מערכת מבוא לדוגמא רב-תכליתית עם כניסה כפולה לניתוח ואימות ספקטרומטריית מסה פלזמה מרובת מצבים של חלקיק יחיד בשילוב אינדוקטיבי

Summary

כאן אנו מספקים פרוטוקול לשימוש במערכת כניסה כפולה לספקטרומטריית מסה מצומדת אינדוקטיבית של חלקיק בודד המאפשרת אפיון ננו-חלקיקים עצמאי סטנדרטי.

Abstract

ניתן לאפיין ננו-חלקיקים המכילים מתכת (NP) עם ספקטרומטר מסה פלזמה בצימוד אינדוקטיבי (ICP-MS) מבחינת גודלם וריכוז מספרם על ידי שימוש במצב החלקיק היחיד של המכשיר (spICP-MS). דיוק המדידה תלוי בהגדרה, בתנאי התפעול של המכשיר ובפרמטרים ספציפיים שנקבעו על ידי המשתמש. יעילות ההובלה של ה-ICP-MS היא קריטית לכימות ה-NP ובדרך כלל דורשת חומר ייחוס עם התפלגות גודל הומוגנית וריכוז מספר חלקיקים ידוע.

נכון לעכשיו, חומרי ייחוס NP זמינים עבור מתכות בודדות בלבד ובגדלים מוגבלים. אם חלקיקים מאופיינים ללא תקן ייחוס, התוצאות הן של הגודל והן של מספר החלקיקים עשויות להיות מוטות. לכן, פותח מערך כניסה כפולה לאפיון ננו-חלקיקים עם spICP-MS כדי להתגבר על בעיה זו. מערך זה מבוסס על מערכת החדרה קונבנציונלית המורכבת מנבולייזר פנאומטי (PN) לפתרונות ננו-חלקיקים ומחולל מיקרו-טיפות (μDG) לפתרונות כיול יוניים. ממשק חדש וגמיש פותח כדי להקל על הצימוד של μDG, PN ומערכת ICP-MS. הממשק מורכב מרכיבי מעבדה זמינים ומאפשר כיול, אפיון ננו-חלקיקים (NP) וניקוי הסידור, בזמן שמכשיר ה-ICP-MS עדיין פועל.

שלושה מצבי ניתוח עצמאיים זמינים לקביעת גודל החלקיקים וריכוז המספר. כל מצב מבוסס על עקרון כיול שונה. בעוד שאופן I (ספירה) ואופן III (μDG) ידועים מהספרות, אופן II (רגישות), משמש לקביעת יעילות ההובלה על ידי פתרונות סטנדרטיים יוניים אנאורגניים בלבד. זה לא תלוי בחומרי עזר NP. מערכת הכניסה מבוססת μDG המתוארת כאן מבטיחה רגישויות אנליטיות מעולות ולכן מגבלות גילוי (LOD) נמוכות יותר. ה-LODs תלויי הגודל שהושגו הם פחות מ-15 ננומטר עבור כל ה-NP (Au, Ag, CeO₂) שנחקרו.

Introduction

ספקטרומטרים של מסת פלזמה בצימוד אינדוקטיבי משמשים באופן נרחב לכימות גודל ומספר NP בדגימות ומטריצות שונות במה שנקרא מצב חלקיק בודד ^1,2,3. אופן החלקיק הבודד הוא פעולה של מערכת רכישת הנתונים עם זמן אינטגרציה או שהייה קצר. כל NP שנמדד מייצר אות משולב במרווח זמן זה (אירוע נמדד בספירה לשנייה: cps) אם נעשה שימוש בדילול הולם של תרחיף ה-NP כדי למנוע אירועים כפולים. תקן כיול, כמו גם הדגימה, מוכנסים בדרך כלל ל-ICP-MS באמצעות מערכת הכנסת דגימה קונבנציונלית המבוססת על ערפול פנאומטי (PN)⁴. עם זאת, כתנאי מוקדם, יש לקבוע את קצב זרימת הכנסת הדגימה ויעילות ההובלה (η) כדי לכמת במדויק את מסת המתכת לכל NP ולקבוע את ריכוז המספרים שלהם במתלה. יעילות ההובלה מתארת את היחס בין המסה או מספר החלקיקים המוזרק למסה (שיטת איסוף פסולת)) או מספר החלקיקים (שיטת הספירה) שזוהה על ידי ICP-MS⁵. יעילות ההובלה נקבעת לרוב באמצעות חומרי ייחוס מבוססי ננו-חלקיקים⁵. עם זאת, תכונות הובלה תלויות במבנה ה-NP, וכוללות תכונות כמו הרכב ומפזר דגימה. גורמים משפיעים נוספים הם פרמטרים אינסטרומנטליים, כמו קצב קליטת הדגימה, קצב זרימת גז הנבולייזר, זמן השהייה וזמן המדידה הכולל.

מכיוון שרק חומרי ייחוס ננו-חלקיקים מוגבלים זמינים, תוצאות ניתוח ה-NP המתקבלות יכולות להיות מוטות עקב הבדלים בהרכב היסודות בין חלקיקי ייחוס לדגימה. מלבד הזמינות של מגוון מוגבל של חומרי ייחוס, זיהוי אירועי חלקיקים מרובים לכל זמן שהייה של גלאי מהווה אתגר נוסף. זה עשוי להשפיע גם על הדיוק של יעילות ההובלה שתיקבע.

כדי להיות בלתי תלויה בחומרי ייחוס, באופן אידיאלי, עדיפה מערכת החדרת מדגם עם יעילות הובלה של כמעט 100%. יחד עם זאת, כאשר משתמשים בנפח נמוך בהשוואה למערכות החדרה קונבנציונליות, ניתן להשתמש בריכוזי מספר חלקיקים גבוהים יותר. גם אם שני חלקיקים קרובים זה לזה, ניתן לזהות את שניהם בנפרד עם המערכת המבוססת על μDG.

