Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Riepilogo

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Abstract

La maggior parte delle ricerche che impiegano liposomi come sistemi modello di membrana o portatori di somministrazione di farmaci si basa su tecniche di lettura alla rinfusa e quindi presuppone intrinsecamente che tutti i liposomi dell'ensemble siano identici. Tuttavia, nuove piattaforme sperimentali in grado di osservare i liposomi a livello di particelle singole hanno permesso di eseguire studi altamente sofisticati e quantitativi sulle interazioni proteina-membrana o sulle proprietà dei portatori di farmaci sui singoli liposomi, evitando così gli errori dalla media dell'insieme. Qui presentiamo un protocollo per la preparazione, il rilevamento e l'analisi di singoli liposomi usando un analisi di microscopia basata sulla fluorescenza, facilitando tali misurazioni di particelle singole. L'impostazione consente di imaging singoli liposomi in modo massiccio parallelo e viene impiegato per rivelare le dimensioni intra-campione e le inomogeneità compositive. Inoltre, il protocollo descrive i vantaggi dello studio dei liposomi a livello singolo di liposoma, i limiti del saggio e le caratteristiche importanti da considerare quando lo si modifica per studiare altre domande di ricerca.

Introduzione

I liposomi sono vescicole sferiche a base di fosforelipidi che sono fortemente utilizzati sia nella ricerca di base che in quella applicata. Funzionano come eccellenti sistemi di modelli di membrana, perché le loro proprietà fisiochimiche possono essere facilmente manipolate variando i componenti lipidici che compongono il liposoma^1,2. Inoltre, i liposomi costituiscono il sistema di nanocarrier per la consegna di farmaci più utilizzato, offrendo una migliore farmacocinetica e farmacodinamica, nonché un'elevata biocompatibilità³.

Per molti anni, i liposomi sono stati studiati principalmente utilizzando tecniche sfuse, dando solo accesso ai valori medi di lettura dell'ensemble. Questo ha portato la maggior parte di questi studi ad assumere che tutti i liposomi nell'ensemble siano identici. Tuttavia, tali valori mediati nell'insieme sono corretti solo se il set di dati sottostante viene distribuito uniformemente intorno al valore medio, ma può rappresentare una conclusione falsa e distorta se il set di dati include più popolazioni indipendenti, ad esempio. Inoltre, supponendo che l'insieme significhi rappresentare l'intera popolazione può trascurare le informazioni contenute all'interno dell'omogeneità tra i liposomi. Solo di recente sono emersi saggi quantitativi che sono in grado di sondare singoli liposomi, rivelando grandi inomogeneità tra i singoli liposomi rispetto a importanti proprietà fisiologiche tra cui la dimensione liposomica⁴, la composizione dei lipidi^5,6, e l'efficienza di incapsulamento^7,evidenziando l'importanza di studiare i liposomi a livello singolo liposoma.

Un'area di ricerca in cui è stato dimostrato che l'insieme delle proprietà del liposoma è stato mostrato come bias sta studiando le interazioni liposomidi-proteina-membrana dipendenti dalle dimensioni^8,9. Tradizionalmente, i ricercatori che studiano tali processi sono stati limitati alla preparazione di liposomi con diversi diametri medi di insieme per estrusione attraverso filtri con diverse dimensioni dei pori⁹. Tuttavia, l'estrazione del diametro dei singoli liposomi utilizzando singoli saggi liposomi ha rivelato grandi sovrapposizioni di popolazione, con liposomi estrusa utilizzando 100 nm e 200 nm che mostrano fino al 70% di sovrapposizione nella loro distribuzione di dimensioni⁴. Questo potrebbe pendizzare gravemente le misurazioni di massa delle interazioni liposomiche tra dimensioni e membrana^{dipendenti da 10}. Eseguendo gli studi di interazione membrana-proteina utilizzando il singolo saggio liposoma, i ricercatori hanno invece approfittato della dimensione-polidispersità all'interno del campione, permettendo loro di studiare una vasta gamma di diametri liposomici all'interno di ogni singolo esperimento, facilitando nuove scoperte di come la curvatura e la composizione possono influenzare il reclutamento di proteine alle membrane^4,11,12. Un altro campo in cui l'applicazione di saggi a singolo liposomasi si è dimostrata strumentale è negli studi meccanicistici di fusione della membrana mediata da proteine^13,14. Per tali misurazioni cinetiche, la capacità di studiare singoli eventi di fusione ha alleviato la necessità di sincronizzazione sperimentale del processo di fusione, consentendo nuove intuizioni meccanicistiche che altrimenti sarebbero andate perse nella media spaziotemporale effettuata nelle misurazioni di massa dell'ensemble. Inoltre, singoli liposomi sono stati utilizzati come scaffold a membrana, consentendo la misurazione di singole proteine e offrendo nuove conoscenze sulla dinamica strutturale delle proteine transmembrane^15,16. Inoltre, tali configurazioni a base di proteoliposomi hanno permesso di studiare la funzione dei singoli trasportatori transmembrana¹⁷ e dei complessi proteici che formano i pori^18, nonché il meccanismo dei peptidi bioattivi a membrana-permeabilizzante¹⁹. Liposomi singoli sono stati utilizzati anche come nanofluidica a materia morbida con liposomi singoli immobilizzati sulla superficie che servono come camere per reazioni enzimatiche in volumi di 10^-19 L, aumentando la produttività e la complessità dei saggi di screening con un consumo minimo di prodotto²⁰.

