Sistema versátil de introdução de amostras de entrada dupla para análise e validação de espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado de partícula única multimodo

Resumo

Aqui, fornecemos um protocolo para o uso de um sistema de entrada dupla para espectrometria de massa acoplada indutivamente de partícula única, o que permite uma caracterização de nanopartículas independente padrão.

Resumo

As nanopartículas contendo metal (NP) podem ser caracterizadas com espectrômetros de massa de plasma indutivamente acoplados (ICP-MS) em termos de seu tamanho e concentração numérica usando o modo de partícula única do instrumento (spICP-MS). A precisão da medição depende da configuração, das condições operacionais do instrumento e dos parâmetros específicos definidos pelo usuário. A eficiência de transporte do ICP-MS é crucial para a quantificação do NP e geralmente requer um material de referência com distribuição de tamanho homogênea e uma concentração de número de partículas conhecida.

Atualmente, os materiais de referência NP estão disponíveis apenas para alguns metais e em tamanhos limitados. Se as partículas forem caracterizadas sem um padrão de referência, os resultados de tamanho e número de partículas podem ser tendenciosos. Portanto, uma configuração de entrada dupla para caracterizar nanopartículas com spICP-MS foi desenvolvida para superar esse problema. Essa configuração é baseada em um sistema de introdução convencional que consiste em um nebulizador pneumático (PN) para soluções de nanopartículas e um gerador de microgotículas (μDG) para soluções de calibração iônica. Uma interface nova e flexível foi desenvolvida para facilitar o acoplamento de μDG, PN e o sistema ICP-MS. A interface consiste em componentes laboratoriais disponíveis e permite a calibração, caracterização de nanopartículas (NP) e limpeza do arranjo, enquanto o instrumento ICP-MS ainda está em funcionamento.

Três modos de análise independentes estão disponíveis para determinar o tamanho das partículas e a concentração do número. Cada modo é baseado em um princípio de calibração diferente. Enquanto o modo I (contagem) e o modo III (μDG) são conhecidos da literatura, o modo II (sensibilidade) é usado para determinar a eficiência de transporte apenas por soluções padrão iônicas inorgânicas. É independente dos materiais de referência NP. O sistema de entrada baseado em μDG descrito aqui garante sensibilidades superiores do analito e, portanto, limites de detecção (LOD) mais baixos. Os LODs dependentes do tamanho alcançados são inferiores a 15 nm para todos os NP (Au, Ag, CeO₂) investigados.

Introdução

Os espectrômetros de massa de plasma indutivamente acoplados são amplamente utilizados para quantificar o tamanho e o número de NP em várias amostras e matrizes no chamado modo de partícula única ^1,2,3. O modo de partícula única é uma operação do sistema de aquisição de dados com um curto tempo de integração ou permanência. Cada NP medido produz um sinal integrado neste intervalo de tempo (evento medido em contagens por segundo: cps) se uma diluição adequada da suspensão NP foi usada para evitar eventos duplos. O padrão de calibração, assim como a amostra, são geralmente introduzidos no ICP-MS por meio de um sistema convencional de introdução de amostras baseado em nebulização pneumática (NP)⁴. No entanto, como pré-requisito, a taxa de fluxo de introdução da amostra e a eficiência de transporte (η) devem ser determinadas para quantificar com precisão a massa metálica por NP e determinar sua concentração numérica na suspensão. A eficiência de transporte descreve a relação entre a massa ou o número de partículas injetadas e a massa (método de coleta de resíduos)) ou o número de partículas (método de contagem) detectado pelo ICP-MS⁵. A eficiência de transporte é mais frequentemente determinada usando materiais de referência baseados em nanopartículas⁵. No entanto, as propriedades de transporte dependem da estrutura do NP e envolvem propriedades como composição e dispersante de amostra. Outros fatores que influenciam são parâmetros instrumentais, como taxa de absorção da amostra, taxa de fluxo de gás do nebulizador, tempo de permanência e tempo total de medição.

Uma vez que apenas materiais de referência nanoparticulados limitados estão disponíveis, os resultados da análise NP obtidos podem ser tendenciosos devido a diferenças na composição elementar entre as partículas de referência e de amostra. Além da disponibilidade de uma gama limitada de materiais de referência, a detecção de vários eventos de partículas por tempo de permanência do detector representa um desafio adicional. Isso também pode afetar a precisão da eficiência de transporte a ser determinada.

Para ser independente dos materiais de referência, idealmente, é preferível um sistema de introdução de amostras com uma eficiência de transporte de quase 100%. Ao mesmo tempo, quando um baixo volume é usado em comparação com os sistemas de introdução convencionais, podem ser usadas concentrações mais altas de número de partículas. Mesmo que duas partículas estejam próximas uma da outra, ambas podem ser detectadas separadamente com o sistema baseado em μDG.

