개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

요약

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

초록

막 모형 시스템 또는 약 납품 운반대로 리포솜을 채택하는 대부분의 연구는 대량 판독 기술에 의존하고 따라서 본질적으로 앙상블의 모든 리포솜이 동일하다고 가정합니다. 그러나 단일 입자 수준에서 리포솜을 관찰할 수 있는 새로운 실험 플랫폼은 개별 리포좀에 대한 단백질 막 상호 작용 또는 약물 담체 특성에 대한 매우 정교하고 정량적인 연구를 수행할 수 있게 해 주었으며, 따라서 앙상블 평균에서 오류를 방지. 여기에서 우리는 형광 기지를 둔 현미경 분석법을 사용하여 단 하나 리포좀을 준비, 검출 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시하고, 그 같은 단 하나 입자 측정을 촉진하. 이 설정은 개별 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미징할 수 있게 하며 샘플 내 크기와 조성 불균질성을 드러내기 위해 사용됩니다. 추가적으로, 프로토콜은 단 하나 리포솜 수준에서 리포솜 공부의 이점, 분석결과의 한계 및 그밖 연구 질문을 공부하기 위하여 그것을 수정할 때 고려될 중요한 특징을 기술합니다.

서문

리포솜은 기초와 응용 연구 에서 둘 다 무겁게 이용되는 구형 인지질 기지를 둔 소포입니다. 이들은 우수한 멤브레인 모델 시스템으로 기능하며, 이들의 생리화학적 특성은 리포좀^1,2를구성하는 지질 성분을 변화시킴으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문이다. 또한, 리포솜은 향상된 약동학 및 약력학뿐만 아니라 높은 생체 적합성^3을제공하는 가장 많이 사용되는 약물 전달 나노 캐리어 시스템을 구성합니다.

몇 년 동안, 리포솜은 주로 대량 기술을 사용하여 연구되어 앙상블 평균 판독 값에만 액세스 할 수 있습니다. 이것은 앙상블에 있는 모든 리포좀이 동일하다는 것을 가정하기 위하여 이 연구 결과의 대다수를 지도했습니다. 그러나 이러한 앙상블 평균 값은 기본 데이터 집합이 평균 값 주위에 균일하게 분포되어 있는 경우에만 정확하지만 데이터 집합에 여러 독립 모집단이 포함된 경우 거짓및 편향된 결론을 나타낼 수 있습니다. 또한, 전체 인구를 나타내는 앙상블 의미를 가정하면 리포솜 사이의 불균질성 내에 있는 정보를 간과할 수 있다. 최근에는 단일 리포좀을 조사할 수 있는 정량적 분석이 등장하여, 리포좀 크기^4,지질^조성5,6,및 캡슐화 효율^7을포함한 중요한 물리화학적 특성에 대하여 개별 리포좀 들 사이의 큰 불균질성을 드러내며, 단일 리포좀 수준에서 리포좀을 연구하는 것의 중요성을 강조하고 있다.

