Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Resumo

A maioria das pesquisas que empregam lipossomas como sistemas de modelo de membrana ou portadores de entrega de drogas depende de técnicas de leitura em massa e, portanto, assume intrinsecamente todos os lipossomas do conjunto para ser idêntico. No entanto, novas plataformas experimentais capazes de observar lipossomos no nível de partículaúnica tornaram possível realizar estudos altamente sofisticados e quantitativos sobre interações de membrana proteica ou propriedades de portadores de drogas em lipossomos individuais, evitando assim erros da média do ensemble. Aqui apresentamos um protocolo para preparar, detectar e analisar lipossomos individuais usando um ensaio microscopia à base de fluorescência, facilitando tais medições de partículas únicas. A configuração permite a imagem de lipossomos individuais de forma paralela maciça e é empregada para revelar o tamanho intra-amostral e inhomogeneidades composicionais. Além disso, o protocolo descreve as vantagens de estudar lipossomas no nível único de lipossoma, as limitações do ensaio e as características importantes a serem consideradas ao modificá-lo para estudar outras questões de pesquisa.

Introdução

Os lipossomas são vesículas à base de fosfolípido esféricas que são fortemente utilizadas tanto na pesquisa básica quanto aplicada. Funcionam como sistemas excelentes do modelo da membrana, porque suas propriedades physiochemical podem facilmente ser manipuladas variando os componentes lipídicos que compõem o liposome^1,2. Além disso, os lipossomas constituem o sistema de nanocarrier de entrega de medicamentos mais utilizado, oferecendo farmacocinética melhorada e farmacodinâmica, bem como alta biocompatibilidade³.

Por muitos anos, os lipossomas têm sido estudados principalmente usando técnicas a granel, dando apenas acesso a valores médios de leitura do conjunto. Isso levou a maioria desses estudos a assumir que todos os lipossomas do conjunto são idênticos. No entanto, esses valores medianos pelo conjunto só estão corretos se o conjunto de dados subjacente for distribuído uniformemente em torno do valor médio, mas pode representar uma conclusão falsa e tendenciosa se o conjunto de dados incluir várias populações independentes, por exemplo. Além disso, assumindo que o conjunto significa representar toda a população pode ignorar as informações abrigadas dentro da inhomogeneidade entre os lipossomas. Só recentemente surgiram ensaios quantitativos que são capazes de sondar lipossomos individuais, revelando grandes inhomogeneidades entre os lipossomos individuais no que diz respeito a importantes propriedades fisicoquímicas, incluindo o tamanho lipossoma^4,composição lipídica^5,6, e eficiência de encapsulamento⁷, destacando a importância de estudar liosomos no nível lipossoma único.

Uma área de pesquisa onde a média do conjunto de propriedades lipossoma tem sido mostrado para os resultados viés está estudando lipossoma tamanho dependente de interações de membrana de proteína^8,9. Tradicionalmente, os pesquisadores que estudam tais processos têm sido restritos a preparar lipossomas com diferentes diâmetros médios conjunto por extrusão através de filtros com diferentes tamanhos de poros⁹. No entanto, extrair o diâmetro dos lipossomos individuais usando ensaios lipososos únicos revelou grandes sobreposições populacionais, com lipossomos extrudados usando filtros de 100 nm e 200 nm exibindo até 70% de sobreposição em sua distribuição de tamanho⁴. Isso poderia influenciar severamente as medições em massa de interações de membrana de proteína dependentes do tamanho dos lipososos^10. Realizando os estudos de interação membrana-proteína usando o único ensaio lipossoma, os pesquisadores aproveitaram a polidispersão de tamanho dentro da amostra, permitindo-lhes estudar uma ampla gama de diâmetros lilíticos dentro de cada experimento, facilitando novas descobertas de como a curvatura e a composição da membrana podem afetar o recrutamento de proteínas nas membranas^4,11,12. Outro campo onde a aplicação de ensaios lipososos únicos tem provado instrumental está em estudos mecanicistas de fusão de membrana mediada por^{proteínas 13,14}. Para tais medições cinéticas, a capacidade de estudar eventos de fusão individuais aliviou a necessidade de sincronização experimental do processo de fusão, permitindo novos insights mecanicistas que de outra forma teriam sido perdidos na média spatiotemporal feita em medições de conjuntos a granel. Além disso, os lipossomos individuais têm sido utilizados como andaime de membrana, permitindo a medição de proteínas individuais e oferecendo novos conhecimentos sobre a dinâmica estrutural da proteína transmembrana^15,16. Além disso, tais configurações à base de proteolipossoma tornaram possível estudar a função dos transportadores transmembranaindividuais¹⁷ e complexos proteicos formadores de poros^18, bem como o mecanismo de peptídeos bioativos de membrana permeabilizante¹⁹. Os únicos lipossomos também têm sido usados como nanofluídicos de matéria macia com lipossomos únicos imobilizados pela superfície servindo como câmaras para reações enzimáticas em volumes de^10-19 L, aumentando a fonte e a complexidade dos ensaios de triagem com consumo mínimo de produtos²⁰.

