定量荧光显微镜为基础的单脂体测定，用于检测单个脂质体之间的成分不均匀性

摘要

该协议描述了脂体的制造，以及如何用荧光显微镜将这些脂体固定在表面上，并单独以大规模平行的方式成像。这允许定量种群单脂质体之间的大小和组成不均匀性。

摘要

大多数使用脂体作为膜模型系统或药物输送载体的研究都依赖于批量读出技术，因此在本质上假定整体的所有脂体都是相同的。然而，能够在单粒子水平上观察脂质体的新实验平台使得对单个脂质体的蛋白质膜相互作用或药物载体特性进行高度精密的定量研究成为可能，从而避免从集合平均错误。在这里，我们提出了一个协议，用于准备，检测和分析单脂体使用荧光为基础的显微镜测定，促进这种单粒子测量。该设置允许以大规模并行方式成像单个脂质体，并用于揭示样品内大小和成分不均匀性。此外，该协议还描述了在单脂体水平上研究脂体的优点、测定的局限性以及修改其以研究其他研究问题时需要考虑的重要特征。

引言

脂质体是以球面磷脂为基础的囊泡，在基础和应用研究中被大量使用。它们作为优秀的膜模型系统，因为它们的物理化学性质可以很容易地通过改变组成脂质体^1，2的脂质成分来操纵。此外，脂体构成最常用的药物输送纳米载体系统，提供改进的药代动力学和药效学以及高生物相容^性3。

多年来，脂体主要使用散装技术进行研究，仅允许访问整体平均读出值。这导致大多数这些研究假设，在集合中的所有脂体是相同的。但是，仅当基础数据集在平均值周围均匀分布时，此类集合平均值才正确，但如果数据集包含多个独立总体，则可以表示错误和偏置的结论。此外，假设表示整个人群的合奏意味着可以忽视脂质体之间不均匀性中蕴藏的信息。直到最近才出现能够探测单脂质体的定量测定，揭示了单个脂质体之间相对于重要的物理化学特性（包括脂质体大小^4、脂质组合^物5、6和封装效率^7）之间的大不均匀性，突出了在单脂质体水平上研究脂质体的重要性。

一个研究领域，其中脂质体特性的一组平均已被证明有偏差的结果是研究脂质体大小依赖蛋白膜相互作用^8，9。传统上，研究此类过程的研究人员仅限于通过不同孔径的过滤器，以制备不同集合平均直径的脂质体^。然而，使用单脂体测定提取单个脂体直径后发现，脂体种群重叠较大，使用100nm和200nm滤波器拉伸的脂体在其大小分布⁴中显示高达70%的重叠。这可能严重偏置脂体大小依赖蛋白膜相互作用的批量测量^10。研究人员使用单脂体测定法进行膜蛋白相互作用研究，而是利用样品中的大小-多分散性，允许他们在每个实验中研究广泛的脂质体直径，从而促进新发现膜曲率和组成如何影响膜^4、11、12的蛋白质招募。单脂体测定的应用证明有用的另一个领域是蛋白质介导膜融合的力学研究^13，14。对于这种动力学测量，研究单个融合事件的能力减轻了对融合过程的实验同步的需要，使得新的机械洞察力，否则在散装集合测量中完成的时空平均中会丢失。此外，单脂体已被用作膜支架，允许测量单个蛋白质，并提供跨膜蛋白结构动力学的新知识^15，16。此外，这种基于蛋白酶体的设置使得研究单个跨膜输送机¹⁷和孔隙形成蛋白复合物¹⁸的功能以及生物活性膜渗透肽¹⁹的机理成为可能。单脂质体也被用作软物质纳米流体，表面固定单脂质体作为^10-19 L体积的酶反应室，以最小的产品消耗²⁰增加筛选测定的通量和复杂性。

最近，单脂体测定已用于在以前未预先拟定的细节水平上对药物输送脂量体进行特征化。研究人员能够量化附着在单个脂质体表面的聚合物数量中显著的不均匀性^。单脂体测定还允许在复杂的介质（如血浆）中测量药物输送脂质体，揭示当脂质体暴露于模仿体内循环过程中经历的条件^时，通过脂质锚锚锚定位到脂质体表面的元素如何容易分离。总体而言，单脂体测定的多功能性和实用性得到了这些装置用于解决的各种问题的证实，我们设想，该方法将继续开发，并在新的科学领域得到应用。

