werden, um Rauschen zu reduzieren (z. B. 3 Scans pro Zeile).
2. Wählen Sie eine Anregungslaserleistung, die sowohl eine nicht signifikante Frame-to-Frame-Bleaching als auch ein starkes Signal gewährleistet, um einzelne Liposomen deutlich vom Hintergrund zu unterscheiden. Die optimale Einstellung hängt vom verwendeten Mikroskop sowie der Fluorophor-Kombination ab. Stellen Sie sicher, dass Detektoren nicht gesättigt sind, da dies die Intensitätsquantifizierung verzerrt.
3. Die Bildgebung sowohl der Fluorophore DOPE-Atto488 als auch des DOPE-Atto655 in den Liposomen erfordert die Abbildung mehrerer Kanäle. Stellen Sie daher sicher, dass jeder Kanal sequenziell abgebildet wird, um eine Kreuzerregung zu vermeiden. Nehmen Sie z. B. zuerst ein Bild, indem Sie es mit 488 nm spannend machen und die Aussenentwicklung bei 495-560 nm. Danach nehmen Sie ein anderes Bild durch spannend bei 633 nm, aber Die Ablesung nur bei 660-710 nm. Die Besonderheiten hängen vom mikroskopischen System (z.B. welche Laser und Filter) abhängen.
4. Achten Sie darauf, verschiedene Bereiche der Oberfläche abzudecken, mindestens 10 Bilder der Probe zu erfassen und so mindestens 3.000 einzelne Liposomen zu bilden. Wenn die Oberflächendichte unter 300 Liposomen/Rahmen liegt, erfassen Sie mehr Bilder. Stellen Sie sicher, dass Sie das Mikroskop für jedes neue Bild neu fokussieren.
   HINWEIS: Achten Sie bei der Zweikanal-Bildgebung darauf, die Bilddateien so zu benennen, dass Bildpaare mit den gleichen Liposomen in verschiedenen Fluoreszenzkanälen während der Datenanalyse leicht identifiziert werden können.
5. Um die experimentelle Unsicherheit im Zusammenhang mit der Messung der kompositorischen Inhomogenität zu quantifizieren, stellen Sie sich den gleichen Bereich von Liposomen vor und nach der Neuausrichtung vor (siehe Abbildung 3 und Beschreibung im Text).
6. Exportieren Sie die Bilder aus der Mikroskopsoftware als .tiff-Dateien. Exportieren Sie die beiden Kanäle der gleichen Liposomen einzeln.

5. Datenanalyse

HINWEIS: Speziell entwickelte automatisierte 2D Gaußsche Montageroutinen wurden zuvor eingesetzt^6,11,12. Um die Anwendbarkeit der Methode zu erhöhen, wird jedoch ein Datenanalyseprozess beschrieben, der in allen Laboratorien einfach implementiert werden kann.

1. Laden Sie das entsprechende Paar von .tiff-Bildern von zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen im selben Bildgebungsfeld in die FIJI-Software (FIJI Is Just ImageJ).
2. Wählen Sie im Menü Bild Farbeaus, und verwenden Sie die Funktion Kanal zusammenführen, um eine Kombination der beiden Kanäle zu erstellen.
3. Beobachten Sie, ob die liposomen, die in zwei verschiedenen Kanälen abgebildet sind, eine gute Kolokalisierung aufweisen oder ob eine sichtbare Drift aufgetreten ist.
   HINWEIS: Im Falle einer Drift zwischen den beiden Fluoreszenzkanälen (als systematischer und gleicher X-Y-Offset zwischen dem Signal in den beiden Kanälen erkannt) kann einer der Frames mit der Funktion Transformieren > Übersetzen im Bildmenü von FIJI übersetzt werden. Bei solchen Bildmanipulationen sollte jedoch Vorsicht geboten sein. Es wird daher empfohlen, bei der Abbildung der Liposomen so weit wie möglich Driften zu vermeiden.
4. Stellen Sie sicher, dass das ComDet-Plugin (v.0.3.6.1 oder neuer) installiert ist, oder tun Sie dies im Plugins-Menü.
5. Öffnen Sie das ComDet-Plugin, um Partikel zu erkennen, indem Sie zum Plugins-Menü gehen und ComDet v.0.3.6.1 > Partikel erkennenauswählen.
6. Stellen Sie in ComDet sicher, dass Sie die Funktion Partikel auf beiden Kanälen einzeln erkennen. Legen Sie die maximale Entfernung zwischen kolokalisierten Punkten fest, die der Größe der ungefähren Partikelähnelt. Normalerweise sind 4 Pixel für die hier beschriebenen Einstellungen geeignet.
7. Das Signal-Rausch-Verhältnis sollte den Nachweis von selbst schwachen Partikeln mit geringer Fluoreszenzmenge ermöglichen. Legen Sie in ComDet dieses Verhältnis auf 3 fest, indem Sie die Empfindlichkeit der Erkennung in beiden Kanälen auf Sehr dim Partikel (SNR = 3)setzen.
   HINWEIS: Obwohl dieser SNR-Wert in der Regel angemessen ist, kann es notwendig sein, ihn höher zu setzen (z. B. wenn es eine Menge Bildrauschen gibt, die als Liposomen identifiziert werden können und zu falschen Positivwerten führen).
8. Stellen Sie sicher, dass die Felder mit Co-Lokalisierung berechnen und Plot-erkannte Partikel in beiden Kanälen aktiviert sind, bevor Sie OKdrücken.
9. Nach dem Ausführen der Analyse werden zwei Popupfenster mit Ergebnissen und Zusammenfassung angezeigt. Exportieren Sie die Datentabelle Ergebnisse, die die Kolokalisierungsdaten (Partikelkoordinaten und integrierte Intensität jedes entdeckten Partikels) enthalten, in eine Datenverarbeitungssoftware ihrer Wahl, indem Sie die Tabelle als .txt-Datei speichern und in die Software importieren.
10. Stellen Sie sicher, dass jedes Liposom nur einmal im Datensatz enthalten ist und nicht sowohl das Channel1/channel2 als auch das Channel2/Channel1-Verhältnis. Filtern Sie also die Daten, sodass nur Abs_frame = 1 in Schritt 5.11 dargestellt wird.
    HINWEIS: Durch die Auswahl von Colocalized = 1können falsche Positivmeldungen aus rauschenden Bildern aus der Analyse entfernt werden. Aber auch Liposomen mit nur einer der beiden vorhandenen fluoreszierenden Komponenten werden von der Analyse ausgeschlossen, wodurch möglicherweise wichtige Datenpunkte aus der Analyse entfernt werden.
11. Zeichnen Sie ein Histogramm der Spalte mit Daten, die das Intensitätsverhältnis für jedes erkannte Liposom enthalten.
12. Der Grad der kompositorischen Inhomogenität für das untersuchte liposomale System wird durch die Breite der Intensitätsverhältnisverteilung dargestellt. Um die Inhomogenität zu quantifizieren, passen Sie das Intensitätsverhältnis Histogramm mit einer Gaußschen Funktion an und extrahieren Sie den Mittelwert () und die Standardabweichung (Sigma). Siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
13. Ein Wert für den Grad der Inhomogenität (DI) kann nun mit dem Variationskoeffizienten berechnet werden, der als DI = Sigma / B definiert ist.