O μDG é capaz de gerar gotículas monodispersas com um volume fixo na faixa de pL e é adequado para esse fim 6,7,8,9. O μDG facilita a injeção de amostras iônicas e particuladas em diferentes solventes no ICP-MS. No caso de amostras de metal iônico, presume-se que as gotículas geradas sejam totalmente desolviadas no caminho para o ICP. Assim, a gota perde toda a água e uma partícula é formada a partir do sal restante. O diâmetro desta partícula é diretamente proporcional à concentração utilizada. Assim, padrões de referência caseiros da mesma matriz, massa e tamanho, com concentração variável da solução iônica do NP a ser investigado, podem ser produzidos internamente. O volume de uma gota pode ser calculado facilmente com base no diâmetro da gota medido pelo μDG. Isso não é possível com um NP que produz uma ampla distribuição de gotículas com diferentes diâmetros ^10,11. Devido à introdução uniforme da amostra com alta eficiência de transporte de 100% do μDG, é possível obter alta sensibilidade do analito específico do instrumento. Dependendo da matriz utilizada, isso leva a limites mais baixos de detecção (LOD) de massa e tamanho de partícula quando comparados aos resultados de sistemas convencionais de introdução baseados em PN¹². No entanto, devido ao design do μDG, as amostras não podem ser trocadas facilmente quando o sistema ICP-MS ainda está operando. Entre as medições de diferentes amostras, o μDG deve ser limpo e depois lavado com a solução da amostra para estabilização do sistema. Além disso, sua tolerância a amostras de matriz pesada não foi testada em grande medida. Além disso, devido às vazões extremamente baixas, o tempo de análise para obter boas estatísticas seria extremamente longo, o que limita seu uso prático, se amostras "reais", como por exemplo águas ambientais, devem ser analisadas.

Para superar essas limitações, o μDG foi operado anteriormente em combinação com um sistema convencional baseado em nebulizador pneumático, que recebeu o nome de sistema de entrada dupla¹³. Ao introduzir os padrões de calibração com o μDG e a suspensão NP por meio de um nebulizador pneumático no ICP-MS, Ramkorun-Schmidt et al. foram capazes de tirar proveito de ambos os sistemas¹³. Determinações altamente precisas da fração de massa metálica de Au e Ag NP foram alcançadas, sem a necessidade de determinação da eficiência de transporte. No entanto, nenhuma concentração de número de partículas foi determinada com este sistema de entrada dupla. Além disso, a limpeza e o alinhamento do sistema μDG estavam complicando a aplicabilidade para análises de rotina.

Neste artigo, propomos uma interface de entrada dupla flexível para determinar o tamanho da partícula NP e a concentração do número de partículas e demonstramos a montagem e o uso prático da mesma. Como o sistema de Ramkorun-Schmidt et al., consiste em um sistema de introdução de amostra μDG e PN. Demonstramos que o sistema de entrada dupla, em seu atual estágio de desenvolvimento, permite a aplicação de três modos independentes de análise para investigar e caracterizar NPs contendo metais. Nosso sistema de entrada dupla simplifica o procedimento de calibração para determinação de NP e melhora os números analíticos de mérito, em particular a precisão¹⁴. Os sistemas de entrada permitem a troca conveniente de amostras e a limpeza do μDG mesmo quando o ICP-MS ainda está operando, reduzindo assim o tempo total de análise e o risco de desalinhamento. Para testar o desempenho do sistema, NP de referência bem caracterizado (60 nm AuNP – NIST 8013, 75 nm AgNP – NIST 8017) são usados para validação e comparabilidade do método.

Protocolo

1. Montagem da configuração de introdução da amostra de entrada dupla

NOTA: Os detalhes sobre as diferentes peças são mostrados na Tabela 1.

	Componentes
Parte 1	Rótula esférica fêmea de vidro com comprimento de haste de aproximadamente 10 mm
	Rótula macho de vidro com haste de aproximadamente 10 mm de comprimento
	Peça em T de metal (dimensões: 1/4 pol.)
	Adesivo de vidro para metal
	Dois grampos para juntas esféricas de vidro
Parte 2	Câmara de pulverização ICP-MS (tipo sugerido: câmara de pulverização de esferas de impacto, câmara de pulverização ciclônica ou similar)
	Nebulizador pneumático (tipo sugerido: nebulizador concêntrico)
	Braçadeira
Parte 3	Tocha de quartzo livre do anel-O
	Conector de linha de gás fechado
	Conector de linha de gás de extremidade aberta
	Tubo de silicone condutor e flexível
Parte 4	Micro unidade piezoelétrica da geração da gota
Parte 5	Unidade de controle de micro gotículas

Tabela 1: Lista de componentes usados para construir a configuração de entrada dupla.