在这里，我们描述了一种基于荧光显微镜的单脂体测定，它允许以高通量方式研究单个脂体（图1）。为了说明该方法，我们用它来量化集合中单个脂质体之间的大小和组成不均匀性。该测定采用荧光显微镜成像单脂质体固定在钝化玻璃表面。我们首先描述了脂体制造过程中的关键步骤，以确保适当的荧光脂体标记和固定。然后，在概述确保适当脂体表面密度的程序之前，我们描述了促进脂体固定所需的表面制备。我们讨论了对获取高质量图像非常重要的显微镜参数，并描述如何执行简单的数据分析，允许提取脂质体大小和成分不均匀性。此通用协议应为感兴趣的研究人员为进一步开发其特定研究兴趣的测定提供良好基础。

研究方案

1. 脂体制备

注:简要地说，脂质体制备通常包括三个关键步骤:1）制备所需脂质成分的干脂膜;2） 脂质的补液形成脂质体;3） 控制脂质体种群的大小和粒度。

1. 称量脂质并将其溶解在玻璃瓶中的三丁醇:水（9:1）。
   1. 溶解POPC（1-棕榈-2-醇-甘油-3-磷胆碱）;MW = 760 g/mol） 至 50 mM。
   2. 将胆固醇 （MW = 387 g/mol） 溶解到 25 mM。
   3. 溶解 DOPE-Atto488 （1，2-二氧化二基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-阿托488;MW = 1，316 克/摩尔至 0.1 mMM。
   4. 溶解 DOPE-Atto655 （1，2-二氧化二基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-阿托655;兆瓦 = 1，368 克/摩尔至 0.1 mMM。
   5. 溶解 DSPE-PEG2000-生物素 （1，2-二乙酰亚胺-sn-甘油-3-磷酸盐胺-N-生物素（聚乙烯乙二醇）-2000];MW = 3，017 克/摩尔至 0.1 mMM。
      注:将脂质加热至55°C，使用磁性搅拌，以确保脂质完全溶解。或者，使用声波浴。未使用的脂质储存可在-20°C下储存数月。
2. 将步骤 1.1 中制备的脂质与 POPC 的摩尔比混合:胆固醇:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-生物素 68.95:30:0.5:0.05:0.0.05，加入 138 μL 的 POPC、120 μL 胆固醇、500 μL 每个荧光标签脂质和 50 μLDSPE-PEG-生物锡到新鲜的玻璃瓶。
   注: 精确的脂体组合物可以很容易地修改，以解决特定的兴趣问题。有关详细信息，请参阅讨论。
3. 松开玻璃瓶盖，将小瓶卡在液氮中。
4. 隔夜冻血脂混合物冻血。
5. 在干脂质中加入1 mL的200 mM D-山梨醇缓冲液（山梨醇缓冲液）。
6. 将混合物加热至45°C，并暴露于磁性搅拌中至少1小时。
   注:缓冲液应反映正在处理的具体问题（例如，用于研究膜蛋白相互作用的生理条件，或用于研究药物输送脂质体的特定临床批准的缓冲液）。然而，如果研究不需要特定的缓冲液，则无离子的缓冲液可以应用进行补液，以减少脂质体多层。
7. 将小瓶浸入液氮中，冻结脂质悬浮液，并等待悬浮液完全冻结。
8. 将冷冻悬浮液浸入加热槽中，温度为55°C，直到混合物完全解冻。
9. 重复步骤 1.7 和 1.8，直到脂体悬浮液总共暴露于 11 个冻结/解冻周期。
   注:重复的冻结/解冻周期已证明能降低脂质体多层体^23，这对单脂体测定的准确性至关重要，因为多层脂质体会偏向荧光强度与脂质体脂质体大小比。当在配方中包括超过0.5%的PEGylate脂（如通常在药物输送的脂质体中做^）24时，多脂性通常就天生就很低。
10. 使用迷你挤出套件，通过 800 nm 聚碳酸酯过滤器挤出脂体悬浮液一次。按照制造商关于装配挤出套件的说明操作（参见材料表）。
11. 将脂体储存在4°C过夜。