리포솜 성질의 앙상블 평균화가 편향된 결과로 나타난 연구 영역은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호작용을 연구하고^있다8,9. 전통적으로, 이러한 과정을 연구하는 연구원은 다른 기공 크기^9필터를통해 압출에 의해 다른 앙상블 평균 직경리포솜을 준비하는 것으로 제한되었습니다. 그러나, 단일 리포좀 어세스를 사용하여 개별 리포좀의 직경을 추출하는 것은 큰 인구 중복을 밝혀, 리포솜을 사용하여 압출 100 nm 및 200 nm 필터는 그들의 크기 분포에 70% 중첩까지 표시^4. 이것은 리포솜 크기 의존성 단백질 막 상호^작용10의대량 측정을 심각하게 편향시킬 수 있었다. 단일 리포솜 분석법을 사용하여 막 단백질 상호 작용 연구를 수행, 연구원은 대신 샘플 내에서 크기 다분산성을 활용, 각 단일 실험 내에서 리포좀 직경의 넓은 범위를 연구 할 수 있도록, 막 곡률과 조성이 막에 단백질 모집에 영향을 미칠 수있는 방법의 새로운 발견을 촉진^4,11,12. 단일 리포솜 분석에 의한 또 다른 분야는 단백질 매개 막^{융합13,14의}기계적 연구에 있다. 이러한 운동 측정의 경우 개별 융합 이벤트를 연구하는 능력은 융합 프로세스의 실험 적 동기화의 필요성을 완화하여 대량 앙상블 측정에서 수행되는 주공간 평균화에서 손실되었을 새로운 기계적 통찰력을 허용했습니다. 추가적으로, 단 하나 리포솜은 개별 적인 단백질의 측정을 허용하고 막 단백질 구조 역학^15,16에새로운 지식을 제안하는 막 스캐폴드로 이용되었습니다. 더욱이, 이러한 프로테올리포좀 기반 설정은 개별 막 트랜스멤브레인^{수송기(17)} 및 모공 형성 단백질^{복합체(18)의} 기능뿐만 아니라 생리활성막-투과펩타이드(19)의 기전을 연구하는 것을 가능하게 하였다. 단일 리포솜은 또한^10-19 L의 부피에서 효소 반응을 위한 챔버로서 사용되는 표면 고정된 단일 리포솜을 가진 연질 나노유체학으로서 사용되어 왔으며, 최소한의 제품^소비로스크리닝 검거및 복잡성을 증가시키고 있다.

최근, 단일 리포솜 검사에서는 이전에 는 미리 정연하지 않은 수준의 세부 사항에서 약물 전달 리포좀을 특성화하는 데 사용되었습니다. 연구자들은 개별^{리포좀(21)의}표면에 부착된 중합체의 양에서 유의한 불균질성을 정량화할 수 있었다. 단일 리포좀 검사는 또한 혈장과 같은 복합 매체에서 약물 전달 리포좀의 측정을 허용하고, 지질 앵커를 통해 리포좀 표면에 고정된 원소가 생체 내 순환 중에 경험한 조건을 모방하는 조건에 노출될 때 해리에 취약할 수 있는 방법을^{밝혀냅니다 22.} 전반적으로, 단일 리포솜 assays의 다양성과 유용성은 이 설치가 해결하기 위하여 채택된 문제의 큰 다양성에 의해 입증되고, 우리는 방법론이 새로운 과학적인 필드에서 계속 개발되고 사용을 찾아내려고 구상합니다.

여기에서 우리는 개별 리포솜이 높은 처리량 방식으로 공부될 수 있도록 하는 형광 현미경 계 단 하나 리포좀 분석법을 기술합니다(그림 1). 이 방법을 설명하기 위해, 우리는 앙상블 내에서 개별 리포좀 사이의 크기와 조성 불균질성을 정량화하는 데 사용합니다. 이 분석은 통과 유리 표면에 고정된 단일 리포좀의 형광 현미경 이미징을 사용합니다. 우리는 먼저 적절한 형광 리포솜 라벨링 및 고정을 보장하는 리포솜 제조 공정의 중요한 단계를 설명합니다. 그런 다음, 적절한 리포솜 표면 밀도를 보장하기 위한 절차를 개략적으로 설명하기 전에 리포솜 고정을 용이하게 하는 데 필요한 표면 준비를 설명합니다. 우리는 고품질의 이미지를 획득하는 데 중요한 현미경 매개 변수에 대해 논의하고 간단한 데이터 분석을 수행하는 방법을 설명하여 리포솜 크기와 조성 불균질성을 추출 할 수 있습니다. 이 일반적인 프로토콜은 관심 있는 연구원이 그 또는 그녀의 특정 연구 관심사를 위한 분석학을 더 개발하기 위한 좋은 기초를 제공해야 합니다.

