Количественная флуоресценция на основе однолипосомы анализ для обнаружения композиционной неоднородности между отдельными липосомы

Резюме

Этот протокол описывает изготовление липосом и как они могут быть обездвижены на поверхности и изображены индивидуально в массивной параллельной манере с помощью флуоресценции микроскопии. Это позволяет количественно определить размер и композиционную неоднородность между отдельными липосонами населения.

Аннотация

Большинство исследований с использованием липосом в качестве мембранных систем модели или носителей доставки лекарств опирается на объемные методы чтения и, таким образом, внутренне предполагает, что все липосомы ансамбля будут идентичны. Тем не менее, новые экспериментальные платформы, способные наблюдать липосомы на уровне одной частицы, позволили провести высокосложные и количественные исследования по белково-мембрановым взаимодействиям или свойствам носителя наркотиков на отдельных липосомых, таким образом избегая ошибок из ансамбля усреднения. Здесь мы представляем протокол для подготовки, обнаружения и анализа отдельных липосом с помощью анализа микроскопии на основе флуоресценции, облегчая такие измерения одной частицы. Установка позволяет для визуализации отдельных липосом в массовом параллельном порядке и используется для выявления внутривыборных размеров и композиционных неоднородностей. Кроме того, протокол описывает преимущества изучения липосом на одном уровне липосомы, ограничения асссея, а также важные особенности, которые необходимо учитывать при его изменении для изучения других исследовательских вопросов.

Введение

Липосомы являются сферические фосфолипидные пузырьки, которые широко используются как в основных, так и в прикладных исследованиях. Они функционируют как отличные системы мембранной модели, потому что их физиохимические свойства можно легко манипулировать путем изменения липидных компонентов, составляющих липосому^1,2. Кроме того, липосомы представляют собой наиболее часто используемую систему доставки лекарств, предлагая улучшенную фармакокинетику и фармакодинамику, а также высокую биосовместимость³.

На протяжении многих лет липосомы в основном изучались с использованием массовых методов, давая только доступ к среднему ансамблю считывание значений. Это привело большинство из этих исследований предположить, что все липосомы в ансамбле идентичны. Однако такие значения, усредненные по ансамблю, являются правильными только в том случае, если базовый набор данных равномерно распределен вокруг среднего значения, но может представлять собой ложное и предвзятое заключение, если набор данных включает, например, несколько независимых групп населения. Кроме того, предполагая, ансамбль означает представлять все население может игнорировать информацию, укрываемую в неоднородности между липосомы. Только недавно появились количественные анализы, которые способны зондировать одиночные липосомы, выявляя большие неоднородности между отдельными липосомы по отношению к важным физикохимическим свойствам, включая липосомы размер⁴, липидный состав^5,6, и эффективность инкапсуляции⁷, подчеркивая важность изучения липосом на одном уровне липосомы.

Научно-исследовательская область, где ансамбль усреднения липосомсвойства было показано, что результаты смещения изучает липосома-зависимых белково-мембранных взаимодействий^8,9. Традиционно, исследователи, изучающие такие процессы, были ограничены в подготовке липосом с различными средними диаметрами ансамбля экструзией через фильтры с различными размерами пор^9. Тем не менее, извлечение диаметра отдельных липосом с помощью одной липосомы анализы выявили большие перекрытия населения, с липосомы экструдированные с помощью 100 нм и 200 нм фильтры отображения до 70% перекрытия в их размер распределения⁴. Это может серьезно смещения объемных измерений липосома размера-зависимых белково-мембранных взаимодействий¹⁰. Выполняя исследования взаимодействия мембраны и белка с использованием одного липосома анализ, исследователи вместо этого воспользовался размер-polydispersity в образце, что позволяет им изучать широкий спектр липосом диаметров в рамках каждого одного эксперимента, способствуя новым открытиям о том, как мембранная кривизна и состав может повлиять на набор белка в мембраны^4,11,12. Еще одно поле, где применение одной липосомы анализы оказалось полезным в механистических исследованиях белка опосредованного мембранного слияния^13,14. Для таких кинетических измерений, способность изучать индивидуальные события слияния смягчила необходимость экспериментальной синхронизации процесса синтеза, позволяя новые механистические идеи, которые в противном случае были бы потеряны в пространственно-временном усреднении сделано в объемных измерений ансамбля. Кроме того, одиночные липосомы были использованы в качестве мембраны эшафот, что позволяет измерения отдельных белков и предлагает новые знания о трансмембранных белков структурной динамики^15,16. Кроме того, такие протеолипосомы на основе установок позволило изучить функции отдельных трансмемментов¹⁷ и порообразующих белковых комплексов^18, а также механизм биоактивных мембранно-пермяковых пептидов¹⁹. Однолиповая липосома также использовалась в качестве нанофлюидики мягкой материи с поверхностно-обездвиженных одиночными липосомыми, выступающей в качестве камер для ферментативных реакций в объемах 10^-19 л, увеличивая пропускную способность и сложность скрининговых анализов с минимальным потреблением продукта²⁰.