1. Construção de uma unidade de conector de peça em T (Figura 1 Parte 1).
   NOTA: Esta parte conecta o sistema convencional de introdução de amostras (etapa 1.2) e a unidade de transporte μDG (etapa 1.3).
   1. Insira as juntas esféricas macho e fêmea nas aberturas opostas de um conector de peça em T.
   2. Prenda as juntas esféricas macho e fêmea usando um adesivo de vidro com metal (por exemplo, cola de silicone).
   3. Conecte a junta esférica fêmea ao injetor do ICP-MS usando um clamp.
2. Anexo de um sistema convencional de introdução de amostras (Figura 1, Parte 2)
   NOTA: Esta peça está conectada à unidade de conector da peça em T (etapa 1.1)
   1. Combine uma câmara de pulverização ICP-MS com um nebulizador pneumático (PN), que se encaixa na câmara de pulverização que está sendo usada.
   2. Use um clamp para conectar a saída da câmara de pulverização à junta esférica macho do conector da peça em T (descrito na etapa 1.1).
      NOTA: A saída da câmara de pulverização geralmente é equipada com um conector de junta esférica fêmea. A combinação mostrada na Figura 1 consiste em um nebulizador e uma câmara de pulverização de esferas de impacto. Em vez da câmara de pulverização de esferas de impacto, outras câmaras de pulverização com eficiências de transporte na faixa de 2 a 10% ou mais podem ser usadas.
3. Construção da unidade de transporte de microgotículas (Figura 1, Parte 3)
   NOTA: Esta peça conecta a unidade de conector de peça em T (etapa 1.1) e a unidade μDG (etapa 1.4).
   1. Conecte uma tocha de quartzo desmontável, com seu tubo injetor removido, a um suporte de laboratório com a entrada da tocha na parte superior usando os grampos apropriados.
   2. Bloqueie a entrada de plasma/gás auxiliar da tocha por conectores de gás de extremidade fechada.
      NOTA: A amostra é transportada usando uma bomba peristáltica para o nebulizador. O gás argônio é usado para nebulização de amostras na câmara de pulverização e posterior transporte para o plasma.
   3. Conecte uma linha de gás hélio à tocha por meio de sua entrada de gás de resfriamento usando um conector de gás apropriado.
      NOTA: O gás hélio aplicado é usado para a dessolvatação das gotículas geradas e atua como um gás de bainha, evitando que a gota colida com as paredes da instalação e impedindo que o instrumento ICP-MS insira oxigênio atmosférico, enquanto a cabeça de entrada da amostra do μDG deve ser removida para limpeza e troca de amostras.
   4. Conecte um tubo de silicone condutor e flexível de 30 cm de comprimento (0.75 cm), usando um adaptador, à extremidade de saída da tocha (parte inferior da tocha).
   5. Conecte a extremidade inferior do tubo de silicone à unidade de conector da peça em T esticando o tubo de silicone flexível sobre sua conexão de metal vertical restante.
      NOTA: O tubo de silicone flexível permite a afinação xyz do instrumento ICP-MS com a configuração conectada.
4. Conexão da unidade de geração de microgotículas e unidade de controle de geração de microgotículas (Figura 1 Parte 4, Parte 5)
   NOTA: Esta parte está conectada à unidade de transporte μDG (etapa 1.3)
   1. Conecte a unidade μDG preparada à unidade de transporte de microgotas inserindo o cabeçote μDG na extremidade de entrada de amostra da tocha.
   2. Conecte a fonte de alimentação à unidade de controle μDG.
      NOTA: A configuração descrita aqui consiste em um cabeçote μDG e uma fonte de alimentação μDG disponíveis comercialmente. Dependendo da cabeça μDG usada, a configuração deve ser adaptada de acordo.

2. Quantificação do tamanho da gota

1. Use uma luz estroboscópica e uma câmera CCD (por exemplo, em uma configuração aberta, consulte a configuração de medição de tamanho da Figura 1 ) para obter imagens de gotículas produzidas pelo μDG.
2. Calibre a câmera CCD tirando imagens de um objeto de tamanho conhecido na faixa de μm (por exemplo, fio de cobre com um diâmetro de 150 μm).
3. Tire imagens de pelo menos 1.000 gotas nas configurações usadas para o experimento (consulte a Tabela 2).
4. Use um programa de software gráfico apropriado (consulte Tabela de Materiais) para avaliar as imagens relativas ao objeto e ao tamanho da gota nas seguintes etapas:
   1. Clique em Arquivo e Abrir para carregar a imagem do objeto.
   2. Clique na imagem | Ajustar | Limite para definir a área do objeto movendo as barras de rolagem.
   3. Clique em Aplicar para aplicar as configurações.
   4. Clique no botão Segmento reto .
   5. Clique e segure o botão esquerdo do mouse para desenhar uma linha ao lado do objeto.
   6. Pressione Ctrl + M para medir o tamanho do objeto.
   7. Meça o diâmetro do objeto em 5 pontos diferentes.
   8. Copie e cole a tabela "Resultados" em um software de planilha.
   9. Calcule a média aritmética da coluna "Comprimento".
   10. Calcule a proporção de pixel (PAR): tamanho real do objeto (μm)/tamanho médio do objeto na imagem (px).
   11. Clique em Arquivo | Importação | Sequência de imagens para importar e carregar as imagens das gotículas.
   12. Clique em Retangular e marque a gota da primeira imagem.
   13. Clique com o botão direito do mouse no mouse pad e escolha Duplicar para separar as gotículas da sequência de imagens do resto da imagem.
   14. Separe as gotículas do fundo conforme especificado na etapa 2.4.2.
   15. Clique em Processar | Binário | Erodir para remover reflexos de luz na superfície da gota.
   16. Clique em Processar | Binário | Dilate para reverter a etapa "Corroer".
   17. Clique em Analisar | Analisar partículas | Ok para medir todas as gotículas.
   18. Copie e cole a tabela "Resumo" ou "Resultado" em um software de planilha.
   19. Calcule a média aritmética do diâmetro do furão em px.
   20. Use o PAR para transformar o diâmetro em μm: diâmetro do furão em px/PAR.
       NOTA: O tamanho das gotículas formadas pelo μDG varia dependendo do comprimento selecionado e da duração do pulso de corrente aplicado ao elemento piezo⁷.