프로토콜

1. 리포솜 준비

참고 : 간단히, 리포솜의 준비는 일반적으로 세 가지 중요한 단계를 포함 : 1) 원하는 지질 조성물의 건조 지질 필름의 준비; 2) 리포좀 형성을위한 지질의 재수화; 및 3) 리포좀 인구의 크기와 라멜라성을 조절한다.

1. 지질을 측정하고 테르-부탄올:물(9:1)에 유리 병에 녹입니다.
   1. 용해 POPC (1-팔미토일-2-올레오일 글리세로-3-포스포콜린; MW = 760 g/mol) ~ 50mM.
   2. 콜레스테롤(MW = 387 g/mol)을 25mMM으로 용해시면 됩니다.
   3. 용해 도피-Atto488 (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-Atto488; MW = 1,316 g/mol) ~ 0.1 mM.
   4. 용해 도피-Atto655 (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-Atto655; MW = 1,368 g/mol) ~ 0.1 mM.
   5. 용해 DSPE-PEG2000-비오틴 (1,2-디스테릴-스니케로-글리세로-3-포스페이타놀라민-N-[바이오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; MW = 3,017 g/mol) ~ 0.1mM.
      참고: 지질을 55°C로 가열하고 자기 교반을 사용하여 지질의 완전한 용해를 보장합니다. 또는 초음파 처리 욕을 사용하십시오. 사용되지 않은 지질 스톡은 -20°C에서 몇 개월 동안 보관될 수 있다.
2. 1.1단계에서 준비된 지질 주식을 POPC:콜레스테롤:콜레스테롤:도페-아토488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-비오틴 68.95:30:0.5:0.5:0.05, POPC 138 μL, 콜레스테롤 120 μL, 형광으로 표지된 각 지질 500μL, 및 50 μL DSPE-PEG-비오틴을 신선한 유리 병으로.
   참고 : 정확한 리포솜 조성물은 관심있는 특정 질문을 해결하기 위해 쉽게 수정 할 수 있습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
3. 유리 병의 뚜껑을 풀고 액체 질소로 바이알을 스냅 동결시됩니다.
4. 하룻밤 동안 냉동 지질 혼합물을 동결 유구화.
5. 건조 지질에 200 mM D-소르비톨 완충제 (소르비톨 완충제)의 1 mL을 추가합니다.
6. 혼합물을 45°C로 가열하고 적어도 1시간 동안 자기 교반에 노출시다.
   참고: 완충제는 해결되고 있는 특정 질문(예를 들면, 막 단백질 상호 작용을 공부하기 위한 생리적 조건, 또는 약물 전달 리포좀을 공부하기 위한 특정 임상적으로 승인된 완충제)를 반영해야 한다. 그러나, 특정 완충액이 연구에 필요하지 않은 경우, 리포솜의 다층성도를 감소시키기 위해 이온이 없는 버퍼를 재수화시키기 위해 적용될 수 있다.
7. 액체 질소에 바이알을 찍어 지질 현탁액을 동결하고 현탁액이 완전히 동결 될 때까지 기다립니다.
8. 혼합물이 완전히 해동 될 때까지 55 °C에서 가열 욕조에 냉동 현탁액을 담급니다.
9. 리포솜 현탁액이 총 11회 동결/해동 주기에 노출될 때까지 1.7 단계와 1.8단계를 반복합니다.
   참고: 반복된 동결/해동 주기는 리포솜 다과체 분석의 정확도에 가장 중요한 리포솜^{다과멜화(23)를}감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 다층계 리포솜이 리포좀의 형광 강도대 리포솜 크기 비율을 왜곡하기 때문에 가장 중요합니다. 다층부미성은 일반적으로 제형에서 0.5% 이상의 PEGylated 지질을 포함할 때 본질적으로 낮다(예: 약물 전달을 위한 리포좀에서 통상적으로 행함)(예컨대 약물 전달을 위한 리포좀에서^행함).24.
10. 미니 압출 키트를 사용하여 800 nm 폴리 카보네이트 필터를 통해 리포솜 현탁액을 한 번 압출합니다. 압출 키트 조립에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오(재료 표참조).
11. 리포솜을 밤새 4°C에 보관합니다.