Recentemente, os únicos ensaios lipossoma foram usados caracterizando lipossomos da entrega da droga em um nível previamente unprecendented de detalhe. Os pesquisadores foram capazes de quantificar inhomogeneidades significativas na quantidade de polímero ligado à superfície dos lipossomos individuais²¹. Os únicos ensaios lipossoma também permitiram medições de lipossomos de entrega de drogas em mídias complexas, como plasma sanguíneo, revelando como elementos ancorados à superfície lipossoma através de âncoras lipídicas podem ser suscetíveis à dissociação quando os lipossomas são expostos a condições que imitam aqueles experimentados durante a circulação vivo²². No geral, a versatilidade e utilidade dos únicos ensaios liúlio são fundamentados pela grande variedade de problemas que essas configurações foram empregadas para resolver, e prevemos que a metodologia continuará a ser desenvolvida e encontrará uso em novos campos científicos.

Aqui descrevemos um ensaio liposcoso único baseado em microscopia de fluorescência que permite que os lipossomas individuais sejam estudados de forma de alta despersistência (Figura 1). Para ilustrar o método, nós o usamos para quantificar o tamanho e a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais dentro de um conjunto. O ensaio emprega imagens de microscópio de fluorescência de lipossomos únicos imobilizados em uma superfície de vidro passivado. Primeiro descrevemos os passos críticos no processo de fabricação de lipossoma que garante rotulagem e imobilização de liposos fluorescentes adequadas. Em seguida, descrevemos a preparação superficial necessária para facilitar a imobilização dos lipossoma antes de delinear o procedimento para garantir densidades de superfície lipossoma apropriadas. Discutimos os parâmetros de microscopia importantes para a aquisição de imagens de alta qualidade e delineamos como realizar análises de dados simples, permitindo a extração de tamanho lilímico e inhomogeneidade composicional. Este protocolo genérico deve fornecer uma boa base para o pesquisador interessado para desenvolver o ensaio ainda mais para o seu interesse de pesquisa específico.

Protocolo

1. Preparação para Lipossoma

NOTA: Brevemente, a preparação de lipossomas geralmente inclui três etapas cruciais: 1) preparação de filmes lipídicos secos da composição lipídica desejada; 2) reidratação dos lipídios para formação de lipossomas; e 3) controlar o tamanho e a lamellaridade da população de lipossomas.