3. Preparação da amostra

1. Preparar uma solução de calibração iónica da substância a analisar a medir na gama de concentrações de 0,2 a 20 μg/l em ácido diluído [por exemplo, HCl (0,5 v/v), HNO₃ (3,5 v/v)].
2. Preparar uma solução iónica para a calibração de um ponto na gama de concentrações compreendidas entre 1 e 10 μg/l em ácido diluído.
3. Prepare as suspensões padrão NP de acordo com as instruções do fabricante ou protocolos internos.
   NOTA: As etapas 3.3.1 – 3.3.4 explicam a preparação das suspensões padrão NP considerando Ag, Au, CeO₂ NPs como exemplo.
   1. Prepare 10 mL de solução de AuNP a 0,05 μg/L para o NP e 1 μg/L de solução de AuNP em água ultrapura para μDG. Vórtice por 20 a 60 segundos antes de usar.
   2. Preparar a solução de AgNP a 0,05 μg/L para a solução de NP e a solução de AgNP de 2 μg/L, ambas em água ultrapura, para a DGμ. Agite bem por 20–60s antes de usar¹⁵.
   3. Preparar as soluções de CeO₂ NP a utilizar como descrito anteriormente para os óxidos metálicos^16,17.
   4. Preparar 0,05 μg/L de solução de CeO₂ NP para o NP e 1 μg/l de solução para o μDG.
      1. Pesar 25,6 mg/mL de CeO₂ NP em um recipiente de vidro de 15 mL – 20 mL no total e adicionar 10 mL de solução de BSA 0,05 (v/v) preparada em água ultrapura.
      2. Use um sonicador na ponta do dedo com uma potência de 7.35 W para homogeneizar a solução de partículas por 309 s.

4. Afinação instrumental e parâmetros

1. Certifique-se de que o gerador MDG esteja desligado e conecte a configuração de introdução de amostra de entrada dupla que foi incorporada na etapa 1 com o injetor do instrumento ICP-MS com um clamp. Lave o sistema de entrada por 5 a 10 min com o gás nebulizador (Ar) e o gás de transporte de gotículas (He).
   NOTA: O instrumento ICP-MS deve ser protegido contra a penetração de altos níveis de oxigênio na sala de plasma.
2. Desligue o gás de transporte de gotículas (He) e inicie o sistema ICP-MS
3. Sintonize o instrumento no modo de medição que se deseja utilizar usando a solução de ajuste padrão do instrumento especificada pelo fabricante do sistema ICP-MS.
   NOTA: Uma solução de ajuste padrão consiste, por exemplo, bário, cério, índio, urânio, bismuto, cobalto, lítio (todos 1 μg/L) em uma mistura de 2,5% (v/v) de ácido nítrico e 0,5% (v/v) de ácido clorídrico.
4. Determinação da taxa de absorção da amostra do NP.
   1. Encha um recipiente com 15 mL de água.
   2. Pesar o recipiente.
   3. Conecte o vaso à tubulação do NP.
   4. Inicie a bomba peristáltica clicando no botão de partida da bomba peristáltica no software do instrumento.
   5. Inicie um cronômetro de 5 minutos.
   6. Remova a linha de captação do recipiente exatamente após 5 min. Pesar novamente o recipiente.
   7. Calcule a taxa de absorção da amostra (mL/min) usando a fórmula: peso do vaso antes - peso do vaso após / duração do tempo.
5. Otimize os parâmetros instrumentais para melhorar a sensibilidade do analito, se necessário, por exemplo, taxa de fluxo de gás do nebulizador, profundidade de amostragem, potência do plasma.
   NOTA: Consulte a Tabela 2 como um exemplo de parâmetros instrumentais que podem ser otimizados em um sistema ICP-MS.
6. Ajuste o fluxo de gás He até que uma taxa de sinal constante possa ser detectada em função da taxa de formação de gotas.

Parâmetro	Valor
ICP – EM:
Potência do Plasma (W)	1600
Profundidade de amostragem (mm)	4
Vazões (L min-1):
Gás Auxiliar	0.65
Gás de resfriamento	14
Vezes (s)
Aquisição (ões) de dados	1200
Tempo de permanência (s)	0.01
Interface:
Taxa de absorção de amostra PN (mL min-1)	0.21
Gás nebulizador (L min-1)	0.92
μDG:
Diâmetro capilar (μm)	75
Taxa de queda (Hz)	10
Ele maquiagem gás (L min-1)	0.27
Modo de operação	Pulso triplo
	Conjunto 1	Conjunto 2	Conjunto 3
Tensão (V)	53	51	47
Largura de pulso (μs)	20	25	12
Atraso de pulso (μs)	4	2	1

Tabela 2: Valores dos parâmetros instrumentais utilizados.