2. 이미징 챔버의 표면 준비

1. 소 혈청 알부민을 준비 (BSA; 1 mg / mL), BSA-비오틴 (1 mg / mL) 및 스트렙타비딘 (0.025 mg / mL) 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-피페라진에탄에설포닉산 95 mMCl NaPes (완충액).
   참고: 리포좀 파열을 방지하기 위해, 재수화에 사용되는 소르비톨 버퍼와 표면 준비에 사용되는 HEPES 버퍼는 동위원소여야 합니다. 따라서 실험 전에 버퍼의 삼투압을 확인하는 것이 좋습니다.
2. BSA 1,200 μL과 BSA-비오틴 120 μL을 혼합하고 현미경 검사법용 8 개의 잘 슬라이드에 혼합물의 300 μL을 각각 잘 추가하십시오.
   참고 : 여기에서 우리는 유리 바닥 (재료 표참조)이있는 시판 되는 8 개의 잘 현미경 슬라이드를 사용하지만 프로토콜은 맞춤형 현미경 챔버에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
3. 실온(RT)에서 20분 동안 슬라이드를 인큐베이팅합니다.
4. HEPES 버퍼 300 μL로 슬라이드를 8x 세척합니다.
   참고: 표면을 건조하면 손상될 수 있으므로 몇 초 이상 버퍼없이 우물을 방치하지 않도록 주의하십시오. 또한 파이펫 팁으로 표면이 긁히지 않도록 주의하십시오. 따라서 우물에서 버퍼를 흡입 할 때 가장자리 또는 모서리에서 수행하십시오.
5. 스트렙타비딘 250 μL을 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
6. 2.4단계에서 설명한 8개의 세차서를 반복한다.
7. 현미경 슬라이드를 300 μL의 소르비톨 완충액으로 각 우물에서 4°C로 저장합니다. 용매의 증발은 표면을 손상시킬 수 있으므로 현미경 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 준비된 슬라이드를 즉시 사용하지 않는 한 파라필름으로 밀봉하십시오.

3. 리포솜 고정

1. 리포좀 현탁액을 소르비톨 완충액에서 약 20 μM 총 지질로 희석한다. 섹션 1의 절차는 약 10 mM 총 지질의 리포좀 현탁액을 산출할 것이다.
2. 슬라이드를 현미경에 놓고 유리/버퍼 인터페이스에서 증가된 레이저 반사 신호를 사용하여 챔버 표면에 초점을 맞춥니다.
3. 신선한 HEPES 완충액300 μL로 챔버를 4x 세척합니다.
4. 희석된 리포솜 스톡 10 μL(총 지질 20 μM)을 미세원원지 튜브에 넣습니다.
5. 챔버에서 완충액 100 μL을 꺼내, 3.4 단계에서 제조 된 미세 원심 분리튜브에 추가하고, 적절하게 혼합하고, 110 μL을 챔버에 다시 넣습니다.
6. 현미경의 밑에 표본을 놓고, 표면에 고정되는 리포좀을 관찰하기 위하여 리포좀 불소에서 신호를 검출할 수 있는 기초현미경 설정을 이용하십시오.
7. 개별 리포좀을 식별하기에 충분히 희소하고 높은 처리량 측정을 용이하게 할 만큼 조밀한 리포솜 표면 밀도를 목표로 합니다. 전형적으로 50 μm x 50 μm 시야각을 사용하여, 프레임당 300-400 리포솜이 최적이다(도2). 이것은 일반적으로 5-10 분 이내에 달성 될 수있다.
   참고: 시야에서 빠르게 움직이는 형광 입자만 검출되는 경우, 고정 공정에 중요한 성분(BSA-비오틴, 스트렙타비딘, DOPE-PEG-비오틴)의 부재 또는 너무 낮은 농도가 원인일 수 있습니다. 리포좀이 검출되지 않으면 낮은 리포좀 농도, 형광 검출을 위한 부적절한 설정 또는 유리 표면에 없는 초점 평면으로 이미징할 수 있습니다.
8. 적절한 리포솜 표면 밀도에 도달하면 200 μL의 HEPES 버퍼로 챔버를 3x 세척하십시오.
   참고: 고정 운동학은 크기 및 전하와 같은 리포좀 특성에 따라 달라지므로 항상 각 리포좀 제형에 최적화되어야 합니다.