Recentemente, sono stati utilizzati saggi a singolo liposomale per caratterizzare i liposomi per la somministrazione di farmaci a un livello di dettaglio precedentemente senza precedenti. I ricercatori sono stati in grado di quantificare significative inomogeneità nella quantità di polimero attaccato alla superficie dei singoli liposomi²¹. I singoli saggi liposomi consentiti anche misure di liposomi di emissione di farmaci in supporti complessi, come il plasma sanguigno, rivelando come gli elementi ancorati alla superficie liposomica attraverso ancore lipidici possono essere suscettibili alla dissociazione quando i liposomi sono esposti a condizioni che imitano quelli sperimentati durante la circolazione in vivo²². Nel complesso, la versatilità e l'utilità dei saggi singoli liposomi sono corroborate dalla grande varietà di problemi che questi allestimenti sono stati impiegati per affrontare, e inviamo che la metodologia continuerà ad essere sviluppata e a fare uso in nuovi campi scientifici.

Qui descriviamo un saggio a singolo liposoma a base di microscopia a fluorescenza che consente di studiare i singoli liposomi in modo ad alto velocità effettiva (Figura 1). Per illustrare il metodo, lo usiamo per quantificare le dimensioni e l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi all'interno di un ensemble. Il saggio utilizza l'imaging al microscopio a fluorescenza di singoli liposomi immobilizzati su una superficie di vetro passiva. Descriviamo innanzitutto i passaggi critici del processo di fabbricazione del liposoma che garantisce una corretta etichettatura e immobilizzazione fluorescente. Quindi, descriviamo la preparazione della superficie necessaria per facilitare l'immobilizzazione liposomale prima di delineare la procedura per garantire densità di superficie liposomiche appropriate. Discutiamo i parametri di microscopia importanti per l'acquisizione di immagini di alta qualità e delineamo come eseguire semplici analisi dei dati, consentendo l'estrazione delle dimensioni liposomiche e l'inomogeneità compositiva. Questo protocollo generico dovrebbe fornire una buona base per il ricercatore interessato per sviluppare ulteriormente il saggio per il suo specifico interesse per la ricerca.

Protocollo

1. Preparazione del liposoma

NOTA: In breve, la preparazione dei liposomi di solito comprende tre passaggi cruciali: 1) la preparazione di pellicole lipidiche secche della composizione lipidica desiderata; 2) reidratazione dei lipidi per la formazione di liposomi; e 3) controllando le dimensioni e la lamellarità della popolazione lipososo.