1. Pesar os lipídios e dissolvê-los em tert-butanol:água (9:1) em frascos de vidro.
   1. Dissolva POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolina; MW = 760 g/mol) a 50 mM.
   2. Dissolva o colesterol (MW = 387 g/mol) a 25 mM.
   3. Dissolva DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-Atto488; MW = 1.316 g/mol) a 0,1 mM.
   4. Dissolva DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-Atto655; MW = 1.368 g/mol) a 0,1 mM.
   5. Dissolver DSPE-PEG2000-biotina (1,2-distearyl-sn-glycero-3-fosphatetanolamina-N-[biotinyl (polietileno glicol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) a 0,1 mM.
      NOTA: Lipídios térmicos a 55 °C e usar agitação magnética, a fim de garantir a dissolução completa dos lipídios. Alternativamente, use um banho de sonication. Os estoques lipídicos não utilizados podem ser armazenados a -20 °C por vários meses.
2. Misture os estoques lipídicos preparados na etapa 1.1 para uma proporção molar de POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotina 68.95:30:0.5:0.0.0.05, adicionando 138 μL de POPC, 120 μL de colesterol, 500 μL de cada lipídio selada fluorescente, e 50 μL de DSPE-PEG-biotina a um frasco de vidro fresco.
   NOTA: A composição lipossoma exata pode ser facilmente modificada, a fim de abordar a questão específica de interesse. Veja a discussão para mais detalhes.
3. Solte a tampa do frasco de vidro, e snap-congelar o frasco em nitrogênio líquido.
4. Lyofilize a mistura lipídica congelada durante a noite.
5. Adicione 1 mL de 200 mM D-sorbitol buffer (tampão sorbitol) para os lipídios secos.
6. Aqueça a mistura a 45 °C e expor a agitação magnética por pelo menos 1 h.
   NOTA: O amortecedor deve refletir a questão específica que está sendo abordada (por exemplo, condições fisiológicas para estudar interações membrana-proteína, ou um amortecedor específico clinicamente aprovado para estudar lipossomos de entrega de drogas). No entanto, se um amortecedor específico não é necessário para o estudo, um amortecedor sem íons pode ser aplicado para reidratação, a fim de reduzir a multilamellaridade dos lipossomasmas.
7. Congele a suspensão lipídica mergulhando o frasco em nitrogênio líquido, e espere até que a suspensão esteja completamente congelada.
8. Mergulhe a suspensão congelada em um banho de aquecimento a 55 °C até que a mistura esteja completamente descongelada.
9. Repita os passos 1.7 e 1.8 até que a suspensão de lipossoma tenha sido exposta a um total de 11 ciclos de congelamento/degelo.
   NOTA: Ciclos repetidos de congelamento/degelo têm mostrado para reduzir a multilammellaridade lipossoma^23,que é fundamental para a precisão do único ensaio lisonlímico, já que os lipossomas multilamelais distorcerão a intensidade da fluorescência versus a relação do tamanho dos lipososos. A multilamellaridade é geralmente inerentemente baixa quando incluindo mais de 0,5% lipídio sielido na formulação (como comumente feito em lipossomas para entrega de drogas)²⁴.
10. Extruda a suspensão lipossoma uma vez através de um filtro de policarbonato de 800 nm usando um mini kit de extrusão. Siga as instruções do fabricante para montagem do kit de extrusão (ver Tabela de Materiais).
11. Guarde os lipossomas a 4 °C durante a noite.

2. Preparação de superfície da câmara de imagem

1. Prepare albumina de soro bovina (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotina (1 mg/mL) e streptavidin (0,025 mg/mL) em 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperaezineethanesulfonic ácido) 95 mM NaCl buffer (tampão HEPES).
   NOTA: Para evitar a explosão lipossômica, o tampão de sorbitol usado para reidratação e o tampão HEPES usado para preparação de superfície devem ser isotônicos. Recomenda-se, portanto, verificar a osmolaridade dos buffers antes do experimento.
2. Misture 1.200 μL de BSA e 120 μL de BSA-biotina e adicione 300 μL da mistura a cada poço em um slide de 8 poços para microscopia.
   NOTA: Aqui usamos um slide de microscópio de 8 poços comercialmente disponível com um fundo de vidro (ver Tabela de Materiais),mas o protocolo pode ser facilmente adaptado a câmaras de microscópio personalizadas.
3. Incubar o slide por 20 min à temperatura ambiente (RT).
4. Lave o slide 8x com 300 μL de tampão HEPES.
   NOTA: Tenha cuidado para não deixar os poços sem buffer por mais de alguns segundos, como secar a superfície irá danificá-lo. Além disso, tome cuidado para não arranhar a superfície com a ponta da pipeta, pois isso também irá danificá-lo. Assim, ao aspirar buffer de um poço, fazê-lo a partir da borda ou canto.
5. Adicione 250 μL de streptavidin a incubação por 10 min na RT.
6. Repita as 8 laviras descritas no passo 2.4.
7. Guarde o slide do microscópio com 300 μL de tampão sorbitol em cada poço a 4 °C. Evaporação do solvente irá danificar a superfície, para colocar o microscópio slide em uma placa de Petri e selá-lo com parafilme, a menos que o slide preparado é usado imediatamente.