4. 이미지 획득

참고: 이 섹션은 실험을 수행하는 연구원이 사용할 수 있는 현미경 시스템에 많이 의존할 것입니다. 따라서, 이미징을 수행하는 방법에 대한 전반적인 가이드라인이 설명될 것이다. 그러나 정확한 설정과 적용 방법은 현미경 설정마다 다릅니다. 예를 들어, 일부 시스템은 원하는 방출 필터 조합을 선택할 수 있으며, 다른 현미경에는 특정 사전 설정 필터가 장착되어 있습니다.

1. 단일 리포솜 이미징을 위한 현미경을 설치합니다. 최적의 이미지 품질과 후속 데이터 분석을 보장하기 위해 높은 그레이스케일 해상도와 개별 리포좀을 오버샘플링할 수 있는 픽셀 구성표를 사용합니다. 50 μm x 50 μm 영역에 대해 16 픽셀 및 최소 1,024 x 1,024 픽셀의 비트 깊이가 권장됩니다. 사용 가능한 경우 노이즈를 줄이기 위해 라인 평균을 유익하게 적용할 수 있습니다(예: 라인당 3회 스캔).
2. 중요하지 않은 프레임 대 프레임 표백과 배경에서 개별 리포좀을 명확하게 구별할 수 있는 강력한 신호를 보장하는 여기 레이저 파워를 선택합니다. 최적의 설정은 사용되는 특정 현미경뿐만 아니라 형광공 조합에 따라 달라집니다. 이 편향 강도 정량화로 인해 검출기가 포화되지 않았는지 확인합니다.
3. 리포좀에 있는 DOPE-Atto488 및 DOPE-Atto655 불소 둘 다 화상 진찰은 다중 채널을 화상 진찰을 요구합니다. 따라서 교차 여기를 피하기 위해 각 채널이 순차적으로 이미지화되어 있는지 확인합니다. 예를 들어, 먼저 488 nm에서 흥미 진진하고 495-560 nm에서 방출을 읽음으로써 하나의 이미지를 가져 가라. 그 후, 633 nm에서 흥미 진진한하지만 660-710 nm에서 만 방출을 읽고 다른 이미지를 가져 가라. 특이사항은 사용 가능한 현미경 시스템(예: 레이저 및 필터)에 따라 달라집니다.
4. 표면의 다른 영역을 커버해야, 샘플의 적어도 10 이미지를 획득, 따라서 적어도 이미징 3,000 개별 리포좀. 표면 밀도가 리포솜/프레임 300보다 낮으면 더 많은 이미지를 수집합니다. 모든 새 이미지에 대해 현미경을 다시 초점을 맞춥니다.
   참고: 2채널 이미징의 경우 데이터 분석 중에 서로 다른 형광 채널에서 동일한 리포솜을 가진 이미지 쌍을 쉽게 식별할 수 있도록 이미지 파일의 이름을 지정해야 합니다.
5. 조성 불균질성의 측정과 관련된 실험적 불확도를 정량화하기 위해, 재초점 전후에 리포솜의 동일한 영역을 이미지화한다(도 3 및 텍스트의 설명 참조).
6. 현미경 소프트웨어에서 이미지를 .tiff 파일로 내보냅니다. 동일한 리포솜의 두 채널을 개별적으로 내보냅니다.