5. Medição multimodo de amostras de nanopartículas

1. Prepare a unidade de controle μDG
   1. Ligue o interruptor de alimentação da unidade de controle μDG.
   2. Clique em Iniciar na primeira tela para iniciar a unidade de controle.
   3. Clique em Configurações globais para escolher o modo de pulso a ser usado.
   4. Clique no botão gráfico direito no modo de pulso para escolher o modo de pulso triplo.
      NOTA: As configurações para o modo de pulso triplo são fornecidas na Tabela 2.
2. Preparar a unidade μDG
   1. Clique em Ativar/Desativar para iniciar a μDG.
   2. Encher o recipiente de recolha com a solução de amostra a medir.
   3. Conecte o recipiente de amostra à unidade μDG.
   4. Usando uma seringa de 10 mL para purgar o ar através do recipiente e da unidade μDG.
   5. Ligue a seringa à porta da seringa no recipiente da amostra.
   6. Empurre o êmbolo da seringa até que seja observado um fluxo de líquido constante saindo da cabeça μDG.
   7. Mantenha a pressão por 10 s.
   8. Remova a seringa.
   9. Coloque a unidade μDG na zona de foco da câmera CCD para observar as gotículas formadas.
   10. Conecte a câmera CCD a um PC ou laptop.
   11. Inicie o software da câmera CCD para observar as gotículas formadas
   12. Clique em Iniciar para obter uma visualização ao vivo das gotículas.
   13. Observe a formação constante de gotículas.
   14. Coloque a cabeça μDG na tocha invertida no sistema de introdução de amostras de entrada dupla.
3. Valide a unidade μDG e o PN para cada elemento de interesse, medindo calibrações multiponto repetidas.
   NOTA: Para aquisição de dados ICP-MS, use o software associado ao instrumento.
4. Determine a faixa linear da calibração multiponto importando os dados experimentais para um software de planilha.
   1. Calcule a média aritmética de cada ponto de calibração.
   2. Determine a interceptação, inclinação e coeficiente de correlação.
      NOTA: Para sp-ICP-MS, o coeficiente de correlação deve ser >0,99¹⁸.
5. Escolha uma concentração dentro da faixa linear das curvas de calibração para calibrações de um ponto posteriormente.
6. Seguindo as etapas abaixo para medição e validação (usando materiais de referência como NIST 8012, NIST 8013 ou NIST 8017 ou similar) da quantificação de nanomateriais multimodo (Figura 2).
   1. Selecione uma nanopartícula e um padrão iônico de acordo com o analito de interesse.
   2. Preparar a unidade μDG de acordo com o ponto 5.2 com uma solução-padrão iónica.
   3. Adicione uma solução de ácido diluído (por exemplo, HCl 0,5% v/v) através do NP.
   4. Inicie a medição do sistema ICP-MS no modo resolvido no tempo.
   5. Clique em On/Off após 120 s para parar o μDG e trocar a solução de ácido diluído no NP com o padrão iônico.
   6. Após 330 s, troque novamente o padrão iônico no NP por uma solução ácida diluída.
   7. Enquanto isso, remova a unidade μDG da configuração.
   8. Troque o recipiente de amostra (frasco de vidro) da unidade μDG por um recipiente contendo uma solução de ácido diluído (por exemplo, 3,5% HNO₃) para limpar a unidade μDG.
      1. Encha uma seringa de 10 ml com ar.
      2. Ligue a seringa à porta de injeção da unidade μDG e esvazie a seringa até que apareça um jato de líquido da cabeça μDG e mantenha a pressão durante 30 s.
      3. Prepare o μDG conforme especificado na etapa 5.2 com o NP sample e conecte a unidade μDG de volta à configuração em 510 s.
   9. Clique em Ativar/Desativar após 810 s para parar a μDG.
   10. Trocar a solução ácida diluída no NP pela amostra NP e medir durante mais 300 s.
   11. Pare a medição após aprox. 1.200 s.
   12. Limpe a unidade μDG conforme especificado na etapa 5.5.8.

Figura 2: Estratégia de medição para quantificação de nanomateriais multimodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Análise dos dados

NOTA: Para simplificar todas as etapas de cálculo, uma planilha correspondente foi preparada (consulte Arquivo Suplementar).