1. Pesare i lipidi e scioglierli in tert-butanol:acqua (9:1) in fiale di vetro.
   1. Sciogliere POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW da 760 g/mol) a 50 mM.
   2. Sciogliere il colesterolo (MW - 387 g/mol) a 25 mM.
   3. Sciogliere DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto488; MW da 1.316 g/mol) a 0,1 mM.
   4. Sciogliere DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto655; MW da 1.368 g/mol) a 0,1 mM.
   5. Scioglire DSPE-PEG2000-biotina (1,2-distearyl-sn-glycero-3-phosphateolamine-N-[biotinyl(polyethylene glicol)-2000]; MW da 3.017 g/mol) a 0,1 mM.
      NOTA: Riscaldare i lipidi a 55 gradi centigradi e utilizzare l'agitazione magnetica per garantire la completa dissoluzione dei lipidi. In alternativa, utilizzare un bagno di sonicazione. Gli stock di lipidi inutilizzati possono essere immagazzinati a -20 gradi centigradi per diversi mesi.
2. Mescolare i supporti di lipidi preparati nel passaggio 1.1 per un rapporto molare di POPC:colesterolo:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0.05, aggiungendo 138 l di POPC, 120 l di colesterolo, 500 l di ogni lipido fluorescente e 50 l di DSPE-PEG-biotina a una fiala di vetro fresco.
   NOTA: L'esatta composizione liposoma può essere facilmente modificata per affrontare la specifica questione di interesse. Vedere la discussione per maggiori dettagli.
3. Allentare il coperchio della fiala di vetro e congelare la fiala in azoto liquido.
4. Lyophilize la miscela di lipidi congelati durante la notte.
5. Aggiungere 1 mL di buffer D-sorbitolo da 200 mM (tampone sorbitolo) ai lipidi secchi.
6. Riscaldare il composto a 45 gradi centigradi ed esporre a agitazione magnetica per almeno 1 h.
   NOTA: Il buffer deve riflettere la domanda specifica che viene affrontata (ad esempio, condizioni fisiologiche per studiare le interazioni membrana-proteina, o uno specifico buffer clinicamente approvato per studiare i liposomi di somministrazione di farmaci). Tuttavia, se per lo studio non è necessario un buffer specifico, è possibile applicare un buffer senza ioni per la reidratazione al fine di ridurre la multilamellarità dei liposomi.
7. Congelare la sospensione lipididale immergendo la fiala in azoto liquido e attendere che la sospensione sia completamente congelata.
8. Immergere la sospensione congelata in un bagno di riscaldamento a 55 gradi centigradi fino a quando la miscela non viene completamente scongelata.
9. Ripetere i passaggi 1.7 e 1.8 fino a quando la sospensione lipososo è stata esposta a un totale di 11 cicli di congelamento/scongelamento.
   NOTA: Ripetuti cicli di congelamento/scongelamento hanno dimostrato di ridurre il multilamellarity liposoma²³, che è fondamentale per la precisione del singolo saggio liposoma, in quanto i liposomi multilamellar inclinano l'intensità della fluorescenza rispetto al rapporto di dimensioni liposomi che dei liposomi. La multilamellarità è di solito intrinsecamente bassa quando include più di 0.5% Lipido PEGylated nella formulazione (come comunemente fatto in liposomi per la somministrazione di farmaci)²⁴.
10. Estrudere la sospensione lipososo una volta attraverso un filtro in policarbonato da 800 nm utilizzando un kit di mini estrusione. Seguire le istruzioni del produttore per l'assemblaggio del kit di estrusione (vedere Tabella dei materiali).
11. Conservare i liposomi a 4 gradi durante la notte.

2. Preparazione superficiale della camera di imaging

1. Preparare l'albumina del siero bovino (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotin (1 mg/mL) e la streptavidina (0,025 mg/mL) in 10 mHe HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesolonic acid) 95 mM NaCl buffer (HEPES buffer).
   NOTA: Per evitare esplosioni di liposomia, il buffer sorbitolo utilizzato per la reidratazione e il buffer HEPES utilizzato per la preparazione della superficie devono essere isotoni. Si raccomanda quindi di controllare l'osmolarità dei buffer prima dell'esperimento.
2. Mescolare 1.200 l di BSA e 120 l di BSA-biotina e aggiungere 300 l della miscela in ogni pozzo in un 8 pozzetti per la microscopia.
   NOTA: Qui usiamo un vetrino a 8 pozzetti con un fondo di vetro disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali),ma il protocollo può essere facilmente adattato alle camere personalizzate al microscopio.
3. Incubano lo scivolo per 20 min a temperatura ambiente (RT).
4. Lavare la diapositiva 8x con 300 l di tampone HEPES.
   NOTA: Fare attenzione a non lasciare i pozzi senza buffer per più di pochi secondi, come essiccazione della superficie lo danneggerà. Inoltre, fare attenzione a non graffiare la superficie con la punta pipetta in quanto questo danneggerà anche. Così, quando aspirare buffer da un pozzo, farlo dal bordo o angolo.
5. Aggiungere 250 - L di streptavidin e incubare per 10 min a RT.
6. Ripetere gli 8 fusi vie di lavatoi descritti nel passaggio 2.4.
7. Conservare il vetrino del microscopio con 300 gradi di tampone di sorbitolo in ogni pozzo a 4 gradi centigradi. L'evaporazione del solvente danneggerà la superficie, quindi mettere il vetrino del microscopio in una parabola Petri e sigillarlo con parafilm a meno che il vetrino preparato non venga utilizzato immediatamente.