5. 데이터 분석

참고 : 특별히 개발 된 자동화 된 2D 가우시안 피팅 루틴은 이전에^6,11,12를사용했습니다. 그러나, 방법의 적용가능성을 높이기 위해 모든 실험실에서 용이하게 구현될 수 있는 데이터 분석 과정이 설명되어 있다.

1. 동일한 이미징 필드에 있는 두 개의 서로 다른 형광 채널의 .tiff 이미지 쌍을 FIJI(FIJI는 ImageJ) 소프트웨어에 로드합니다.
2. 이미지 메뉴에서 색상을선택하고 채널 병합 기능을 사용하여 두 채널의 합성을 만듭니다.
3. 두 개의 서로 다른 채널에서 이미지된 리포좀이 양호한 동지역화를 표시하는지 또는 눈에 보이는 드리프트가 발생했는지 관찰합니다.
   참고 : 두 형광 채널 사이의 드리프트의 경우 (두 채널의 신호 사이의 체계적이고 동등한 X-Y 오프셋으로 인식), 프레임 중 하나는 피지의 이미지 메뉴에서 변환 > 번역 기능을 사용하여 변환 할 수 있습니다. 그러나 이러한 이미지 조작에는 주의를 기울여야 합니다. 따라서 리포좀을 이미징할 때 가능한 한 많이 표류하지 않는 것이 좋습니다.
4. ComDet 플러그인(v.0.3.6.1 이상)이 설치되어 있는지 확인하거나 플러그인 메뉴에서 이 작업을 수행하십시오.
5. ComDet 플러그인을 열어 플러그인 메뉴로 이동하여 ComDet v.0.3.6.1 > 파티클 감지를선택하여 파티클을 감지합니다.
6. ComDet에서 두 채널에서 파티클 감지를 개별적으로 선택해야 합니다. 공동 지역화된 점 사이의 최대 거리를 대략적인 입자 크기와유사하게 설정합니다. 일반적으로 여기에 설명된 설정에 4픽셀이 적합합니다.
7. 신호 대 잡음 비는 형광량이 적은 희미한 입자도 감지할 수 있어야 합니다. ComDet에서 두 채널의 감지 감도를 매우 희미한 입자(SNR = 3)로설정하여 이 비율을 3으로 설정합니다.
   참고: 이 SNR 값은 일반적으로 적절하지만 더 높게 설정해야 할 수 있습니다(예: 리포솜으로 식별되고 거짓 긍정으로 이어질 수 있는 이미지 노이즈가 많은 경우).
8. 확인을누르기 전에 두 채널에서 양방향 으로 계산되고 감지된 파티클계산이 있는 상자가 선택되어 있는지 확인합니다.
9. 분석을 실행하면 결과 및 요약이 있는 두 개의 팝업 창이 표시됩니다. 데이터를 내보내면 .txt 파일로 테이블을 저장하고 소프트웨어로 가져와서 선택한 데이터 처리 소프트웨어로 공동 지역화 데이터(파티클 좌표 및 감지된 각 파티클의 통합 강도)가 포함된 결과입니다.
10. 각 리포솜이 데이터 세트에 한 번만 포함되어 있고 채널1/channel2와 channel2/channel1 비율이 모두 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 따라서 Abs_frame = 1만 단계 5.11에 플롯되도록 데이터를 필터링합니다.
    참고 : 공동 지역화 = 1을선택하면 이미지의 노이즈에서 거짓 긍정을 분석에서 제거 할 수 있습니다. 그러나 두 개의 형광 성분 중 하나만 있는 리포좀도 분석에서 제외되므로 분석에서 중요한 데이터 요소를 잠재적으로 제거할 수 있습니다.
11. 감지된 각 리포솜에 대한 강도 비율을 포함하는 데이터로 열의 히스토그램을 플로팅합니다.
12. 연구된 리포좀 시스템에 대한 조성 불균질의 정도는 강도 비 분포의 폭으로 나타낸다. 불균질성을 정량화하기 위해, 강도 비율 히스토그램을 가우시안 함수에 맞추고 평균(μ) 및 표준 편차(sigma)를 추출한다. 대표 결과 섹션을 참조하십시오.
13. 불균질성(DI)에 대한 값은 이제 DI= 시그마/μ로 정의된 변동계수를 사용하여 계산할 수 있습니다.