В последнее время, один липосома анализы были использованы для характеристики доставки наркотиков липосомы на ранее unprecendented уровне детализации. Исследователям удалось количественно очислить значительные неоднородности в количестве полимера, прикрепленного к поверхности отдельных липосом²¹. Один липосомы анализы также позволили измерения доставки наркотиков липосомы в сложных средствах массовой информации, таких как плазма крови, показывая, как элементы, закрепленные на липосом поверхности через липидные якоря могут быть восприимчивы к диссоциации, когда липосомы подвергаются условиям, имитирующим тех, кто испытал во время циркуляции vivo²². В целом, универсальность и полезность одного липосома анализы обоснованы большое разнообразие проблем, эти установки были использованы для решения, и мы предусматриваем, что методология будет продолжать разрабатываться и найти применение в новых научных областях.

Здесь мы описываем флуоресценцию на основе одного липосомы анализ, который позволяет отдельных липосом, которые будут изучены в высокой пропускной форме (Рисунок 1). Чтобы проиллюстрировать метод, мы используем его для количественной оценки размера и композиционной неоднородности между отдельными липосонами в ансамбле. В анализе используется флуоресцентный микроскоп визуализации одной липосомы, обездвиженной на пассивной стеклянной поверхности. Сначала мы описываем критические шаги в процессе изготовления липосом, который обеспечивает надлежащую флуоресцентную маркировку липосом и иммобилизацию. Затем мы описываем поверхностный препарат, необходимый для облегчения липосомного иммобилизации, прежде чем с изложением процедуры обеспечения надлежащей плотности поверхности липосом. Мы обсуждаем параметры микроскопии, важные для получения высококачественных изображений, и разграничив, как выполнять простой анализ данных, позволяющий извить липосому и композиционную неоднородность. Этот общий протокол должен обеспечить хорошую основу для заинтересованного исследователя для дальнейшего развития ассседля для его или ее конкретных научных интересов.

протокол

1. Липосомная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, подготовка липосом обычно включает в себя три важнейших шага: 1) подготовка сухих липидных пленок желаемого липидного состава; 2) регидратация липидов для формирования липосом; и 3) контроль размера и ламелярности популяции липосом.