3. Immobilizzazione liposoma

1. Diluire la sospensione lipososo a circa 20 m di lipido totale nel tampone sorbitolo. La procedura nella sezione 1 produrrà una sospensione lipososo di circa 10 mM lipidico totale.
2. Posizionare il vetrino sul microscopio e mettere a fuoco sulla superficie della camera utilizzando il segnale di riflessione laser aumentato dall'interfaccia vetro/buffer come guida.
3. Lavare la camera 4x con 300 l di tampone HEPES fresco.
4. Aggiungere 10 l di brodo liposomadio diluito (20 m lipidico totale) a un tubo di microcentrifuga.
5. Estrarre 100 l di tampone dalla camera, aggiungere al tubo di microcentrifuga preparato al passo 3.4, mescolare correttamente, e mettere il 110 L di nuovo nella camera.
6. Mettere l'esemplare al microscopio e utilizzare un'impostazione rudimentale al microscopio in grado di rilevare il segnale proveniente dal fluoroforo liposomano per osservare i liposomi immobilizzati sulla superficie.
7. Puntare a una densità di superficie liposomica che sia contemporaneamente sufficientemente scarsa da identificare i singoli liposomi e abbastanza densi da facilitare le misurazioni ad alta velocità. In genere, utilizzando un campo visivo di 50 m x 50 m, è ottimale la qualità dei liposomi perfotogramma( Figura 2 ). Questo di solito può essere raggiunto entro 5:10 min.
   NOTA: Se nel campo visivo vengono rilevate solo particelle fluorescenti in rapido movimento, la causa potrebbe essere un'assenza o un'eccessiva concentrazione di uno qualsiasi dei componenti critici per il processo di immobilizzazione (BSA-biotavidina, streptavidina, DOPE-PEG-biotin). Se non vengono rilevati liposomi, potrebbe essere correlato a una bassa concentrazione di liposomi, a impostazioni improprie per il rilevamento della fluorescenza o potenzialmente all'imaging con un piano focale non sulla superficie del vetro.
8. Una volta raggiunta una densità di superficie lipososoappropriata appropriata, lavare la camera 3x con 200 l di tampone HEPES.
   NOTA: Essere consapevoli del fatto che la cinetica dell'immobilizzazione dipende anche da proprietà liposomiche come dimensioni e carica e dovrebbe quindi essere sempre ottimizzata per ogni formulazione liposoma.

4. Acquisizione di immagini

NOTA: Questa sezione dipenderà molto dal sistema di microscopio disponibile per il ricercatore che esegue l'esperimento. Pertanto, verranno descritte le linee guida generali su come eseguire l'imaging. Tuttavia, le impostazioni esatte e come applicarle variano tra le diverse configurazioni del microscopio. Ad esempio, alcuni sistemi consentono di scegliere qualsiasi combinazione di filtri di emissione desiderata, mentre altri microscopi sono dotati di specifici filtri preimpostati.

1. Impostare il microscopio per l'imaging di singoli liposomi. Per garantire una qualità ottimale dell'immagine e la successiva analisi dei dati, utilizzare un'alta risoluzione in scala di grigi e uno schema di pixel che consente di sovracampionare i singoli liposomi. Si consiglia una profondità di bit di 16 e almeno 1.024 x 1.024 pixel per un'area di 50 m x 50 m. Se disponibile, la media lineare può essere applicata in modo positivo per ridurre il rumore (ad esempio, 3 scansioni per linea).
2. Selezionare una potenza laser di eccitazione che assicura uno sbiancamento non significativo da fotogramma a telaio e un segnale abbastanza forte da discriminare chiaramente i singoli liposomi dallo sfondo. L'impostazione ottimale dipenderà dal microscopio specifico utilizzato e dalla combinazione di fluoroforo. Assicurarsi che i rivelatori non siano saturi, in quanto ciò spreficherà la quantificazione dell'intensità.
3. L'imaging dei fluorofori DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 nei liposomi richiede l'imaging di più canali. Pertanto, assicurati che ogni canale sia imaged in sequenza per evitare l'eccitazione incrociata. Ad esempio, prima prendere un'immagine emozionante a 488 nm e la lettura emissione a 495-560 nm. Successivamente, scatta un'altra immagine emozionante a 633 nm ma leggendo l'emissione solo a 660-710 nm. Le specifiche dipenderanno dal sistema di microscopio (ad esempio, quale laser e filtri) disponibile.
4. Assicurarsi di coprire diverse aree della superficie, acquisendo almeno 10 immagini del campione, creando così almeno 3.000 singoli liposomi. Se la densità della superficie è inferiore a 300 liposomi/fotogramma, acquisire più immagini. Assicurarsi di rifocalizzare il microscopio per ogni nuova immagine.
   NOTA: per l'imaging a due canali, assicurarsi di assegnare un nome ai file di immagine in modo che le coppie di immagini con gli stessi liposomi in diversi canali di fluorescenza possano essere facilmente identificate durante l'analisi dei dati.
5. Per quantificare l'incertezza sperimentale relativa alla misurazione dell'inomogeneità compositiva, immaginare la stessa area dei liposomi prima e dopo la rimessa a fuoco (vedere la figura 3 e la descrizione nel testo).
6. Esportare le immagini dal software al microscopio come file .tiff. Esportare singolarmente i due canali degli stessi liposomi.