ה-μDG מסוגל לייצר טיפות מונו-דיספיזציה בנפח קבוע בתחום ה-pL ומתאים היטב למטרה זו 6,7,8,9. ה-μDG מקל על הזרקת דגימות יוניות וחלקיקים בממיסים שונים לתוך ה-ICP-MS. במקרה של דגימות מתכת יוניות, ההנחה היא שהטיפות שנוצרות מומסות לחלוטין בדרך ל-ICP. בהתאם, הטיפה מאבדת את כל המים ונוצר חלקיק מהמלח שנותר. הקוטר של חלקיק זה עומד ביחס ישר לריכוז המשמש. לפיכך, ניתן לייצר תקני ייחוס תוצרת בית של אותה מטריצה, מסה וגודל, עם ריכוז משתנה של התמיסה היונית של ה-NP שיש לחקור, בבית. ניתן לחשב בקלות את נפח הטיפה על סמך קוטר הטיפה הנמדד על ידי μDG. זה לא אפשרי עם PN המייצר תפוצה רחבה של טיפות בקטרים שונים ^10,11. בשל הכנסת המדגם האחידה ביעילות הובלה גבוהה של 100% מה-μDG, ניתן להשיג רגישות אנליטית גבוהה ספציפית למכשיר. בהתאם למטריצה המשמשת, זה מוביל לגבולות גילוי נמוכים יותר (LOD) של מסת החלקיקים וגודלם בהשוואה לתוצאות של מערכות החדרה קונבנציונליות המבוססות על PN¹². עם זאת, בשל התכנון של ה-μDG, לא ניתן להחליף דגימות בקלות כאשר מערכת ICP-MS עדיין פועלת. בין מדידות של דגימות שונות, יש לנקות את ה-μDG ולאחר מכן לשטוף אותו עם תמיסת הדגימה לייצוב המערכת. בנוסף, הסובלנות שלו לדגימות מטריצה כבדות לא נבדקה במידה רבה. יתר על כן, בשל קצבי הזרימה הנמוכים ביותר, זמן הניתוח להשגת סטטיסטיקה טובה יהיה ארוך ביותר, מה שמגביל את השימוש המעשי בו, אם יש לנתח דגימות "אמיתיות", כמו למשל מים סביבתיים.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, ה-μDG הופעל בעבר בשילוב עם מערכת מבוססת נבולייזר פנאומטי קונבנציונלי, שקיבלה את השם של מערכת כניסה כפולה¹³. על ידי הכנסת תקני הכיול עם μDG ומתלה NP באמצעות נבולייזר פנאומטי לתוך ה-ICP-MS, Ramkorun-Schmidt ואחרים הצליחו לנצל את שתי המערכות¹³. הושגה קביעה מדויקת ביותר של חלק מסת המתכת של Au ו-Ag NP, ללא צורך בקביעת יעילות תחבורה. עם זאת, לא נקבעו ריכוזי מספר חלקיקים עם מערכת כניסה כפולה זו. כמו כן, ניקוי ויישור של מערכת μDG סיבכו את הישימות לניתוח שגרתי.

במאמר זה, אנו מציעים ממשק כניסה כפול גמיש לקביעת גודל חלקיקי NP וריכוז מספר החלקיקים ומדגימים את ההרכבה והשימוש המעשי בו. כמו המערכת של Ramkorun-Schmidt et al., היא מורכבת הן ממערכת μDG והן ממערכת החדרת דגימת PN. אנו מדגימים כי מערכת הכניסה הכפולה, בשלב הפיתוח הנוכחי שלה, מאפשרת יישום של שלושה מצבי ניתוח עצמאיים כדי לחקור ולאפיין NPs המכילים מתכת. מערכת הכניסה הכפולה שלנו מפשטת את הליך הכיול לקביעת NP ומשפרת את הנתונים האנליטיים של הכשרון בפרט את הדיוק¹⁴. מערכות הכניסה מאפשרות החלפת דגימה וניקוי נוחים של ה-μDG גם כאשר ה-ICP-MS עדיין פועל, ובכך מפחיתים את זמן הניתוח הכולל ואת הסיכון לאי-יישור. על מנת לבדוק את ביצועי המערכת, NP ייחוס מאופיין היטב (60 ננומטר AuNP - NIST 8013, 75 ננומטר AgNP - NIST 8017) משמשים לאימות והשוואה של השיטה.

Protocol

1. הרכבה של מערך מבוא לדוגמא עם כניסה כפולה

הערה: פרטים על חלקים שונים מוצגים בטבלה 1.

	רכיבים
חלק 1	מפרק כדורי כדורי נקבה מזכוכית באורך שוק של כ-10 מ"מ
	מפרק כדורי זכר מזכוכית באורך שוק של כ-10 מ"מ
	חתיכת T מתכתית (מידות: 1/4 אינץ')
	דבק זכוכית למתכת
	שני מהדקים למפרקי זכוכית כדוריים
חלק 2	תא ריסוס ICP-MS (סוג מומלץ: תא ריסוס חרוזי פגיעה, תא ריסוס ציקלוני או דומה)
	נבולייזר פנאומטי (סוג מוצע: נבולייזר קונצנטרי)
	קלאמפ
חלק 3	לפיד קוורץ חופשי טבעת O
	מחבר קו גז סגור
	מחבר קו גז קצה פתוח
	צינור סיליקון מוליך וגמיש
חלק 4	יחידת ייצור מיקרו טיפות פיזואלקטרית
חלק 5	יחידת בקרת מיקרו טיפות

טבלה 1: רשימת הרכיבים המשמשים לבניית מערך הכניסה הכפולה.