6. 리포솜 크기 교정

1. 리포솜 스톡의 일부를 꺼내, 단계 1.10에 기재된 바와 같이 50 nm 폴리카보네이트 필터를 통해 21x를 압출한다.
2. 미세원심지 튜브에 800 μL의 소르비톨 완충액에 리포솜 현탁액의 10 μL을 첨가하여 리포좀을 희석시다.
3. 희석된 리포솜 샘플을 폴리프로필렌 일회용 큐벳으로 옮김.
4. 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 크기를 측정합니다. 리포솜 현탁액의 크기와 다분산성을 측정하기 위해 적어도 3개의 독립적인 실행을 수행한다.
   참고: 필요한 경우 측정을 위해 더 농축된 리포솜 현탁액을 사용하십시오. DLS에 대한 대안(예를 들어, 나노입자 추적 분석)은 리포좀의 크기를 측정하기 위해 적용될 수도 있다. 이러한 입자 크기 측정을 실행하는 방법에 대한 설명은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다.
5. 4.1 단계 와 4.2 단계에서 정의된 것과 정확히 동일한 실험 설정을 사용하여 현미경의 교정 리포솜을 이미지화합니다.
6. 캘리브레이션 이미지에서 각 교정 리포솜에 대한 통합 강도를 추출합니다: 단계 5.1-5.10에 기재된 바와 같이 리포솜 형광 강도를 포함하는 여과된 결과 시트를 추출합니다. 결과 테이블에서 "통합Int" 열을 추출합니다.
7. 그 막에 표지된 리포좀의 총 통합 강도는 리포솜의 표면적에 비례하기 때문에, 직경의 제곱에 비례하기 때문에, 형광 강도의 제곱근 강도 히스토그램을 플롯 교정 리포좀.
8. 6.7단계에서 생성된 일체형 히스토그램에 적당히 로그 정규 분포를 맞추고 캘리브레이션 리포좀의 평균 형광 강도를 추출한다.
9. 제곱근 강도(Int_Sqrt)와리포솜 크기 사이의 관계를 결정하기 위해, DLS 측정으로부터 얻어진 수에 의해 칭량된 평균 리포솜 직경(Dia)을 사용하여 보정 계수(C)를 계산한다: Dia = C x Int_Sqrt는 C= Dia/Int_Sqrt와동일하다.
10. 조성 불균질 성 실험에서 리포솜에 대한 Int_Sqrt 값을 계산하고 보정 계수를 곱하여 이를 직경으로 변환합니다.
11. 약 50 nm-800 nm에서 에 걸쳐 리포솜의 인구에 대한 리포솜 크기의 함수로서 불균질성을 달성, 조성 불균질 리포좀에 대한 직경의 함수로 강도 비 값을 플롯.

결과

기재된 프로토콜에 따라 단일 리포솜을 대규모 병렬 방식으로 이미지화할 수 있게한다(도 1). 리포좀의 성공적인 표면 고정은 회절 제한된 강도 반점이 이미지에 나타나야함에 따라 챔버(프로토콜에서 3.6단계)에 리포좀 용액을 첨가한 즉시 명백해야한다(도 1B 및 도 1C).

토론

우리는 단일 리포솜 분석이 개별 리포좀 사이의 조성 불균질성을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하지만 플랫폼은 매우 다재다능하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이전에 소개에서 도시되고 논의된 바와 같이, 프로토콜은 막-막 융합, 단백질 막 상호 작용, 또는 리포좀 약물 담체 특성화의 양상을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 해결되는 모든 과학적 질문에 대?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