5. Analisi dei dati

NOTA: le routine di montaggio 2D Gaussian autoprogettate appositamente sviluppate sono state precedentemente impiegate^6,11,12. Tuttavia, per aumentare l'applicabilità del metodo viene descritto un processo di analisi dei dati che può essere facilmente implementato in tutti i laboratori.

1. Caricare la corrispondente coppia di immagini .tiff di due diversi canali di fluorescenza nello stesso campo di imaging nel software FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
2. Nel menu Immagine scegliere Coloree utilizzare la funzione Unisci canale per creare una composizione dei due canali.
3. Osservare se i liposomi immagine in due canali diversi mostrano una buona colocalizzazione o se si è verificata una deriva visibile.
   NOTA: in caso di deriva tra i due canali di fluorescenza (riconosciuto come offset X-Y sistematico ed uguale tra il segnale nei due canali), uno dei fotogrammi può essere tradotto utilizzando la funzione Trasforma > Traduci nel menu Immagine di FIJI. Tuttavia, è necessario prestare attenzione con tale manipolazione dell'immagine. Si raccomanda quindi di evitare il più possibile la deriva quando si immaginano i liposomi.
4. Assicurati che il plugin ComDet (v.0.3.6.1 o versione successiva) sia installato, o fai questo nel menu Plugin.
5. Aprite il plugin ComDet per rilevare le particelle accedendo al menu Plugin e scegliendo ComDet v.0.3.6.1 > Rileva particelle.
6. In ComDet, assicurarsi di scegliere singolarmente la funzione Rileva particelle su entrambi i canali. Impostare la distanza massima tra macchie co-localizzate in modo simile alla dimensione particella approssimative. Di solito, 4 pixel è appropriato per le impostazioni descritte qui.
7. Il rapporto segnale-rumore dovrebbe consentire il rilevamento di particelle anche dim con una bassa quantità di fluorescenza. In ComDet, impostare questo rapporto su 3 impostando la sensibilità del rilevamento in entrambi i canali su Particelle molto dim (SNR n. 3).
   NOTA: Anche se questo valore SNR è di solito appropriato, potrebbe essere necessario impostarlo più in alto (ad esempio, se c'è molto rumore dell'immagine che può essere identificato come liposomi e portare a falsi positivi).
8. Assicurarsi che le caselle con Calcola co-localizzazione e Stampa particelle rilevate in entrambi i canali siano selezionate, prima di premere OK.
9. Dopo aver eseguito l'analisi, verranno visualizzate due finestre popup con Risultati e Riepilogo. Esportare la tabella dati Risultati contenenti i dati di co-localizzazione (coordinate delle particelle e intensità integrata di ogni particella rilevata) in un software di gestione dei dati di scelta salvando la tabella come file .txt e importandola nel software.
10. Assicurarsi che ogni liposoma sia incluso una sola volta nel set di dati e non sia il rapporto channel1/channel2 che il rapporto channel2/channel1. In questo modo, filtrare i dati in modo che solo Abs_frame 1 venga tracciato nel passaggio 5.11.
    NOTA: scegliendo Colocalizzato 1, i falsi positivi provenienti dal rumore nelle immagini possono essere rimossi dall'analisi. Tuttavia, qualsiasi liposomaconsina con uno solo dei due componenti fluorescenti presenti sarà esclusa dall'analisi, rimuovendo così potenzialmente importanti punti dati dall'analisi.
11. Tracciare un istogramma della colonna con i dati contenenti il rapporto di intensità per ogni liposoma rilevato.
12. Il grado di inomogeneità compositiva per il sistema liposomico studiato è rappresentato dalla larghezza della distribuzione del rapporto di intensità. Per quantificare l'omogeneità, inserire l'istogramma del rapporto di intensità con una funzione gaussiana ed estrarre la media (sima) e la deviazione standard (sigma). Vedere la sezione Risultati rappresentativi.
13. Un valore per il grado di inomogeneità (DI) può ora essere calcolato utilizzando il coefficiente di variazione definito come DI : sigma / sigma .