1. בניית יחידת מחבר T-piece (איור 1 חלק 1).
   הערה: חלק זה מחבר את מערכת הקדמת הדגימה הקונבנציונלית (שלב 1.2) ויחידת ההובלה μDG (שלב 1.3).
   1. הכנס מפרקי כדור זכר ונקבה לפתחים הנגדיים של מחבר T-piece.
   2. אבטח את מפרקי הכדור הזכרי והנקבי באמצעות דבק זכוכית למתכת (למשל, דבק סיליקון).
   3. חבר את מפרק הכדור הנשי למזרק של ה-ICP-MS באמצעות clamp.
2. חיבור של מערכת החדרת דגימה קונבנציונלית (איור 1 חלק 2)
   הערה: חלק זה מחובר ליחידת המחבר T-piece (שלב 1.1)
   1. שלב תא ריסוס ICP-MS עם נבולייזר פנאומטי (PN), המתאים לתא הריסוס שבו נעשה שימוש.
   2. השתמש ב-clamp כדי לחבר את יציאת תא הריסוס למפרק הכדור הזכרי של מחבר ה-T-piece (מתואר בשלב 1.1).
      הערה: יציאת תא הריסוס מצוידת בדרך כלל במחבר מפרק כדורי נקבה. השילוב המוצג באיור 1 מורכב מנבולייזר ותא ריסוס חרוזי פגיעה. במקום תא ריסוס חרוזי הפגיעה ניתן להשתמש בתאי ריסוס אחרים עם יעילות הובלה בטווח של 2 עד 10% ומעלה.
3. בניית יחידת הובלת המיקרו-טיפות (איור 1 חלק 3)
   הערה: חלק זה מחבר את יחידת המחבר T-piece (שלב 1.1) ואת יחידת μDG (שלב 1.4).
   1. חבר לפיד קוורץ הניתן להסרה, כשצינור המזרק שלו הוסר, למעמד מעבדה עם כניסת הלפיד בחלקו העליון באמצעות מהדקים מתאימים.
   2. חסום את כניסת הלפיד פלזמה/גז עזר על ידי מחברי גז סגורים.
      הערה: הדגימה מועברת באמצעות משאבה פריסטלטית לנבולייזר. גז ארגון משמש לערפול דגימה לתוך תא הריסוס ולהובלה נוספת לפלזמה.
   3. חבר קו גז הליום ללפיד דרך כניסת גז הקירור שלו באמצעות מחבר גז מתאים.
      הערה: גז ההליום המיושם משמש להמסת טיפות שנוצרו ומשמש כגז נדן המונע מהטיפה להתנגש בדפנות המערך ובמניעת החדרת חמצן אטמוספרי למכשיר ICP-MS בעוד שיש להסיר את ראש כניסת הדגימה של ה-μDG לצורך ניקוי והחלפת דגימות.
   4. חבר צינור סיליקון מוליך וגמיש באורך 30 ס"מ (מזהה 0.75 ס"מ), באמצעות מתאם, לקצה היציאה של הלפיד (תחתית הלפיד).
   5. חבר את הקצה כלפי מטה של צינור הסיליקון ליחידת המחבר T על ידי מתיחת צינור הסיליקון הגמיש על חיבור המתכת האנכי שנותר לו.
      הערה: צינורות הסיליקון הגמישים מאפשרים כוונון xyz של מכשיר ה-ICP-MS עם ההתקנה המחוברת.
4. חיבור יחידת יצירת המיקרו-טיפות ויחידת הבקרה ליצירת מיקרו-טיפות (איור 1 חלק 4, חלק 5)
   הערה: חלק זה מחובר ליחידת ההובלה μDG (שלב 1.3)
   1. חבר את יחידת ה-μDG המוכנה ליחידת הובלת המיקרו-טיפות על ידי הכנסת ראש ה-μDG לקצה כניסת הדגימה של הלפיד.
   2. חבר את ספק הכוח ליחידת הבקרה μDG.
      הערה: ההגדרה המתוארת כאן מורכבת מראש μDG זמין מסחרית וספק כוח μDG. בהתאם לראש μDG המשמש, יש להתאים את ההגדרה בהתאם.

2. כימות גודל הטיפות

1. השתמש באור סטרובוסקופ ובמצלמת CCD (למשל, בתצורה פתוחה, ראה איור 1 תצורת מדידת גודל) לצילום תמונות של טיפות המיוצרות על ידי μDG.
2. כייל את מצלמת ה-CCD על ידי צילום תמונות של אובייקט בגודל ידוע בטווח מיקרומטר (למשל, חוט נחושת בקוטר 150 מיקרומטר).
3. צלמו תמונות של לפחות 1,000 טיפות בהגדרות ששימשו לניסוי (ראו טבלה 2).
4. השתמש בתוכנה גרפית מתאימה (ראה טבלת חומרים) כדי להעריך את התמונות הנוגעות לאובייקט ולגודל הטיפה בשלבים הבאים:
   1. לחץ על File and Open כדי לטעון את תמונת האובייקט.
   2. לחץ על תמונה | התאם | סף להגדרת אזור האובייקט על-ידי הזזת פסי הגלילה.
   3. לחץ על החל כדי להחיל את ההגדרות.
   4. לחץ על כפתור הקטע הישר .
   5. לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו לצד האובייקט.
   6. הקש Ctrl + M כדי למדוד את גודל האובייקט.
   7. מדוד את קוטר האובייקט ב-5 נקודות שונות.
   8. העתק והדבק את הטבלה "תוצאות" בתוכנת גיליון אלקטרוני.
   9. חשב את הממוצע האריתמטי של העמודה "אורך".
   10. חשב את יחס הגובה-רוחב של הפיקסלים (PAR): גודל אובייקט בפועל (מיקרומטר)/גודל אובייקט ממוצע בתמונה (פיקסלים).
   11. לחץ על קובץ | יבוא | רצף תמונות כדי לייבא ולטעון את התמונות של הטיפות.
   12. לחצו על Rectangular וסמנו את ה-droplet של התמונה הראשונה.
   13. בצע את הלחיצה הימנית על משטח העכבר ובחר שכפל כדי להפריד את הטיפות של רצף התמונות משאר התמונה.
   14. הפרד את הטיפות מהרקע כמפורט בשלב 2.4.2.
   15. לחץ על תהליך | בינארי | שחק כדי להסיר השתקפויות אור על משטח הטיפות.
   16. לחץ על תהליך | בינארי | הרחב כדי להפוך את שלב ה"ארודה".
   17. לחץ על נתח | ניתוח חלקיקים | בסדר למדוד את כל הטיפות.
   18. העתק והדבק את הטבלה "סיכום" או "תוצאה" בתוכנת גיליון אלקטרוני.
   19. חשב את הממוצע האריתמטי של קוטר החמוס בפיקסלים.
   20. השתמש ב-PAR כדי לשנות את הקוטר במיקרומטר: קוטר חמוס ב-px/PAR.
       הערה: גודל הטיפות שנוצרו על ידי ה-μDG משתנה בהתאם לאורך ומשך הזמן שנבחר של הדופק הנוכחי המופעל על אלמנט הפיזו⁷.