1. Взвесьте липиды и растворите их в терт-бутаноле: вода (9:1) в стеклянных флаконах.
   1. Растворить ПОПК (1-пальмитоил-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин; МВт - 760 г/моль) до 50 мм.
   2. Растворите холестерин (МВс 387 г/моль) до 25 мм.
   3. Растворите DOPE-Atto488 (1,2-диолеоил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Атто488; МВт - от 1316 г/мол) до 0,1 мм.
   4. Растворите DOPE-Atto655 (1,2-диолеоил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Атто655; МВт - от 1368 г/мол) до 0,1 мм.
   5. Растворите DSPE-PEG2000-биотин (1,2-дистенил-сн-глицеро-3-фосфататаноламин-N-биотинил (полиэтиленгликоль)-2000"; МВт - от 3 017 г/мол) до 0,1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло липидов до 55 градусов по Цельсию и использовать магнитное перемешивание для того, чтобы обеспечить полное растворение липидов. Кроме того, используйте соникную ванну. Неиспользованные липидные запасы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
2. Смешайте липидные запасы, подготовленные в шаге 1,1 к молярному соотношению POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-биотин 68.95:30:0.5:0.5:0.05, добавляя 138 л поп-музыки, 120 л холестерина, 500 л/ и липидный флуоресцентный, и 50 л DSPE-PEG-биотин к свежему стеклянному флакону.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точная липосомовая композиция может быть легко изменена для решения конкретного вопроса, интересуемого. Более подробно об этом можно просмотреть.
3. Освободьте крышку стеклянного флакона и заморозьте флакон в жидком азоте.
4. Лиофилизацию замороженной липидной смеси на ночь.
5. Добавьте 1 мл 200 мМ D-сорбитол буфера (сорбитол буфер) в сухие липиды.
6. Нагрейте смесь до 45 градусов по Цельсию и подвергайте подвергать воздействию магнитного помешивания, по крайней мере 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен отражать конкретный вопрос, который рассматривается (например, физиологические условия для изучения взаимодействия мембранно-белкового белка, или конкретный клинически утвержденный буфер для изучения липосом доставки лекарств). Однако, если для исследования не требуется определенный буфер, для регидратации можно нанести буфер без ионов, чтобы уменьшить многоламеллярность липосом.
7. Заморозить липидную подвеску, окунув флакон в жидкий азот, и подождите, пока суспензия полностью замерзнет.
8. Опустите замороженную подвеску в отопительную ванну при 55 градусах Цельсия до тех пор, пока смесь полностью не разморозится.
9. Повторите шаги 1.7 и 1.8 до тех пор, пока липосомоносная суспензия не подвергнется воздействию в общей сложности 11 циклов замораживания/оттепели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные циклы замораживания/оттепели показали, что уменьшают липосомную мультиламелляритность²³, что имеет первостепенное значение для точности одного липосомного анализ, как мультиламеллярные липосомы будут исказить интенсивность флуоресценции по сравнению с липосомы соотношение размера липосомы. Мультиламеллярность, как правило, по своей сути низким, когда в том числе более 0,5% PEGylated липидов в формулировке (например, обычно делается в липосомы для доставки наркотиков)²⁴.
10. Вынизуйте липосомную подвеску один раз через 800 нм поликарбонатного фильтра с помощью мини-экструзионного комплекта. Следуйте инструкциям производителя по сборке экструзионного комплекта (см. Таблицу материалов).
11. Храните липосомы при 4 градусах Цельсия на ночь.

2. Подготовка поверхности камеры визуализации

1. Подготовка бычьего сывороточного альбумина (BSA; 1 мг/мл), BSA-биотин (1 мг/мл) и стрептавидина (0,025 мг/мл) в 10 мм HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперетанесульфоновая кислота) 95 мМ НаК буфер (буфер HEPES).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения липосомального всплеска, сорбитол буфер, используемый для регидратации и HEPES буфер, используемый для подготовки поверхности должен быть изотоническим. Поэтому рекомендуется проверить осмолярность буферов перед экспериментом.
2. Смешайте 1200 л BSA и 120 л BSA-биотина и добавьте 300 л смеси к каждому колодцу в 8 скважине для микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем коммерчески доступные 8 хорошо микроскоп слайд со стеклянным дном (см. Таблица материалов), но протокол может быть легко адаптированы к индивидуальным микроскоп камеры.
3. Инкубировать горку в течение 20 минут при комнатной температуре (RT).
4. Вымойте слайд 8x с 300 зл буфера HEPES.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не оставить скважины без буфера в течение более нескольких секунд, как высыхание поверхности повредит его. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность с кончиком пипетки, как это также повредит его. Таким образом, при успомении буфера от колодца, сделайте это от края или угла.
5. Добавьте 250 л стрептавидина и инкубацию в течение 10 мин на РТ.
6. Повторите 8 смы, описанные в шаге 2.4.
7. Храните слайд микроскопа с 300 qL буфера сорбитола в каждой скважине при 4 градусах Цельсия. Испарение растворителя повредит поверхность, поэтому поместите слайд микроскопа в чашку Петри и запечатайте его парафильмом, если не будет немедленно использованподготовленный слайд.