6. Calibrazione delle dimensioni del liposoma

1. Estrarre parte del brodo lipososo ed estromettere 21x attraverso un filtro in policarbonato da 50 nm, come descritto nel passaggio 1.10.
2. Diluire i liposomi aggiungendo 10 l della sospensione lipososo a 800 l di tampone sorbitolo in un tubo di microcentrifuga.
3. Trasferire il campione liposomadio diluito in una cuvette monouso in polipropilene.
4. Misurare le dimensioni utilizzando la dispersione dinamica della luce (DLS). Eseguire almeno tre piste indipendenti per misurare le dimensioni e la polidisità della sospensione liposoma.
   NOTA: Se necessario, utilizzare una sospensione liposomica più concentrata per la misurazione. Per misurare le dimensioni dei liposomi è possibile applicare anche alternative alle DLL (ad esempio, l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle). Una descrizione di come eseguire tale determinazione delle dimensioni delle particelle esula dall'ambito di questo protocollo.
5. Immagine dei liposomi di calibrazione sul microscopio utilizzando esattamente le stesse impostazioni sperimentali definite nei passaggi 4.1 e 4.2.
6. Estrarre l'intensità integrata per ogni liposoma di calibrazione nelle immagini di calibrazione: estrarre il foglio dei risultati filtrati contenente intensità di fluorescenza liposomica, come descritto nei passaggi 5.1.5.10. Dalla tabella dei risultati, estrarre la colonna "IntegratedInt".
7. Poiché l'intensità totale integrata di un liposoma etichettato nella sua membrana è proporzionale alla superficie del liposoma ed è quindi proporzionale al quadrato del suo diametro, tracciare un istogramma di intensità radice quadrata dell'intensità di fluorescenza del liposomi di calibrazione.
8. Montare l'istogramma di intensità integrato prodotto al punto 6.7 con una distribuzione normale del tronco ed estrarre l'intensità media di fluorescenza dei liposomi di calibrazione.
9. Per determinare la relazione tra l'intensità della radice quadrata (Int_Sqrt) e la dimensione del liposoma, calcolare il fattore di correzione (C) utilizzando il diametro liposomamedio medio (Dia) pesato in base al numero ottenuto dalle misure DLS: Dia x C x Int_Sqrt è equivalente a C - Dia / Int_Sqrt.
10. Calcola i valori Int_Sqrt per i liposomi nell'esperimento di inomogeneità compositiva e convertili in diametri moltiplicandolo con il fattore di correzione.
11. Tracciare il valore del rapporto di intensità in funzione del diametro per i liposomi di inomogeneità compositiva, ottenendo così l'inomogeneità in funzione delle dimensioni liposomiche per una popolazione di liposomi che vanno da circa 50 nm-800 nm.

Risultati

Seguendo il protocollo descritto è possibile l'immagine di singoli liposomi in modo parallelo massiccio (Figura 1). Il successo dell'immobilizzazione superficiale dei liposomi dovrebbe essere immediatamente evidente dopo l'aggiunta della soluzione liposomica alla camera (passaggio 3.6 nel protocollo) come diffrazione punti di intensità limitata dovrebbero apparire nell'immagine (Figura 1B e

Discussione

È importante notare che mentre descriviamo in dettaglio come il singolo assaggio di liposomi può essere utilizzato per studiare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi, la piattaforma è molto versatile. Come precedentemente mostrato e discusso nell'introduzione, il protocollo può essere facilmente adattato per studiare gli aspetti della fusione membrana-membrana, delle interazioni proteina-membrana o della caratterizzazione del vettore di farmaci liposomici. Per qualsiasi problema scientifico affrontato, i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