3. הכנת מדגם

1. הכן תמיסת כיול יונית של האנליט שתימדד בטווח הריכוזים של 0.2 עד 20 מיקרוגרם/ליטר בחומצה מדוללת (למשל, HCl (0.5 v/v), HNO₃ (3.5 v/v)).
2. הכן תמיסה יונית לכיול חד-נקודתי בטווח הריכוזים שבין 1 ל-10 מיקרוגרם/ליטר בחומצה מדוללת.
3. הכן את המתלים הסטנדרטיים של NP בהתאם להוראות היצרן או לפרוטוקולים הפנימיים.
   הערה: שלבים 3.3.1 - 3.3.4 מסבירים את הכנת המתלים הסטנדרטיים של NP בהתחשב ב- Ag, Au,_{CeO 2} NPs כדוגמה.
   1. הכן 10 מ"ל של תמיסת AuNP של 0.05 מיקרוגרם/ליטר עבור ה-PN ותמיסת AuNP של 1 מיקרוגרם/ליטר במים טהורים במיוחד עבור μDG. מערבולת למשך 20-60 שניות לפני השימוש.
   2. הכן תמיסת AgNP של 0.05 מיקרוגרם/ליטר עבור ה-PN ותמיסת AgNP של 2 מיקרוגרם/ליטר, שניהם במים טהורים במיוחד, עבור μDG. יש לנער היטב במשך 20-60 שניות לפני השימוש^ב-15.
   3. הכן פתרונות CeO₂ NP לשימוש כמתואר קודם לכן עבור תחמוצות מתכת^16,17.
   4. הכן תמיסת 0.05 μg/L CeO₂ NP עבור ה-PN ופתרון 1 μg/L עבור μDG.
      1. שוקלים 25.6 מ"ג/מ"ל CeO₂ NP בכלי זכוכית של 15 מ"ל - 20 מ"ל בסך הכל ומוסיפים 10 מ"ל של תמיסת BSA של 0.05 (v/v) שהוכנה במים טהורים במיוחד.
      2. השתמש בסוניקטור בקצות האצבעות בהספק של 7.35 וואט כדי להומוגניזציה של תמיסת החלקיקים למשך 309 שניות.

4. כוונון אינסטרומנטלי ופרמטרים

1. ודא שמחולל ה-MDG כבוי וחבר את מערך ההקדמה לדוגמא עם כניסה כפולה שנבנה בשלב 1 עם המזרק של מכשיר ה-ICP-MS עם clamp. שטוף את מערכת הכניסה למשך 5 - 10 דקות עם גז הנבולייזר (Ar) וגז הובלת הטיפות (He).
   הערה: יש להגן על מכשיר ה-ICP-MS מפני חדירת רמות גבוהות של חמצן לחדר הפלזמה.
2. כבה את גז הובלת הטיפות (He) והפעל את מערכת ICP-MS
3. כוונן את המכשיר במצב המדידה שרוצים להשתמש בו באמצעות פתרון הכוונון הסטנדרטי של המכשיר שצוין על ידי יצרן מערכת ICP-MS.
   הערה: תמיסת כוונון סטנדרטית מורכבת, למשלample בריום, צריום, אינדיום, אורניום, ביסמוט, קובלט, ליתיום (כל 1 מיקרוגרם/ליטר) בתערובת של 2.5% (v/v) חומצה חנקתית ו-0.5% (v/v) חומצה הידרוכלורית.
4. קביעת קצב קליטת הדגימה של ה-PN.
   1. מלאו כלי ב -15 מ"ל מים.
   2. שקלו את הכלי.
   3. חבר את הכלי לצינור ה-PN.
   4. הפעל את המשאבה הפריסטלטית על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה של המשאבה הפריסטלטית בתוכנת המכשיר.
   5. התחל טיימר של 5 דקות.
   6. הסר את קו הקליטה מהכלי בדיוק לאחר 5 דקות. שקלו שוב את הכלי.
   7. חשב את קצב קליטת הדגימה (מ"ל/דקה) באמצעות הנוסחה: משקל כלי לפני - משקל כלי לאחר / משך זמן.
5. בצע אופטימיזציה של פרמטרים אינסטרומנטליים לשיפור רגישות האנליט במידת הצורך, למשל, קצב זרימת גז נבולייזר, עומק דגימה, כוח פלזמה.
   הערה: ראה טבלה 2 כדוגמה לפרמטרים אינסטרומנטליים הניתנים לאופטימיזציה במערכת ICP-MS.
6. כוונן את זרימת הגז עד שניתן לזהות קצב אות קבוע כפונקציה של קצב היווצרות הטיפה.

פרמטר	ערך
ICP – MS:
כוח פלזמה (W)	1600
עומק דגימה (מ"מ)	4
קצבי זרימה (L min-1):
גז עזר	0.65
גז קירור	14
זמנים (ים)
רכישת נתונים	1200
זמני שהייה (ים)	0.01
ממשק:
קצב קליטת דגימת PN (מ"ל מינימום-1)	0.21
גז נבולייזר (L min-1)	0.92
μDG:
קוטר נימי (מיקרומטר)	75
קצב ירידה (הרץ)	10
הוא איפור גז (L מינימום-1)	0.27
מצב פעולה	דופק משולש
	סט1	סט2	סט3
מתח (V)	53	51	47
רוחב דופק (μs)	20	25	12
עיכוב דופק (μs)	4	2	1

טבלה 2: ערכים של פרמטרים אינסטרומנטליים בשימוש.