6. LiposomeN-Größenkalibrierung

1. Nehmen Sie einen Teil des Liposomenbestands heraus und extrudieren Sie 21x durch einen 50 nm Polycarbonatfilter, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
2. Verdünnen Sie die Liposomen, indem Sie 10 l der Liposomensuspension zu 800 l Sorbitpuffer in einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen.
3. Die verdünnte Liposomenprobe in eine Polypropylen-Einwegküvette übertragen.
4. Messen Sie die Größe mit der dynamischen Lichtstreuung (DLS). Führen Sie mindestens drei unabhängige Durchläufe durch, um die Größe und Polydispersität der Liposomensuspension zu messen.
   HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine konzentriertere Liposomensuspension für die Messung. Alternativen zu DLS (z.B. Nanopartikel-Tracking-Analyse) können auch zur Messung der Größe der Liposomen eingesetzt werden. Eine Beschreibung, wie eine solche Partikelgrößenbestimmung ausgeführt werden kann, geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus.
5. Bildn die Kalibrierliposomen auf dem Mikroskop mit genau den gleichen experimentellen Einstellungen wie in den Schritten 4.1 und 4.2 definiert.
6. Extrahieren Sie die integrierte Intensität für jedes Kalibrierliposom in den Kalibrierbildern: Extrahieren Sie das gefilterte Ergebnisblatt mit liposomen Fluoreszenzintensitäten, wie in den Schritten 5.1-5.10 beschrieben. Extrahieren Sie aus der Ergebnistabelle die Spalte "IntegratedInt".
7. Da die gesamte integrierte Intensität eines in seiner Membran beschrifteten Liposomenproportionalzur der Oberfläche des Liposoms und somit proportional zum Quadrat seines Durchmessers ist, zeichnen Sie ein quadratisches Wurzelintensitätshistogramm der Fluoreszenzintensität des Kalibrierung liposomen.
8. Passen Sie das integrierte Intensitätshistogramm in Schritt 6.7 mit einer Log-Normalverteilung an und extrahieren Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Kalibrierliposomen.
9. Um die Beziehung zwischen der Quadratwurzelintensität (Int_Sqrt) und der Liposomengröße zu bestimmen, berechnen Sie den Korrekturfaktor (C) mit dem durchschnittlichen Liposomendurchmesser (Dia), der durch die Anzahl der DLS-Messungen gewogen wird: Dia = C x Int_Sqrt entspricht C = Dia / Int_Sqrt.
10. Berechnen Sie Int_Sqrt-Werte für die Liposomen im Kompositorischen Inhomogenitätsexperiment und wandeln Sie diese in Durchmesser um, indem Sie sie mit dem Korrekturfaktor multiplizieren.
11. Plotten Sie den Intensitätsverhältniswert als Funktion des Durchmessers für die kompositorischen Inhomogenitätsliposomen und erreichen So die Inhomogenität als Funktion der Liposomengröße für eine Population von Liposomen, die sich von ca. 50 nm bis 800 nm erstrecken.

Ergebnisse

Nach dem beschriebenen Protokoll ist es möglich, einzelne Liposomen massiv parallel abzubilden (Abbildung 1). Die erfolgreiche Oberflächenimmobilisierung von Liposomen sollte sofort bei Zugabe der Liposomenlösung in die Kammer sichtbar sein (Schritt 3.6 im Protokoll), da beugungsbegrenzte Intensitätsflecken im Bild erscheinen sollten (Abbildung 1B und Abbildung 1C

Diskussion

Es ist wichtig zu beachten, dass wir zwar detailliert beschreiben, wie der einzelne Liposomen-Assay verwendet werden kann, um die kompositorische Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen zu untersuchen, die Plattform jedoch sehr vielseitig ist. Wie bereits in der Einleitung gezeigt und diskutiert, kann das Protokoll leicht angepasst werden, um Aspekte der Membran-Membran-Fusion, Protein-Membran-Wechselwirkungen oder liposomalen Wirkstoffträgercharakterisierung zu studieren. Bei allen wissenschaftlichen Fragen, die an...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