2. 成像室的表面准备

1. 在10mM HEPES（4-（2-羟基乙二醇）-1-管乙酸）中制备牛血清白蛋白（BSA;1mg/mL）、BSA-生物素（1毫克/升）和链球蛋白（0.025mg/mL）。
   注:为了防止脂质体爆裂，用于补液的山梨醇缓冲液和用于表面制备的HEPES缓冲液应为同用。因此，建议在实验前检查缓冲区的渗透性。
2. 将 1，200 μL 的 BSA 和 120 μL 的 BSA-生物锡混合，并在 8 口井幻灯片中将 300 μL 的混合物添加到每口井中，用于显微镜。
   注:在这里，我们使用市售的8井显微镜幻灯片与玻璃底部（见材料表），但该协议可以很容易地适应定制的显微镜室。
3. 在室温 （RT） 下孵育幻灯片 20 分钟。
4. 用 300 μL 的 HEPES 缓冲液清洗幻灯片 8x。
   注意:小心不要离开没有缓冲液的油井超过几秒钟，因为干燥表面会损坏油井。此外，请注意不要用移液器尖端划伤表面，因为这也会损害表面。因此，当从井中吸气缓冲时，从边缘或角落进行吸气。
5. 加入250 μL的链球菌，在RT孵育10分钟。
6. 重复步骤 2.4 中描述的 8 次。
7. 将显微镜滑块与 300 μL 的山梨醇缓冲液存放在每口井中，温度为 4°C。溶剂的蒸发会损坏表面，因此请将显微镜幻灯片放入培养皿中，并用副膜密封，除非立即使用准备好的幻灯片。

3. 脂体固定

1. 在山梨醇缓冲液中将脂质悬浮液稀释至约20μM总脂质。第1节中的程序将产生约10 mM总脂质的脂质悬浮液。
2. 将幻灯片放在显微镜上，并使用来自玻璃/缓冲器接口的增强的激光反射信号作为引导，将幻灯片聚焦在造型室表面。
3. 用 300 μL 的新鲜 HEPES 缓冲液清洗腔室 4x。
4. 将10μL的稀释脂质体（20μM总脂质）加入微离心管。
5. 从腔室中拿出100μL的缓冲液，加入步骤3.4中制备的微离心管中，正确混合，并将110μL放回腔室。
6. 将标本放在显微镜下，并使用能够检测来自脂体荧光酸量的信号的基本显微镜设置来观察表面固定的脂体。
7. 针对同时稀疏的脂体表面密度，该密度足以识别单个脂体，密度足以促进高通量测量。通常使用 50 μm x 50 μm 视场，每帧 300-400 个脂量体是最佳（图 2）。这通常可以在 5-10 分钟内实现。
   注:如果仅在视野中检测到快速移动的荧光颗粒，则可能是对固定过程至关重要的任何成分（BSA-生物锡、链球菌、DOPE-PEG-生物锡）的缺乏或浓度过低。如果未检测到脂体，则可能与脂量体浓度低、荧光检测设置不当或可能使用不在玻璃表面的焦平面进行成像有关。
8. 一旦达到适当的脂体表面密度，用200 μL的HEPES缓冲液清洗腔室3倍。
   注:请注意，固定动力学还取决于脂质体特性，如大小和电荷，因此应始终针对每种脂质体配方进行优化。

4. 图像采集

注:本节将在很大程度上取决于执行实验的研究人员可用的显微镜系统。因此，将介绍有关如何执行成像的总体指南。但是，确切的设置和如何应用它们将因不同的显微镜设置而异。例如，某些系统允许选择所需的任何发射滤波器组合，而其他显微镜则配备特定的预设滤波器。