3. Imobilização de lipososos

1. Diluir a suspensão lipossoma para cerca de 20 μM lipídio total no tampão sorbitol. O procedimento na seção 1 produzirá uma suspensão liposoma de aproximadamente 10 mM lipídio total.
2. Coloque o slide no microscópio e concentre-se na superfície da câmara usando o sinal de reflexão a laser aumentado da interface de vidro/tampão como um guia.
3. Lave a câmara 4x com 300 μL de tampão HEPES fresco.
4. Adicione 10 μL de estoque lipososoma diluído (20 μM lipídio total) a um tubo de microcentrífuga.
5. Retire 100 μL de buffer da câmara, adicione ao tubo de microcentrífuga preparado no passo 3.4, misture corretamente e coloque o 110 μL de volta à câmara.
6. Coloque o espécime o microscópio, e use uma configuração de microscópio rudimental capaz de detectar sinal do fluorofforre liossoma (s) para observar os lipossomas sendo imobilizados na superfície.
7. Apontar para uma densidade de superfície lipossoma que é simultaneamente escassa o suficiente para identificar os lipossomas individuais e densa o suficiente para que facilite as medições de alta produtividade. Normalmente usando um campo de visão de 50 μm x 50 μm, 300 a 400 lipossomos por quadro é ideal(Figura 2). Isso geralmente pode ser alcançado dentro de 5 a 10 minutos.
   NOTA: Se apenas partículas fluorescentes em movimento rápido forem detectadas no campo de visão, uma ausência ou baixa concentração de qualquer um dos componentes críticos para o processo de imobilização (BSA-biotina, streptavidina, DOPE-PEG-biotina) pode ser a causa. Se não forem detectados lipossomos, pode estar relacionado a uma baixa concentração de lipossomas, configurações impróprias para a detecção de fluorescência ou, potencialmente, imagens com um plano focal que não está na superfície de vidro.
8. Uma vez que uma densidade de superfície lipossoma apropriada é alcançada, lave a câmara 3x com 200 μL do amortecedor de HEPES.
   NOTA: Esteja ciente de que a cinética imobilização também dependem de propriedades lipomas, como tamanho e carga e, portanto, devem ser sempre otimizadas para cada formulação de lipossoma.

4. Aquisição de imagem

NOTA: Esta seção dependerá muito do sistema do microscópio disponível ao investigador que executa a experiência. Assim, serão descritas diretrizes gerais sobre como realizar a imagem. No entanto, as configurações exatas e como aplicá-las variarão entre as diferentes configurações de microscópio. Por exemplo, alguns sistemas permitem escolher qualquer combinação de filtro de emissão desejada, enquanto outros microscópios são equipados com filtros específicos e predefinidos.

1. Configure o microscópio para imagens de lipossomos individuais. Para garantir a qualidade ideal da imagem e a análise de dados subsequente, use uma alta resolução em escala de cinza e um esquema de pixels que permite a superamostragem de lipossomos individuais. Um pouco de profundidade de 16 e pelo menos 1.024 x 1.024 pixels para uma área de 50 μm x 50 μm é recomendado. Se disponível, a média da linha pode ser aplicada de forma benéfica para reduzir o ruído (por exemplo, 3 varreduras por linha).
2. Selecione um poder a laser de excitação que tanto garante branqueamento quadro-a-quadro não significativo e sinal forte o suficiente para discriminar claramente os lipossomas individuais a partir do fundo. A configuração ideal dependerá do microscópio específico usado, bem como a combinação de fluorofofóbico. Certifique-se de que os detectores não estão saturados, pois isso irá viés quantificação intensidade.
3. A imagem de imagem dos fluoroforreos DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 nos lipossomas requer imagens de múltiplos canais. Assim, certifique-se de cada canal é imagem sequencialmente para evitar a excitação cruzada. Por exemplo, primeiro pegue uma imagem emocionante em 488 nm e leitura de emissão de 495-560 nm. Depois disso, pegue outra imagem emocionante em 633 nm, mas lendo a emissão apenas em 660-710 nm. As especificidades dependerão do sistema de microscópio (por exemplo, que lasers e filtros) disponíveis.
4. Certifique-se de cobrir diferentes áreas da superfície, adquirindo pelo menos 10 imagens da amostra, assim, imagens de pelo menos 3.000 lipossomas individuais. Se a densidade da superfície for inferior a 300 lipossomas/quadro, adquira mais imagens. Certifique-se de reorientar o microscópio para cada nova imagem.
   NOTA: Para imagens de dois canais, certifique-se de nomear os arquivos de imagem para que pares de imagens com os mesmos lipossomos em diferentes canais de fluorescência possam ser facilmente identificados durante a análise de dados.
5. A fim de quantificar a incerteza experimental relativa à medição da inhomogeneidade composicional, imagem a mesma área de lipossomos antes e depois de reorientar (ver Figura 3 e descrição no texto).
6. Exportar as imagens do software do microscópio como arquivos .tiff. Exportar os dois canais dos mesmos lipossomas individualmente.