5. מדידה רב-מצבית של דגימות ננו-חלקיקים

1. הכן את יחידת הבקרה μDG
   1. הפעל את מתג אספקת החשמל של יחידת הבקרה μDG.
   2. לחץ על התחל במסך הראשון כדי להפעיל את יחידת הבקרה.
   3. לחץ על הגדרות גלובליות כדי לבחור את מצב הדופק שבו יש להשתמש.
   4. לחץ על הכפתור הגרפי הימני במצב דופק כדי לבחור את מצב הדופק המשולש.
      הערה: ההגדרות עבור מצב הדופק המשולש ניתנות בטבלה 2.
2. הכן את יחידת μDG
   1. לחץ על On/Off כדי להפעיל את μDG.
   2. מלאו את כלי הדגימה בתמיסת הדגימה למדידה.
   3. חבר את כלי הדגימה ליחידת μDG.
   4. שימוש במזרק של 10 מ"ל לטיהור אוויר דרך הכלי ויחידת μDG.
   5. חבר את המזרק ליציאת המזרק בכלי המיכל לדוגמה.
   6. דחוף את בוכנת המזרק עד שנצפה זרם נוזלי קבוע היוצא מראש μDG.
   7. שמור על הלחץ למשך 10 שניות.
   8. הסר את המזרק.
   9. הנח את יחידת ה-μDG באזור המיקוד של מצלמת ה-CCD כדי לצפות בטיפות שנוצרו.
   10. חבר את מצלמת ה-CCD למחשב או למחשב נייד.
   11. הפעל את תוכנת מצלמת ה-CCD כדי לצפות בטיפות שנוצרו
   12. לחץ על התחל כדי לקבל תצוגה חיה של ה- droplets.
   13. שימו לב להיווצרות טיפות מתמדת.
   14. הנח את ראש ה-μDG על הלפיד ההפוך במערכת החדרת הדגימה הכפולה.
3. אמת את שניהם, את יחידת ה-μDG ואת ה-PN עבור כל אלמנט מעניין על ידי מדידת כיולים חוזרים ונשנים מרובי נקודות.
   הערה: לרכישת נתוני ICP-MS, השתמש בתוכנה המשויכת למכשיר.
4. קבע את הטווח הליניארי של הכיול הרב-נקודתי על ידי ייבוא הנתונים הניסיוניים לתוכנת גיליון אלקטרוני.
   1. חשב את הממוצע האריתמטי של כל נקודת כיול.
   2. קבע את מקדם היירוט, השיפוע והמתאם.
      הערה: עבור sp-ICP-MS מקדם המתאם צריך להיות >0.99¹⁸.
5. בחר ריכוז בתוך הטווח הליניארי של עקומות הכיול עבור כיולים של נקודה אחת בהמשך.
6. ביצוע השלבים שלהלן עבור מדידה ואימות (על ידי שימוש בחומרי ייחוס כמו NIST 8012, NIST 8013 או NIST 8017 או דומה) של כימות ננו-חומרים רב-מצביעים (איור 2).
   1. בחר ננו-חלקיק ותקן יוני בהתאם לאנליט המבוקש.
   2. הכן את יחידת ה-μDG לפי 5.2 עם תמיסה סטנדרטית יונית.
   3. הוסף תמיסת חומצה מדוללת (למשל, 0.5% v/v HCl) דרך ה-PN.
   4. התחל את המדידה של מערכת ICP-MS במצב פתרון זמן.
   5. לחץ על הפעלה/כיבוי לאחר 120 שניות כדי לעצור את ה-μDG ולהחליף את תמיסת החומצה המדוללת ב-PN עם התקן היוני.
   6. לאחר 330 שניות החלף שוב את התקן היוני ב- PN בתמיסת חומצה מדוללת.
   7. בינתיים הסר את יחידת μDG מההגדרה.
   8. החלף את כלי הדגימה (בקבוקון זכוכית) של יחידת ה-μDG בכלי המכיל תמיסת חומצה מדוללת (למשל, 3.5% HNO₃) על מנת לנקות את יחידת ה-μDG.
      1. מלאו מזרק של 10 מ"ל באוויר.
      2. חבר את המזרק ליציאת ההזרקה של יחידת μDG ורוקן את המזרק עד להופעת סילון נוזל מראש ה-μDG ושמור על לחץ למשך 30 שניות.
      3. הכן את ה-μDG כמפורט בשלב 5.2 עם ה-NP דגימה וחבר את יחידת ה-μDG בחזרה להגדרה ב-510 שניות.
   9. לחץ על הפעלה/כיבוי לאחר 810 שניות כדי לעצור את μDG.
   10. החלף את תמיסת החומצה המדוללת ב-PN עם דגימת ה-NP ומדוד עוד 300 שניות.
   11. הפסק את המדידה לאחר כ. 1,200 שניות.
   12. נקה את יחידת ה-μDG כמפורט בשלב 5.5.8.

איור 2: אסטרטגיית מדידה לכימות ננו-חומרים רב-מצבים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. ניתוח נתונים

הערה: כדי לפשט את כל שלבי החישוב, הוכן גיליון אלקטרוני מתאים (ראה קובץ משלים).