1. 设置显微镜，用于成像单个脂体。为了确保最佳图像质量和后续数据分析，请使用高灰度分辨率和允许过采样单个脂质体像素方案。对于 50 μm x 50 μm 区域，建议位深度为 16 和至少 1，024 x 1，024 像素。如果可用，可以有效地应用线平均来降低噪声（例如，每行 3 次扫描）。
2. 选择激励激光功率，既可确保无显著帧到帧漂白，又具有足够强的信号，可以清楚地区分背景中的单个脂质体。最佳设置取决于所使用的特定显微镜以及荧光酸组合。确保探测器未饱和，因为这将偏置强度定量。
3. 在脂体中成像 DOPE-Atto488 和 DOPE-Atto655 荧光道需要成像多个通道。因此，请确保每个通道按顺序成像，以避免交叉激发。例如，首先在 488 nm 处激发图像，在 495–560 nm 处读取发射。之后，在 633 nm 时以刺激性拍摄另一幅图像，但仅在 660–710 nm 处读取发射。具体细节将取决于可用的显微镜系统（例如，哪些激光器和滤波器）。
4. 确保覆盖表面的不同区域，获取至少 10 个样本图像，从而成像至少 3，000 个单独的脂体。如果表面密度低于 300 脂体/帧，则获取更多图像。确保对每一张新图像的显微镜重新聚焦。
   注:对于双通道成像，请确保为图像文件命名，以便在数据分析期间可以轻松识别不同荧光通道中具有相同脂质体的图像对。
5. 为了量化与测量成分不均匀性相关的实验不确定性，在重新聚焦之前和之后对脂质体的相同区域进行成像（参见图3和文本中的说明）。
6. 将图像从显微镜软件导出为 .tiff 文件。单独导出同一脂体的两个通道。

5. 数据分析

注:特别开发的自动化2D高斯配件例程以前曾被采用^{6，11，12。}然而，为了增加该方法的适用性，描述了一个可在所有实验室轻松实施的数据分析过程。

1. 将同一成像场中两个不同荧光通道的相应一对 .tiff 图像加载到 FIJI（FIJI 只是图像J）软件中。
2. 在"图像"菜单中，选择"颜色"，并使用"合并通道"功能创建两个通道的复合。
3. 观察在两个不同的通道中成像的脂体是否显示良好的共定位，或者是否发生了可见漂移。
   注:在两个荧光通道之间漂移的情况下（识别为两个通道中信号之间的系统且相等的 X-Y 偏移），可以使用 FIJI图像菜单中的变换 > 翻译函数转换其中一个帧。但是，在操作此类图像时应小心谨慎。因此，建议在成像脂体时尽量避免漂移。
4. 请确保安装了 ComDet 插件（v.0.3.6.1 或更高版本），或在插件菜单中执行此操作。
5. 打开 ComDet 插件，通过访问插件菜单并选择ComDet v.0.3.6.1 > 检测粒子来检测粒子。
6. 在 ComDet 中，请确保单独选择两个通道上的检测粒子功能。设置与近似粒子大小类似的共定点之间的最大距离。通常，4 像素适用于此处描述的设置。
7. 信噪比应允许检测荧光量较低的暗颗粒。在 ComDet 中，通过将两个通道中的检测灵敏度设置为非常暗粒子 （SNR = 3）来将此比率设置为 3。
   注:虽然此 SNR 值通常合适，但可能需要将其设置得更高（例如，如果图像噪声可能被确定为脂质体并导致误报）。
8. 在按下"确定"之前，请确保选中两个通道中具有"计算共定位"和"绘制检测到的粒子"的框。
9. 运行分析后，将显示两个带有"结果"和"摘要"的弹出窗口。将数据表结果（包含共定位数据 （粒子坐标和检测到的每个粒子的集成强度） 导出到所选的数据处理软件，通过保存表作为 .txt 文件并将其导入到软件中。
10. 确保每个脂体只包含在数据集中一次，而不是同时包含通道1/通道2以及通道2/通道1比率。因此，在步骤 5.11 中仅绘制Abs_frame = 1的数据。
    注: 通过选择Colocalid = 1，可以从分析中删除图像中噪声中的误报。但是，任何只有两个荧光组分之一的脂体也将排除在分析之外，从而可能从分析中删除重要的数据点。
11. 使用包含每个检测到的脂量体的强度比的数据绘制列的直方图。
12. 所研究的脂质体系统的成分不均匀程度由强度比分布的宽度表示。要量化不均匀性，将强度比直方图与高斯函数拟合，并提取均值 （*） 和标准偏差 （sigma）。请参阅代表结果部分。
13. 现在可以使用定义为 DI = 西格玛 / = 的变异系数计算不均度 （DI） 的值。