3. Липосомомат иммобилизация

1. Разбавить липосомную суспензию примерно до 20 МКм общего липида в буфере сорбитола. Процедура в разделе 1 даст липосому подвески примерно 10 мМ общей липидов.
2. Поместите слайд на микроскоп и сосредоточьтесь на поверхности камеры, используя увеличенный лазерный сигнал отражения от стеклянного/буферного интерфейса в качестве направляющего руководства.
3. Вымойте камеру 4x с 300 зл и свежего буфера HEPES.
4. Добавьте в микроцентрифугную трубку 10 л разбавленного липосомного запаса (20 мкм общего липида).
5. Выняйте 100 qL буфера из камеры, добавить в микроцентрифугтрубки подготовлены в шаге 3.4, правильно перемешать, и положить 110 qL обратно в камеру.
6. Поместите образец под микроскопом и используйте рудиментарный микроскоп, способный обнаруживать сигнал от липосомного фторора (ы) для наблюдения за обездвижением липосомы на поверхности.
7. Цель для липосомного плотности поверхности, которая одновременно достаточно разреженной, чтобы определить отдельные липосомы и достаточно плотной, что облегчает измерения высокой пропускной связи. Обычно с использованием 50 мкм х 50 мкм поля зрения, 300-400 липосом на кадр является оптимальным(рисунок 2). Обычно это может быть достигнуто в течение 5–10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если только быстро движущихся флуоресцентных частиц обнаружены в поле зрения, отсутствие или слишком низкая концентрация любого из компонентов, критически важных для процесса иммобилизации (BSA-биотин, стрептавидин, DOPE-PEG-биотин) может быть причиной. Если липосомы не обнаружены, это может быть связано либо с низкой концентрацией липосом, неправильные настройки для обнаружения флуоресценции, или потенциально изображения с координационной плоскости не на поверхности стекла.
8. Как только соответствующая плотность поверхности липосом достигается, промойте камеру 3x с 200 зл и буфером HEPES.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что иммобилизация кинетики также зависит от липосомного свойства, такие как размер и заряд и, таким образом, всегда должны быть оптимизированы для каждой липосомой формулировки.

4. Приобретение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел будет во многом зависеть от системы микроскопа, доступной исследователю, выполняющего эксперимент. Таким образом, будут описаны общие рекомендации о том, как выполнять изображения. Тем не менее, точные настройки и как их применять будет варьироваться между различными настройками микроскопа. Например, некоторые системы позволяют выбирать любую желаемую комбинацию эмиссионных фильтров, в то время как другие микроскопы оснащены специфическими, заданные фильтры.