1. השתמש בגיליון אלקטרוני או בתוכנה שיכולים לטפל במסגרות נתונים כדי לעבד את הנתונים ולייבא את הנתונים הנמדדים. הדבק את ערכי העוצמה של המדידה כולה בתוכנת הגיליון האלקטרוני (הכלולה בתוספת האלקטרונית) בעמודה A, הנתונים יוצגו באופן חזותי. הזן את כל הפרמטרים הניסיוניים הדרושים לחישוב בטבלה "פרמטר קלט".
2. הגדר את אזורי העניין (ROI) עבור μDG יוני (I), PN יוני (II), μDG NP (III) ו-PN NP (IV) על ידי בחירת תאי הגיליון האלקטרוני המתאימים. שימוש בגרף בגיליון המוכן כדי להגדיר את גבולות ההחזר על ההשקעה ולהזין את הערכים בטבלה "קביעת אזור העניין" (תאים C1:E7).
3. העתק והדבק כל ערכת נתונים בעמודה נפרדת. לחץ על הכפתור העתק החזר ROI בגיליון המוכן כדי לפצל את המדידה לארבעת החזר ה-ROI (עמודה M:P).
4. חשב את הממוצע האריתמטי של I ו-II.
5. ליישם את הגישה האיטרטיבית להפרדת אותות חלקיקים או טיפות ורקע עבור III ו-IV.
   1. לחשב את הממוצע האריתמטי וסטיית התקן של כל הערכים הנמדדים.
   2. חשב ערך גבול או חתך לפי ערך ממוצע + 5*סטיית תקן.
   3. הסר את כל האותות הקטנים מערך הגבול של III ו-IV באמצעות הפקודה Cut באותות החלקיקים המזוהים. השתמש בהדבקה כדי להדביק אותם בעמודה נפרדת.
   4. חזור על שלבים 1-3 עד שהערך הממוצע וסטיית התקן יהיו קבועים.
      הערה: בעמודות Q עד BD של הגיליון המוכן, הגישה האיטרטיבית להפרדת אותות רקע וחלקיקים מתבצעת חמש פעמים.
6. לחשב את הממוצע האריתמטי של אותות החלקיקים המזוהים של III ו-IV.
7. חשב את גודל החלקיקים המינימלי הניתן לזיהוי (_גודל LOD - nm) עבור μDG NP ו- PN NP על ידי שימוש בגבול האינסטרומנטלי של זיהוי האנליט (LOD - ספירות), רגישות האנליט (S_{C, יוני} - ספירות/(μg/L)), קצב קליטת הדגימה (q_s - מ"ל/דקה), יעילות ההובלה (η - יחידה יחסית) וצפיפות החומר בתפזורת (ρ - g/cm³):
   1. 
   2. 
8. חשב את המסה (m_a,p) וגודל החלקיקים (d - nm, בהנחה שהחלקיקים כדוריים) של אותות חלקיקים מזוהים עבור μDG NP ו- PN NP על פי שלושת מצבי הניתוח המיושמים על ידי התחשבות בריכוז המתכת היונית של תמיסה סטנדרטית (c_a - μg / L) ושטף היונים בפלזמה (ספירה / שניות):
   1. מסה:
   2. גודל:
9. חשב את יעילות ההובלה הספציפית של מצבי הניתוח באמצעות מספר החלקיקים שזוהו (q_p), ריכוז החלקיקים של הדגימה (c_{p, בשימוש} - 1/mL), רגישות האנליט של ה-PN וה-MDG (S_{m, ionic, PN}, S_{m, ionic, MDG} - ספירות/(μg/L)), נפח הטיפה (_{V drop} - pL), זמן השהייה (t_d - ms), יעילות ההובלה של ה- PN (η_PN), יעילות ההובלה של μDG (η_μDG), עוצמת התמיסות היוניות הנמדדות על ידי ה- PN ו- μDG (I_{ionc, PN}, I_{ionic, μDG} - ספירות) וריכוז התמיסה היונית המשמשת לשתי מערכות ההזרקה (c_{ionic, PN}, c_{יוני, μDG} - μg/L):
   1. מצב I:
   2. מצב II:
   3. 
   4. 
   5. 
   6. 
10. נניח שיעילות ההובלה של μDG שווה ל-1:¹⁹
    1. 
11. חשב את ריכוז מספר החלקיקים של תמיסת ה-NP שנותחה על ידי התחשבות בנפח הדגימה המוזרק במהלך המדידה (V_מוזרק):
    
    הערה: בגיליון המוכן כל החישובים מבוצעים באופן אוטומטי לאחר הפיצול. התוצאות מוצגות בטבלה "פרמטרי פלט" (תאים BH7:BR35) ומכילות את הנוסחאות שתוארו לעיל כולל שלבי חישוב בודדים.

תוצאות

איור 3: קביעת גודל הטיפה עם מצלמת CCD. כיול מצלמת CCD עם חוט נחושת של 150 מיקרומטר (A) וקביעת גודל הטיפה לאחר המרת תמונות הטיפות שהושגו לתמונה צבעונית בינארית (B). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אימות הגדרת הכניסה הכפולה. כיול רב-נקודתי של מערכת הכניסה μDG (A) ו-PN (B) לזהב (Au), כסף (Ag) וצריום (Ce). הריכוז המשמש בטווח של 0.2 - 20 מיקרוגרם מ"^ל-1 מומר, בהתאם לתנאי הניסוי המשומשים במסה לכל אירוע שזוהה. הנתונים המוצגים הם הערכים הממוצעים של שלושה שכפולים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ייצוג מדידה עבור מערך הכניסה הכפולה. הכימות של CeO₂ NP עם פסים צבעוניים כפי שנעשה באיור 2 עבור שלבי ההזרקה השונים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לדוגמה	מצב ניתוח /	כניסה לדגימת NP	כניסה לתקני כיול	η	מא, פ	גודל NP (d)	#NPs		מחקר (%)
	η קביעת PN			(%)	(פ)	(ננומטר)	(מ"ל-1 x103)
Au 56 ננומטר	מצב-I /	PN	PN: תקני Au ionic ו-AuNP	1.8 (0.1)	1.9 (0.5)	57.2 (4.3)	28.1 (0)		100
NIST 8013	שיטת ספירה
	מצב-II /	PN	PN/μDG:	1.9 (0.1)	2 (0.4)	58 (3.6)	25.6 (1.6)		91
	יחס רגישות		תקנים יוניים
	מצב-III /	μDG	μDG:	100	1.7 (0.2)	55 (2.4)	394.4 (29.3)		70
	ημDG = 1		תקן יוני
גודל צפוי (ננומטר)						56.0 (0.5)
Ag 75 ננומטר	מצב-I /	PN	PN: תקני Ag ionic ו-AgNP	2.3 (0.2)	1.9 (0.2)	70.2 (2.3)	21.6 (0)		100
NIST 8017	שיטת ספירה
	מצב-II /	PN	PN/μDG:	2.5 (0.2)	2 (0.2)	71.5 (2.1)	20.5 (1.9)		95
	יחס רגישות		תקנים חקלאיים יוניים
	מצב-III /	μDG	μDG:	100	2.5 (0.2)	76.7 (2.3)	757.1 (68.7)		88
	ημDG = 1		תקן יוני חקלאי
גודל צפוי (ננומטר)						74.6 (3.8)
CeO2 JRC NM212	מצב-I /	PN	PN: תקני Ce יוני ו-AuNP	1.7 (0)	0.90 (0.09)	61.9 (2.0)	7.59 (0.32)		-
10-100 ננומטר	שיטת ספירה
	מצב-II /	PN	PN/μDG:	4.9 (1.4)	1.36 (0.35)	70.6 (5.9)	5.42 (1.7)		-
	יחס רגישות		תקנים יוניים Ce
	מצב-III /	μDG	μDG:	100	1.63 (0.62)	74.4 (9.2)	590 (168)		-
	ημDG = 1		תקן יוני Ce