1. Use uma planilha ou software que possa lidar com quadros de dados para processar os dados e importar os dados medidos. Cole os valores de intensidade de toda a medição no software da planilha (incluído no suplemento eletrônico) na coluna A, os dados serão visualizados. Insira todos os parâmetros experimentais necessários para cálculo na tabela "Parâmetro de entrada".
2. Defina as regiões de interesse (ROI) para μDG iônico (I), PN iônico (II), μDG NP (III) e PN NP (IV) selecionando as células de planilha apropriadas. Usando o gráfico na planilha preparada para definir os limites dos ROIs e inserir os valores na tabela "Determinação da região de interesse" (células C1:E7).
3. Copie e cole cada conjunto de dados em uma coluna separada. Pressione o botão Copiar ROI na planilha preparada para dividir a medição nos quatro ROIs (coluna M:P).
4. Calcule a média aritmética de I e II.
5. Aplique a abordagem iterativa para separar sinais de partículas ou gotículas e fundo para III e IV.
   1. Calcular a média aritmética e o desvio-padrão de todos os valores medidos.
   2. Calcule um valor limite ou de corte pelo valor médio + 5*desvio padrão.
   3. Remova todos os sinais menores que o valor limite de III e IV usando o comando Recortar nos sinais de partículas identificados. Use Colar para colá-los em uma coluna separada.
   4. Repita as etapas 1 a 3 até que o valor médio e o desvio padrão sejam constantes.
      NOTA: Nas colunas Q a BD da planilha preparada, a abordagem iterativa para separar os sinais de fundo e de partículas é realizada cinco vezes.
6. Calcular a média aritmética dos sinais de partículas identificados de III e IV.
7. Calcular a dimensão mínima das partículas detetáveis (_dimensão LOD - nm) para μDG NP e PN NP utilizando o limite instrumental de deteção da substância a analisar (LOD - contagens), a sensibilidade da substância a analisar (S_{C, iónica} - contagens/(μg/L)), a taxa de absorção da amostra (q_s – mL/min), a eficiência de transporte (η – unidade relativa) e a densidade do material a granel (ρ – g/cm³):
   1. 
   2. 
8. Calcular a massa (m_a,p) e a dimensão das partículas (d – nm, partindo do princípio de que as partículas são esféricas) dos sinais de partículas identificados para μDG NP e PN NP de acordo com os três modos de análise aplicados, tendo em conta a concentração de metais iónicos de uma solução-padrão (c_a - μg/l) e o fluxo de iões no plasma (contagens/s):
   1. Missa:
   2. Tamanho:
9. Calcular a eficiência de transporte específica dos modos de análise utilizando o número de partículas detetadas (q_p), a concentração de partículas da amostra (c_p,utilizada - 1/ml), a sensibilidade da substância a analisar a NP e o MDG (S_m,iónico,PN, S_{m,iónico,MDG} – contagens/(μg/L)], o volume da gotícula (V_drop – pL), o tempo de permanência (t_d – ms), a eficiência de transporte do NP (η_PN), a eficiência de transporte do μDG (η_μDG), a intensidade das soluções iónicas medidas pelo NP e μDG (I_{iónico, PN,} I_{iónico, μDG} – contagens) e a concentração da solução iónica utilizada para ambos os sistemas de injeção (c_{iónico, PN,} c_iônico,μDG - μg/L):
   1. Modo I:
   2. Modo II:
   3. 
   4. 
   5. 
   6. 
10. Suponha que a eficiência de transporte de μDG seja igual a 1:¹⁹
    1. 
11. Calcular a concentração do número de partículas da solução NP analisada tendo em conta o volume da amostra injectada durante a medição (V_injectada):
    
    NOTA: Na planilha preparada, todos os cálculos são realizados automaticamente após a divisão. Os resultados são mostrados na tabela "Parâmetros de saída" (células BH7:BR35) e contém as fórmulas descritas acima, incluindo etapas de cálculo individuais.

Resultados

Figura 3: Determinação do tamanho da gota com a câmera CCD. Calibração da câmera CCD com um fio de cobre de 150 μm (A) e determinação do tamanho da gota após a conversão das imagens de gotículas obtidas em uma imagem binária colorida (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Validação da configuração de entrada dupla. Calibração multiponto do sistema de entrada μDG (A) e PN (B) para ouro (Au), prata (Ag) e cério (Ce). A concentração usada na faixa de 0,2 a 20 μg ^mL-1 é convertida, dependendo das condições experimentais usadas em massa por evento detectado. Os dados apresentados são os valores médios de três repetições independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Representando a medição para a configuração de entrada dupla. A quantificação de CeO₂ NP com barras coloridas como feito na Figura 2 para as diferentes etapas de injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra	Modo de análise /	Entrada para amostra NP	Entrada para padrões de calibração	η	ma, p	Tamanho NP (d)	#NPs		Recuperação (%)
	ηdeterminação de NP			(%)	(fg)	(nm)	(mL-1 x103)
Au 56 nm	Modo-I /	PN	PN: Padrões Au iônicos e AuNP	1.8 (0.1)	1.9 (0.5)	57.2 (4.3)	28.1 (0)		100
NIST 8013	Método de contagem
	Modo-II /	PN	PN/μDG:	1.9 (0.1)	2 (0.4)	58 (3.6)	25.6 (1.6)		91
	Relação de sensibilidade		Normas autónomas
	Modo-III /	μDG	μDG:	100	1.7 (0.2)	55 (2.4)	394.4 (29.3)		70
	ημDG = 1		Padrão iônico de Au
Tamanho esperado (nm)						56.0 (0.5)
Ag 75 nm	Modo-I /	PN	PN: Padrões Ag iônicos e AgNP	2.3 (0.2)	1.9 (0.2)	70.2 (2.3)	21.6 (0)		100
NIST 8017	Método de contagem
	Modo-II /	PN	PN/μDG:	2.5 (0.2)	2 (0.2)	71.5 (2.1)	20.5 (1.9)		95
	Relação de sensibilidade		Padrões iônicos agrícolas
	Modo-III /	μDG	μDG:	100	2.5 (0.2)	76.7 (2.3)	757.1 (68.7)		88
	ημDG = 1		Padrão iônico do Ag
Tamanho esperado (nm)						74.6 (3.8)
CeO2 JRC NM212	Modo-I /	PN	PN: Padrões Ce iônicos e AuNP	1.7 (0)	0.90 (0.09)	61.9 (2.0)	7.59 (0.32)		-
10-100 nanômetro	Método de contagem
	Modo-II /	PN	PN/μDG:	4.9 (1.4)	1.36 (0.35)	70.6 (5.9)	5.42 (1.7)		-
	Relação de sensibilidade		Padrões iônicos Ce
	Modo-III /	μDG	μDG:	100	1.63 (0.62)	74.4 (9.2)	590 (168)		-
	ημDG = 1		Padrão iônico Ce