5. Análise de dados

NOTA: Especialmente desenvolvidas rotinas automatizadas 2D Gaussian montagem já foram empregados^6,11,12. No entanto, para aumentar a aplicabilidade do método, é descrito um processo de análise de dados que possa ser facilmente implementado em todos os laboratórios.

1. Carregue o par correspondente de imagens .tiff de dois canais de fluorescência diferentes no mesmo campo de imagem no software FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
2. No menu imagem, escolha cor,e usar a função Merge Channel para criar um composto dos dois canais.
3. Observe se os lipossomas imagedem em dois canais diferentes exibem uma boa colocalização ou se ocorreu uma deriva visível.
   NOTA: Em caso de deriva entre os dois canais de fluorescência (reconhecido como um deslocamento X-Y sistemático e igual entre o sinal nos dois canais), um dos quadros pode ser traduzido usando a função Transform > Translate no menu de imagem de FIJI. No entanto, deve ser tomado cuidado com tal manipulação de imagem. Recomenda-se, portanto, evitar a deriva, tanto quanto possível ao imagem dos lipossomas.
4. Certifique-se de que o plugin ComDet (v.0.3.6.1 ou mais novo) esteja instalado, ou faça isso no menu Plugins.
5. Abra o plugin ComDet para detectar partículas, indo para o menu Plugins e escolhendo ComDet v.0.3.6.1 > Detect Particles.
6. Em ComDet, certifique-se de escolher as partículas de detectar em ambos os canais funcionam individualmente. Defina a distância máxima entre manchas co-localizadas semelhantes ao tamanho aproximado das partículas. Normalmente, 4 pixels são apropriados para as configurações descritas aqui.
7. A relação sinal-ruído deve permitir a detecção de partículas ainda não ofuscantes com uma baixa quantidade de fluorescência. Em ComDet, definir essa relação para 3, definindo a sensibilidade da detecção em ambos os canais para partículas muito dim (SNR = 3).
   NOTA: Embora esse valor snr seja geralmente apropriado, pode ser necessário configurá-lo mais alto (por exemplo, se houver muito ruído de imagem que possa ser identificado como lipossomas e levar a falsos positivos).
8. Certifique-se de que as caixas com colocalização de cálculo e partículas detectadas em ambos os canais sejam verificadas, antes de pressionar OK.
9. Depois de executar a análise, duas janelas pop-up com resultados e resumo irá mostrar. Exportar os resultados da tabela de dados contendo os dados de colocalização (coordenadas de partículas e intensidade integrada de cada partícula detectada) para um software de manipulação de dados de escolha, salvando a tabela como um arquivo .txt e importá-lo para o software.
10. Certifique-se de que cada lipossosoma só é incluído uma vez no conjunto de dados e não tanto o canal1/channel2, bem como a relação canal2/channel1. Assim, filtrar os dados para que apenas Abs_frame = 1 é traçado na etapa 5.11.
    NOTA: Ao escolher Colocalized = 1, falsos positivos do ruído nas imagens podem ser removidos da análise. No entanto, quaisquer lipossomas com apenas um dos dois componentes fluorescentes presentes também serão excluídos da análise, removendo assim pontos de dados importantes da análise.
11. Trace um histograma da coluna com dados contendo a razão de intensidade para cada liposoma detectado.
12. O grau de inhomogeneidade composicional para o sistema liposômico estudado é representado pela largura da distribuição da razão de intensidade. Para quantificar a inhomogeneidade, encaixe no histograma da relação da intensidade com uma função gaussian e extraia o meio (μ) e o desvio padrão (sigma). Veja a seção resultados representativos.
13. Um valor para o grau de inhomogeneidade (DI) agora pode ser calculado usando o coeficiente de variação definido como DI = sigma /μ.