טבלה 3: תוצאות הגדרת הכניסה הכפולה. יעילות הובלה, שבר מסת מתכת, קוטר וריכוז מספר NP עבור חומרי NP Au NIST 8013, Ag NIST 8017 ו-CeO₂ JRC NM 212 (n=3) תוך שימוש בשלושה מצבי ניתוח ושלוש שיטות קביעת יעילות תחבורה. אחוז ההתאוששות מוגדר כיחס בין #NPs שנקבע #NPs הצפוי. הטבלה מודפסת מחדש באישור הפניה¹⁴.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לקבוע את מסת החלקיקים וריכוז המספר. היווצרות טיפות μDG, כולל גודל הטיפות (איור 3) אופיינה מראש (טבלה 3).

לאחר הרכבת המערך (איור 1) וקביעת גודל הטיפה, שתי מערכות ההזרקה אומתו עם תקנים יוניים (איור 4). ניתן להשיג דיוק של r² > 0.99 עם שתי מערכות ההזרקה עבור כל האלמנטים שנחקרו. עם זאת, ישנם הבדלים בשתי המערכות בשל כמות האנליט המוכנסת והמועברת. מכיוון של-μDG יש נצילות הובלה גבוהה מאוד (עד 100%), רגישויות אנליטיות גבוהות יותר בהשוואה ל-PN נצפות עם כניסת מסה נמוכה בו זמנית. עם זאת, יש להפריד את הריכוזים הנמדדים שהוצגו על ידי μDG לשני טווחים ליניאריים. עבור Ag, ניתן לראות את הטווח הליניארי הראשון בין 0 ל-0.5 fg ^event-1 והשני בין 0.5 ל-fg ^event-1. לעומת זאת, הטווח הליניארי הראשון עבור Ce הוא בין 0 ל-0.25 fg ^event-1 והשני בין 0.25 ל-3 fg ^event-1. נראה שהטווח הליניארי של PN עבור הריכוזים הנמדדים גבוה יותר. סביר להניח שזה קשור להבדל של המסה שהוחדרה ל-ICP-MS לכל אירוע זיהוי. ה-μDG מזריק כמות אבסולוטית קבועה בנפח נמוך לכל טיפה ואירוע גילוי וכתוצאה מכך מסה מזוהה נמוכה יותר בהשוואה להכנסת דגימות עם ה-PN.

לאחר האימות המוצלח, ניתן לבצע ניסויים כמתואר באיור 2. תוצאה של ניסויים כאלה מודגמת באיור 5 לקביעת גודל החלקיקים וריכוז המספר של CeO₂ NP. כאן ניתן לזהות את האותות עבור הפתרונות היונים וה-NP שהוצגו באמצעות μDG ו-PN. קביעה משולשת בוצעה עבור כל החלקיקים שנחקרו.

הערכת הנתונים שהתקבלו בוצעה כמתואר לעיל ומסוכמת בטבלה 3. עבור ה-Au וה-Ag NP המשמשים לאימות מערך כניסת הדו-קרב ושלושת מצבי הניתוח, ניתן היה להשיג את גודל החלקיקים המוסמך וריכוז המספר עם כל מצבי הניתוח שבוצעו. גדלי החלקיקים הממוצעים המתקבלים עבור CeO₂ הם בין 10 ל -100 ננומטר, הטווח שצוין על ידי היצרן.

איור 1: תכנון מערך ממשק הכניסה הכפולה. חלק 1 - יחידת מחבר, חלק 2 - מערכת הקדמה קונבנציונלית, חלק 3 - יחידת הובלת מיקרו-טיפות, חלק 4 - יחידת ייצור מיקרו-טיפות, חלק 5 - יחידת בקרת מיקרו-טיפות, ותצורה פתוחה למדידת גודל טיפות כולל אור סטרובוסקופ ומצלמת CCD. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מטרת מערך הכניסה הכפולה שפותחה היא אפיון וכימות של NP בצורה מדויקת ככל האפשר לגבי גודלם וריכוז המספרים שלהם על ידי שימוש במצבי ניתוח שונים, ללא תלות באנליט שיש לחקור. על ידי שילוב של מערכת הובלת מסה נמוכה (pL) והובלת מסה גבוהה (עד 100%) (μDG) עם מערכת מבוא קונבנציונלית (PN) זה ניתן להשגה. על ידי שימוש במערך המוצג בעבודה זו, ניתן לקבוע את יעילות ההובלה המבוססת על יסודות ספציפיים הנדרשת לכימות מסת החלקיקים על סמך תקנים יוניים וללא תלות בחומרי ייחוס NP. בנוסף, ל-NPs שהוכנסו ל-ICP-MS עם ה-μDG יש התפלגות גודל חלקיקים צרה יותר (AuNP) או דומה (AgNP). אחרת, עבור CeO₂ נצפתה התפלגות גודל רחבה יותר עבור μDG וניתן לייחס אותה לפיזור הרב פיזור הגבוה יותר של הדגימה המנותחת. עקב הכנסת נפח נמוך ניתן לזהות שני NPs בנפרד זה מזה, שאחרת יתפרש כ-NP אחד בהגדרה הקונבנציונלית¹⁴.