1. Настройка микроскопа для визуализации отдельных липосом. Для обеспечения оптимального качества изображения и последующего анализа данных используйте высокое разрешение серого масштаба и схему пикселей, которая позволяет перебирать отдельные липосомы. Немного глубины 16 и по крайней мере 1024 х 1024 пикселей для 50 мкм х 50 мкм области рекомендуется. При наличии, линейное число строк может быть благотворно применено для уменьшения шума (например, 3 сканирования на линию).
2. Выберите возбуждающую лазерную мощность, которая обеспечивает незначительное отбеливание кадров и достаточно сильный сигнал, чтобы четко различать отдельные липосомы на заднем плане. Оптимальная настройка будет зависеть от конкретного микроскопа, а также комбинации фторофора. Убедитесь, что детекторы не насыщены, так как это будет смещения интенсивности количественной оценки.
3. Визуализация как DOPE-Atto488, так и DOPE-Atto655 фторофоров в липосомы требует визуализации нескольких каналов. Таким образом, убедитесь, что каждый канал изображен последовательно, чтобы избежать перекрестного возбуждения. Например, сначала возьмите одно изображение, захватывающий на 488 нм и чтение выбросов на 495-560 нм. После этого, принять другое изображение, захватывающие на 633 нм, но чтение выбросов только на 660-710 нм. Специфика будет зависеть от системы микроскопа (например, которая лазеры и фильтры) доступны.
4. Убедитесь в том, чтобы покрыть различные области поверхности, приобретая по крайней мере 10 изображений образца, таким образом, изображение по крайней мере 3000 отдельных липосом. Если плотность поверхности ниже 300 липосом/кадра, приобретите больше изображений. Убедитесь в том, чтобы переориентировать микроскоп для каждого нового изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для двухканальной визуализации, убедитесь, что имя файлы изображений так, что пары изображений с теми же липосомы в различных каналах флуоресценции могут быть легко идентифицированы во время анализа данных.
5. Для количественной оценки экспериментальной неопределенности, связанной с измерением композиционной неоднородности, изображение той же области липосом до и после переориентации (см. рисунок 3 и описание в тексте).
6. Экспорт изображения из микроскопа программного обеспечения как .tiff файлов. Экспортировать два канала одной и той же липосомы индивидуально.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанные автоматизированные 2D Гауссиан установки процедур ранее были использованы^6,11,12. Однако для повышения применимости метода описывается процесс анализа данных, который может быть легко реализован во всех лабораториях.

1. Загрузите соответствующую пару изображений .tiff двух различных каналов флуоресценции в одном поле изображения в программное обеспечение FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
2. В меню изображения выберите Colorи используйте функцию канала слияния для создания композитного из двух каналов.
3. Обратите внимание, если липосомы, изображенные в двух разных каналах, показывают хорошую колокализацию или произошло ли видимый дрейф.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае дрейфа между двумя каналами флуоресценции (признанных как систематическое и равное X-Y смещение между сигналом в двух каналах), один из кадров может быть переведен с помощью преобразования йgt; Перевод функции в меню изображения FIJI. Тем не менее, следует позаботиться о таких манипуляций изображения. Поэтому рекомендуется, чтобы вместо этого избежать дрейфа как можно больше при визуализации липосомы.
4. Убедитесь, что плагин ComDet (v.0.3.6.1 или newer) установлен, или сделайте это в меню Plugins.
5. Откройте плагин ComDet для обнаружения частиц, перейдя в меню Plugins и выбрав ComDet v.0.3.6.1 .
6. В ComDet убедитесь, что выберите обнаружить частицы на обоих каналах Индивидуально функции. Установите максимальное расстояние между колокализованными пятнами, похожими на приблизительное размер частиц. Как правило, 4 пикселя подходят для параметров, описанных здесь.
7. Соотношение сигнала к шуму должно позволять обнаруживать даже тусклые частицы с низким количеством флуоресценции. В ComDet установите это соотношение до 3, установив чувствительность обнаружения в обоих каналах на очень тусклые частицы (SNR No 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это значение SNR обычно уместно, может быть необходимо установить его выше (например, если есть много шума изображения, которые могут быть определены как липосомы и привести к ложным срабатываниям).
8. Убедитесь, что коробки с рассчитать colocalization и Участок Обнаруженные частицы в обоих каналах проверяются, прежде чем нажать OK.
9. После запуска анализа будут отображаться два всплывающих окна с результатами и Резюме. Экспорт таблицы данных Результаты, содержащие данные colocalization (координаты частиц и интегрированной интенсивности каждой обнаруженной частицы) в программное обеспечение обработки данных по выбору, сохраняя таблицу в качестве файла .txt и импортируя его в программное обеспечение.
10. Убедитесь, что каждая липосома включена только один раз в набор данных, а не как канал1/канал2, а также соотношение channel2/channel1. Таким образом, отфильтруйте данные, чтобы только Abs_frame No 1 построен в шаге 5.11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирая Colocalized No 1, ложные срабатывания от шума в изображениях могут быть удалены из анализа. Однако любые липосомы, в которых присутствует только один из двух флуоресцентных компонентов, также будут исключены из анализа, что потенциально удалит важные точки данных из анализа.
11. Участок гистограммы столбца с данными, содержащими коэффициент интенсивности для каждой обнаруженной липосомы.
12. Степень композиционной неоднородности для изученной липосомальной системы представлена шириной распределения коэффициента интенсивности. Для количественной оценки неоднородности, соответствовать коэффициенту интенсивности гистограммы с гауссийской функцией и извлечь среднее (я) и стандартное отклонение (сигма). Смотрите раздел «Результаты представительства».
13. Значение степени неоднородности (DI) теперь можно рассчитать с использованием коэффициента вариации, определяемого как DI и sigma / q.