Tabela 3: Resultados da configuração de entrada dupla. Eficiência de transporte, fração de massa metálica, diâmetro e concentração do número NP para materiais Au NIST 8013, Ag NIST 8017 e CeO₂ JRC NM 212 (n=3) NP usando três modos de análise e três métodos de determinação da eficiência de transporte. A % de recuperação é definida como a razão entre o #NPs determinado e o #NPs esperado. A tabela é reimpressa com permissão da referência¹⁴.

O protocolo aqui apresentado permite a determinação da concentração de massa e número de partículas. A formação de gotículas μDG, incluindo o tamanho da gota (Figura 3), foi caracterizada previamente (Tabela 3).

Após a montagem da configuração (Figura 1) e o tamanho da gota determinado, ambos os sistemas de injeção foram validados com padrões iônicos (Figura 4). Uma precisão de r² > 0,99 pode ser alcançada com ambos os sistemas de injeção para todos os elementos investigados. No entanto, existem diferenças em ambos os sistemas devido à quantidade de analito introduzido e transportado. Como o μDG tem uma eficiência de transporte muito alta (até 100%), são observadas sensibilidades de analito mais altas em comparação com o NP com baixa entrada de massa ao mesmo tempo. No entanto, as concentrações medidas introduzidas pelo μDG devem ser separadas em duas faixas lineares. Para Ag, a primeira faixa linear pode ser observada entre 0 e 0,5 fg ^evento-1 e a segunda entre 0,5 e fg ^evento-1. Em contraste, o primeiro intervalo linear para Ce está entre 0 e 0,25 fg ^evento-1 e o segundo entre 0,25 e 3 fg ^evento-1. A faixa linear para PN para as concentrações medidas parece ser maior. Isso provavelmente está relacionado à diferença de massa introduzida no ICP-MS por evento de detecção. O μDG injeta uma quantidade absoluta constante em um baixo volume por gota e evento de detecção, resultando em menor massa detectada em comparação com a introdução de amostras com o NP.

Após a validação bem-sucedida, os experimentos podem ser realizados conforme descrito na Figura 2. Um resultado de tais experimentos é exemplificado na Figura 5 para a determinação do tamanho de partícula e da concentração numérica de CeO₂ NP. Aqui os sinais para as soluções iônicas e NP introduzidas via μDG e PN podem ser identificados. Uma determinação tripla foi realizada para todas as partículas investigadas.

A avaliação dos dados obtidos foi realizada conforme descrito acima e está resumida na Tabela 3. Para o Au e Ag NP usado para validação da configuração de entrada dupla e os três modos de análise, o tamanho de partícula certificado e a concentração do número podem ser alcançados com todos os modos de análise realizados. As granulometrias médias obtidas para o CeO₂ situam-se entre 10 e 100 nm, o intervalo especificado pelo fabricante.

Figura 1: Design da configuração da interface de entrada dupla. Parte 1 - unidade de conector, Parte 2 - sistema de introdução convencional, Parte 3 - unidade de transporte de microgotículas, Parte 4 - unidade de geração de microgotículas, Parte 5 - unidade de controle de microgotículas e configuração aberta para medição do tamanho da gota, incluindo uma luz estroboscópica e uma câmera CCD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O objetivo da configuração de entrada dupla desenvolvida é a caracterização e quantificação de NP com a maior precisão possível em relação ao seu tamanho e concentração numérica usando diferentes modos de análise, independentemente do analito a ser investigado. Ao combinar um sistema de introdução de baixo volume (pL) e alto transporte de massa (até 100%) (μDG) com um sistema de introdução convencional (PN), isso é possível. Usando a configuração apresentada neste trabalho, a eficiência de transporte baseada em elemento específico necessária para a quantificação da massa de partículas pode ser determinada com base em padrões iônicos e independentemente dos materiais de referência NP. Além disso, as NPs introduzidas no ICP-MS com o μDG têm uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita (AuNP) ou semelhante (AgNP). Por outro lado, para o CeO₂ foi observada uma distribuição de tamanho mais ampla para o μDG e pode ser atribuída à maior polidispersidade da amostra analisada. Devido à introdução de baixo volume, dois NPs podem ser detectados separadamente um do outro, o que de outra forma seria interpretado como um NP na configuração convencional¹⁴.