היתרונות הנובעים מיחידת ההובלה μDG הם מידת הגמישות הגבוהה עקב צינורות הסיליקון הגמישים, המפשטים את יישור ההתקנה. ניתן לכוונן את הלפיד עם המזרק גם במהלך ההתקנה כשהוא עדיין מחובר ל-ICP-MS. זרימת הגז הנוספת המיושמת מונעת התנגשות של הטיפות שנוצרו על ידי ראש μDG עם קירות הצינורות²⁰. יתר על כן, גז He מאפשר הסרת ראש μDG במהלך חילופי הדגימה גם כאשר ICP-MS עדיין פועל. שמירה על ה-ICP במצב תפעולי היא חיונית למדידה יציבה וחזקה. מכיוון שיש לנקות ולשטוף את ראש ה-μDG עם כל דגימה או תקן חדש, זרימת He חיונית להפעלת מערכת הכניסה שהוצגה בעבודה זו. יתר על כן, יש לחבר נכון את כל חלקי מערך הכניסה הכפולה על מנת למנוע חדירת חמצן למערכת. על מנת להפחית את החמצן בהגדרה המוצגת, המערכת נשטפת עם הנבולייזר וגז הובלת הטיפות לפני הצתת הפלזמה למשך 5 עד 10 דקות לפחות.

כאשר הטיפות שנוצרו מגיעות ליחידת המחבר, הן מועברות לפלזמה על ידי זרם נוזלי מעורפל, המכונה גם מצב פלזמה רטובה. בהשוואה לשימוש בתנאי פלזמה יבשה, הדבר מוביל לתכולת נוזלים מוגברת של הפלזמה. כתוצאה מכך, עוצמת האות פוחתת כמו גם התנודות של האות עולות, כלומר סטיית תקן גבוהה יותר של אות המדידה הממוצע¹³. עם זאת, על ידי שימוש ב-μDG וריכוזים בטווח של 0.2 מיקרוגרם/ליטר ניתן לזהות אותות מעל הרקע. המסה המוזרקת המתאימה לכל טיפה היא בעלת תכולת מתכת נמוכה, הקרובה לגבולות הזיהוי של יסודות מסוימים (כלומר, Au, Ag, Ce). אם משתמשים בריכוזים שונים לכיול לאורך גבול זה, ניתן לצפות בשני אזורים ליניאריים עם חפיפה של כ-0.05 מיקרוגרם/ליטר עבור Ce ו-2 מיקרוגרם/ליטר עבור Ag. מתחת לאזור החופף, האותות הנצפים קרובים לרקע הספציפי לאלמנט²¹. מעל גבולות אלה ניתן לזהות את טווח העבודה הליניארי של ה-μDG. אפילו עם היכולת למדוד ריכוזים נמוכים, אי אפשר להבחין בין יונים ל-NP של אותו אנליט בתוך טיפה אם הם קיימים בו זמנית. אחרת, על ידי שימוש במערכת ההחדרה הקונבנציונלית ניתן לקבוע ולהפחית את הרקע היוני הממוצע מכל האותות כדי לקבל את אותות החלקיקים בלבד.

למערכת מבוססת MDG יש גם מספר מגבלות שניתן לעקוף חלקית על ידי יישום מערכת הכניסה הכפולה המוצעת. עם זאת, אם תדר הטיפות של μDG עולה על 50 הרץ, לא ניתן ליצור דפוס טיפה עקבי. הטיפות שנוצרו עלולות להתנגש ולכן מתרחשות חילופי אנליטים. ההתאמה הנכונה של קצבי זרימת הגז חשובה גם להובלה אמינה של הטיפה למערכת ICP-MS וכן להפעלה נכונה של ה-PN. מערכת הכניסה הכפולה המוצעת אינה תומכת כיום באוטומציה של הליך המדידה מכיוון שיש דרישה לשינוי ידני של פתרונות המדגם.

בעתיד, ניתן להשתמש ב-μDG לאפיון וכימות NPs במטריצות מורכבות ודגימות סביבתיות. כדי למנוע סתימה של μDG בגלל צמיגות התמיסה, המורכבות ומתח הפנים הגבוהים יותר, יש להשתמש בעיצוב ראש מתאים. בהתאם לתכנון ותפעול ראש ה-μDG של ספק הכוח, ייתכן שניתן יהיה ליצור טיפות המכילות מערכות דמויות-חלקיקים כגון תאים, מיצלות או נשאי שומנים שעבורם חומרי ייחוס סטנדרטיים אינם זמינים כלל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Au ionic (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85550.18E
Ag ionic (1000 mg L-1 stock)	Ultra Scientific, RI, USA	ICM-103
Ag NP (75nm, NIST 8017)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		no longer available
Au NP (60nm, NIST 8013)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		no longer available
Ce ionic (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85557.18E
CeO2 (10-100nm, NM212)	EU Joint Research Centre	NM212
Excel 2016	Microsoft
Fiji	ImageJ
Glass female spherical ball + Glass male ball	Fisher Scientific	12499016
HCl (emprove bio)	Merck, Germany	100317
ICP-MS spray chamber with ipact bead	LabKings	LK6-45013 (OEM 3600170)
Metal clamps for spherical glass joint	Fisher Scientific	11322015
Metal T-Piece	Swagelok	SS-4-VCR-T
Microdrop Dispenser Head, non heated	microdrop Technologies	944
Microdrop Dispensing System MD-E-3000	microdrop Technologies
MilliQ water (MilliPore gradient)	Merck MilliPore, Darmstadt, Germany
O-ring free quartz torch	Analytical West	450-301
PFA-ST concentric nebulizer	Elemental Scientific	ES-2042
Silicone Rubber Tubing - 60° Shore - Platinum Cured - Black	Silex
XIMEA Cam Tool	XIMEA