6. Calibração do tamanho do lipososome

1. Tire parte do estoque de lipossoma, e extruda 21x através de um filtro de policarbonato de 50 nm, como descrito no passo 1.10.
2. Diluir os lipossomos, adicionando 10 μL da suspensão lipossoma para 800 μL de tampão sorbitol em um tubo de microcentrífuga.
3. Transfira a amostra de liposoma diluída para uma cuvette de uso único de polipropileno.
4. Medir o tamanho usando dispersão de luz dinâmica (DLS). Executar pelo menos três corridas independentes para medir o tamanho e a polidispersão da suspensão dos liposos.
   NOTA: Se necessário, use uma suspensão lipossoma mais concentrada para a medição. Alternativas ao DLS (por exemplo, análise de rastreamento de nanopartículas) também podem ser aplicadas para medir o tamanho dos lipossomos. Uma descrição de como executar tal determinação do tamanho de partículas está além do escopo deste protocolo.
5. Imagem os lipossomos de calibração no microscópio usando exatamente as mesmas configurações experimentais, conforme definido nas etapas 4.1 e 4.2.
6. Extraia a intensidade integrada para cada lipossoma de calibração nas imagens de calibração: Extraia a folha de resultados filtrada contendo intensidades de fluorescência de lipossoma, conforme descrito nos passos 5,1-5,10. A partir da tabela de resultados, extraia a coluna "IntegratedInt".
7. Como a intensidade total integrada de um lipossoma rotulado em sua membrana é proporcional à área superficial do lipososoma e, portanto, proporcional ao quadrado de seu diâmetro, traça um histograma de intensidade de raiz quadrada da intensidade da fluorescência lipossomos de calibração.
8. Ajuste o histograma integrado da intensidade produzido na etapa 6.7 com uma distribuição normal do registro e extrai a intensidade média da fluorescência dos liposmas da calibração.
9. Para determinar a relação entre a intensidade da raiz quadrada (Int_Sqrt)e o tamanho dos lipososos, calcule o fator de correção (C) usando o diâmetro médio de lipossoma (Dia) pesado pelo número obtido das medições do DLS: Dia = C x Int_Sqrt é equivalente a C = Dia / Int_Sqrt.
10. Calcule os valores do Int_Sqrt para os lipossomos no experimento de inhomogeneidade composicional e converta-os em diâmetros multiplicando-se com o fator de correção.
11. Trace o valor da razão de intensidade em função do diâmetro para os lipossomos de inhomogeneidade composicional, alcançando assim a inhomogeneidade em função do tamanho dos lipossomas para uma população de lipossomas que variam de aproximadamente 50 nm-800 nm.

Resultados

Seguir o protocolo descrito torna possível a imagem de lipossomos únicos de uma forma paralela maciça (Figura 1). A bem-sucedida imobilização superficial dos lipossomas deve ser imediatamente aparente após a adição da solução lipossoma à câmara (passo 3.6 no protocolo), já que as manchas de intensidade limitada de difração devem aparecer na imagem (Figura 1B e Figura 1...

Discussão

É importante notar que, embora descrevamos em detalhes como o ensaio único dos lipossomas pode ser usado para estudar a inhomogeneidade composicional entre os lipossomas individuais, a plataforma é muito versátil. Como mostrado anteriormente e discutido na introdução, o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar aspectos da fusão membrana-membrana, interações proteína-membrana ou caracterização lipossômica do portador de drogas. Para quaisquer questões científicas que estão sendo abordadas, o pod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