6. 脂体尺寸校准

1. 如步骤 1.10 所述，拿出部分脂体库存，并通过 50 nm 聚碳酸酯过滤器挤出 21 倍。
2. 在微离心管中向800μL的山梨醇缓冲液中加入10μL脂体悬浮液，稀释脂体。
3. 将稀释的脂质体样品转移到聚丙烯一次性比色皿中。
4. 使用动态光散射 （DLS） 测量大小。执行至少三次独立运行，以测量脂质体悬浮液的大小和多分散性。
   注:如有必要，使用更浓缩的脂体悬浮液进行测量。DLS 的替代品（例如纳米粒子跟踪分析）也可用于测量脂质体的大小。有关如何执行此类粒子大小确定的说明超出了此协议的范围。
5. 使用步骤 4.1 和 4.2 中定义的完全相同的实验设置，在显微镜上成像校准脂量体。
6. 提取校准图像中每个校准脂质体的集成强度:提取包含脂质体荧强度的过滤结果表，如步骤 5.1_5.10 中所述。从结果表中提取"集成 Int"列。
7. 由于在其膜中标记的脂体的总综合强度与脂体的表面积成正比，因此与其直径的平方成正比，因此绘制出其荧光强度的平方根强度直方图。校准脂体。
8. 将步骤 6.7 中生成的集成强度直方图与对数正态分布配合，并提取校准脂体的平均荧光强度。
9. 要确定平方根强度 （Int_Sqrt）和脂体大小之间的关系，请使用平均脂体直径 （Dia） 计算校正系数 （C），以从 DLS 测量中获得的数字进行称重:直径 = C x Int_Sqrt等效于 C = 直径 / Int_Sqrt。
10. 计算组合不均匀实验中的脂质体Int_Sqrt值，并通过与校正系数相乘将这些值转换为直径。
11. 将强度比值绘制为成分不均匀脂质体直径的函数，从而达到从大约 50 nm-800 nm 的脂质体总体的脂质体大小的函数的不均匀性。

结果

遵循所述协议，可以大规模并行方式对单个脂体进行成像（图1）。在将脂体溶液添加到腔室（协议步骤 3.6）时，脂体的成功表面固定应立即显现出来，因为衍射有限强度点应出现在图像中（图 1B和图 1C）。

为了实现良好的统计和利?...

讨论

需要注意的是，虽然我们详细描述了如何使用单脂体测定来研究单个脂质体之间的组成不均匀性，但该平台非常通用。如前面所示和介绍中讨论，该协议可以很容易地适应研究膜膜融合、蛋白膜相互作用或脂质体药物载体表征的各个方面。对于任何正在解决的科学问题，单脂质测定的力量在于能够检测合奏的各个成分，从而具有定量读出，而不是通过集合平均效应进行偏颇。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well microscopy slides (µ slides)	Ibidi	80827	Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit	Avanti Polar Lipids	610000	Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA	Sigma	A9418
BSA-Biotin	Sigma	A8549
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700000	Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)			ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488	Atto-Tech	AD488-165
DOPE-Atto655	Atto-Tech	AD655-165
DOPE-PEG-Biotin	Avanti Polar Lipids	880129	Traded trough Sigma
D-Sorbitol	Sigma	S-6021
Freeze-dryer			e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials	Brown Chromatography	150903	Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl	Honeywell Fluka	258148
Heating bath			Capable of heating to minimum 65C
Heating plate w. Magnet stirring			Capable of heating to minimum 65C
HEPES	Sigma	H3375
Liquid nitrogen			Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars	VWR	442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086 (EU)
Microscope			For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES	Sigma	H7006
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Honeywell Fluka	71686
POPC	Avanti Polar Lipids	850457	Traded trough Sigma
Streptavidin	Sigma	S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)	Honeywell Riedel-de Haën	24127
Ultrapure water			e.g. MilliQ