6. Калибровка размеров липом

1. Выняйте часть липосомного запаса и выдавливайте 21x через фильтр поликарбоната 50 нм, как описано в шаге 1.10.
2. Разбавить липосомы, добавив 10 зл липосомного суспензии до 800 л сорбитолового буфера в микроцентрифуговой трубке.
3. Перенесите разбавленный образец липосомы в полипропиленовый одноразовой квет.
4. Измерьте размер с помощью динамического рассеяния света (DLS). Выполните по крайней мере три независимых пробега для измерения размера и полидисперсности липосомной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте более концентрированную липосомную суспензию для измерения. Альтернативы DLS (например, анализ отслеживания наночастиц) также могут быть применены для измерения размера липосом. Описание того, как выполнить такое определение размера частиц, выходит за рамки данного протокола.
5. Изображение калибровочных липосом на микроскопе, используя точно такие же экспериментальные настройки, как это определено в шагах 4.1 и 4.2.
6. Извлеките интегрированную интенсивность для каждой калибровочной липосомии на калибровочных изображениях: Извлеките фильтрованный лист результатов, содержащий интенсивность липосомного флуоресценции, как описано в шагах 5.1–5.10. Из таблицы результатов извлеките столбец "IntegratedInt".
7. Потому что общая интегрированная интенсивность липосомы помечены в мембране пропорционально площади поверхности липосомы и, таким образом, пропорциональна квадрату своего диаметра, участок квадратного корня интенсивности гистограммы интенсивности флуоресценции интенсивности калибровка липосомы.
8. Fit интегрированной интенсивности гистограммы производится в шаге 6.7 с журналом нормального распределения и извлечь среднюю интенсивность флуоресценции калибровочных липосом.
9. Чтобы определить связь между интенсивностью квадратного корня (Int_Sqrt)и размером липосомы, вычислите коэффициент коррекции (C) с использованием среднего диаметра липосомы (Dia), взвешенного по количеству, полученному из измерений DLS: Dia c c Int_Sqrt эквивалентен C и Dia / Int_Sqrt.
10. Рассчитайте значения Int_Sqrt для липосом в композиционном эксперименте неоднородности и преобразуйте их в диаметры, умножая с коэффициентом коррекции.
11. Участок соотношение интенсивности значение как функция диаметра для композиционной липосомы неоднородности, таким образом, достижение неоднородности как функция липосомы размера для популяции липосом, охватывающих от примерно 50 нм-800 нм.

Результаты

Следуя описанному протоколу, можно изображение отдельных липосом в массовом параллельном порядке(рисунок 1). Успешная поверхностная иммобилизация липосом должна быть немедленно очевидна при добавлении липосомного раствора в камеру (шаг 3.6 в протокол?...

Обсуждение

Важно отметить, что в то время как мы подробно описываем, как один липосомы можно использовать для изучения композиционной неоднородности между отдельными липосомы, платформа очень универсальна. Как было показано ранее и обсуждается во введении, протокол может быть легко адаптирован ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