As vantagens resultantes da unidade de transporte μDG são o alto grau de flexibilidade devido à tubulação de silicone flexível, que simplifica o alinhamento da configuração. A tocha com o injetor também pode ser ajustada durante a configuração enquanto ainda está conectada ao ICP-MS. O fluxo de gás He aplicado adicional evita uma colisão das gotículas formadas pelo cabeçote μDG com as paredes da tubulação²⁰. Além disso, o gás He permite a remoção da cabeça μDG durante a troca de amostras, mesmo quando o ICP-MS ainda está em operação. Manter o ICP em um estado operacional é crucial para uma medição estável e robusta. Como a cabeça μDG deve ser limpa e enxaguada a cada nova amostra ou padrão, o fluxo de He é vital para a operação do sistema de entrada introduzido neste trabalho. Além disso, todas as partes da configuração de entrada dupla devem ser conectadas corretamente para evitar a penetração de oxigênio no sistema. Para diminuir o oxigênio na configuração apresentada, o sistema é lavado com o nebulizador e o gás de transporte de gotículas antes da ignição do plasma por pelo menos 5 a 10 min.

Quando as gotículas formadas atingem a unidade conectora, elas são transportadas para o plasma por um fluxo de líquido nebulizado, também conhecido como condição de plasma úmido. Em comparação com o uso de condições de plasma seco, isso leva a um aumento do conteúdo líquido do plasma. Consequentemente, a intensidade do sinal diminui, assim como a flutuação do sinal aumenta, ou seja, um desvio padrão maior do sinal de medição médio¹³. No entanto, usando o μDG e concentrações na faixa de 0,2 μg/L, os sinais acima do fundo podem ser detectados. A massa injetada correspondente por gota tem baixo teor de metal, que está próximo dos limites de detecção para alguns elementos (ou seja, Au, Ag, Ce). Se forem utilizadas diferentes concentrações para calibração ao longo deste limite, podem ser observadas duas regiões lineares com uma sobreposição de aproximadamente 0,05 μg/L para Ce e 2 μg/L para Ag. Abaixo da região sobreposta, os sinais observados estão próximos do fundo específico do elemento²¹. Acima desses limites, a faixa de trabalho linear do μDG pode ser identificada. Mesmo com a capacidade de medir baixas concentrações, é impossível distinguir entre íons e NP do mesmo analito dentro de uma gotícula se eles estiverem presentes simultaneamente. Caso contrário, usando o sistema de introdução convencional, o fundo iônico médio pode ser determinado e subtraído de todos os sinais para obter apenas os sinais de partículas.

O sistema baseado nos ODM também tem várias limitações que podem ser parcialmente contornadas pela aplicação do sistema de entrada dupla proposto. No entanto, se a frequência de gotículas de μDG exceder 50 Hz, não é possível criar um padrão de gotículas consistente. As gotículas formadas podem colidir e, portanto, ocorre a troca de analitos. O ajuste correto das taxas de fluxo de gás também é importante para um transporte confiável da gota para o sistema ICP-MS, bem como para a operação correta do NP. O sistema de entrada dupla proposto atualmente não suporta a automação do procedimento de medição, pois há a necessidade de alterar manualmente as soluções da amostra.

No futuro, o μDG pode ser usado para caracterizar e quantificar NPs em matrizes complexas e amostras ambientais. Para evitar o entupimento do μDG devido à maior viscosidade, complexidade e tensão superficial da solução, um projeto de cabeçote apropriado deve ser usado. Dependendo do design da cabeça μDG e da operação da fonte de alimentação, pode ser possível gerar gotículas que contenham sistemas semelhantes a partículas, como células, micelas ou transportadores de lipídios, para os quais os materiais de referência padrão não estão disponíveis.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Au ionic (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85550.18E
Ag ionic (1000 mg L-1 stock)	Ultra Scientific, RI, USA	ICM-103
Ag NP (75nm, NIST 8017)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		no longer available
Au NP (60nm, NIST 8013)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		no longer available
Ce ionic (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85557.18E
CeO2 (10-100nm, NM212)	EU Joint Research Centre	NM212
Excel 2016	Microsoft
Fiji	ImageJ
Glass female spherical ball + Glass male ball	Fisher Scientific	12499016
HCl (emprove bio)	Merck, Germany	100317
ICP-MS spray chamber with ipact bead	LabKings	LK6-45013 (OEM 3600170)
Metal clamps for spherical glass joint	Fisher Scientific	11322015
Metal T-Piece	Swagelok	SS-4-VCR-T
Microdrop Dispenser Head, non heated	microdrop Technologies	944
Microdrop Dispensing System MD-E-3000	microdrop Technologies
MilliQ water (MilliPore gradient)	Merck MilliPore, Darmstadt, Germany
O-ring free quartz torch	Analytical West	450-301
PFA-ST concentric nebulizer	Elemental Scientific	ES-2042
Silicone Rubber Tubing - 60° Shore - Platinum Cured - Black	Silex
XIMEA Cam Tool	XIMEA