다중 모드 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석 및 검증을 위한 다목적 이중 주입구 시료 주입 시스템

요약

여기에서는 표준 독립 나노 입자 특성화를 가능하게 하는 단일 입자 유도 결합 질량 분석법을 위한 이중 주입구 시스템 사용을 위한 프로토콜을 제공합니다.

초록

금속 함유 나노 입자(NP)는 기기의 단일 입자 모드(spICP-MS)를 사용하여 크기 및 수 농도 측면에서 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(ICP-MS)로 특성화할 수 있습니다. 측정 정확도는 설정, 기기의 작동 조건 및 사용자가 설정한 특정 매개변수에 따라 다릅니다. ICP-MS의 수송 효율은 NP의 정량화에 매우 중요하며, 일반적으로 균일한 크기 분포와 알려진 입자 수 농도를 가진 참조 물질이 필요합니다.

현재 NP 참조 물질은 소수의 금속에만 사용할 수 있으며 제한된 크기만 사용할 수 있습니다. 참조 표준 없이 입자를 특성화하는 경우 크기와 입자 수의 결과가 모두 편향될 수 있습니다. 따라서 이 문제를 극복하기 위해 spICP-MS로 나노 입자를 특성화하기 위한 이중 주입구 설정이 개발되었습니다. 이 설정은 나노 입자 용액을 위한 공압식 분무기(PN)와 이온 보정 용액을 위한 미세방울 발생기(μDG)로 구성된 기존 도입 시스템을 기반으로 합니다. μDG, PN 및 ICP-MS 시스템의 결합을 용이하게 하기 위해 새롭고 유연한 인터페이스가 개발되었습니다. 인터페이스는 사용 가능한 실험실 구성 요소로 구성되며 ICP-MS 기기가 계속 실행되는 동안 배열의 보정, 나노 입자(NP) 특성화 및 세척을 가능하게 합니다.

입자 크기와 수 농도를 결정하기 위해 세 가지 독립적인 분석 모드를 사용할 수 있습니다. 각 모드는 서로 다른 교정 원리를 기반으로 합니다. 모드 I(카운팅) 및 모드 III(μDG)은 문헌에서 알려져 있지만 모드 II(감도)는 무기 이온 표준 용액에 의해서만 수송 효율을 결정하는 데 사용됩니다. NP 참조 물질과 독립적입니다. 여기에 설명된 μDG 기반 주입 시스템은 우수한 분석물 민감도를 보장하므로 검출 한계(LOD)가 낮습니다. 달성된 크기 종속 LOD는 조사된 모든 NP(Au, Ag, CeO₂)에 대해 15nm 미만입니다.

서문

유도 결합 플라즈마 질량 분석기는 소위 단일 입자 모드 ^1,2,3에서 다양한 샘플 및 매트릭스에서 NP의 크기와 수를 정량화하는 데 광범위하게 사용됩니다. 단일 입자 모드는 통합 또는 체류 시간이 짧은 데이터 수집 시스템의 작동입니다. 측정된 각 NP는 이중 이벤트를 피하기 위해 NP 현탁액의 적절한 희석이 사용된 경우 이 시간 간격(초당 카운트로 측정된 이벤트: cps)에서 통합 신호를 생성합니다. 검량 표준물질과 시료는 일반적으로 공압 분무(PN)⁴를 기반으로 하는 기존 시료 주입 시스템을 통해 ICP-MS에 도입됩니다. 그러나 전제 조건으로 NP당 금속 질량을 정확하게 정량화하고 현탁액 내 금속 농도를 결정하기 위해 샘플 도입 유속 및 η 효율()을 결정해야 합니다. 수송 효율은 ICP-MS⁵에 의해 검출된 질량(폐기물 수집 방법)) 또는 입자 수(계수 방법)에 주입된 질량 또는 입자 수의 비율을 설명합니다. 수송 효율은 나노 입자 기반 참조 물질⁵을 사용하여 가장 자주 측정됩니다. 그러나 수송 특성은 NP의 구조에 따라 달라지며 조성 및 시료 분산제와 같은 특성을 포함합니다. 다른 영향 요인으로는 시료 흡수율, 분무기 가스 유량, 체류 시간 및 총 측정 시간과 같은 기기 매개변수가 있습니다.

제한된 나노 입자 참조 물질만 사용할 수 있기 때문에 참조 입자와 샘플 입자 간의 원소 조성 차이로 인해 얻은 NP 분석 결과가 편향될 수 있습니다. 제한된 범위의 참조 물질을 사용할 수 있다는 것 외에도, 검출기 체류 시간당 여러 입자 이벤트를 검출하는 것은 또 다른 도전 과제입니다. 이는 또한 결정되는 운송 효율의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.

표준 물질과 독립적이려면 이상적으로는 운송 효율이 거의 100%인 시료 주입 시스템이 바람직합니다. 동시에 기존 주입 시스템에 비해 적은 부피를 사용하는 경우 더 높은 입자 수 농도를 사용할 수 있습니다. 두 입자가 서로 가까이 있더라도 μDG 기반 시스템으로 두 입자를 별도로 검출할 수 있습니다.

μDG는 pL 범위에서 고정된 부피로 단분산 액적을 생성할 수 있으며 이러한 목적에 매우 적합합니다 ^6,7,8,9. μDG는 서로 다른 용매의 이온 및 미립자 시료를 ICP-MS에 쉽게 주입할 수 있습니다. 이온 금속 샘플의 경우, 생성된 액적이 ICP로 가는 길에 완전히 탈용매화되었다고 가정합니다. 따라서 물방울은 모든 물을 잃고 남은 소금으로 입자가 형성됩니다. 이 입자의 직경은 사용된 농도에 정비례합니다. 따라서 조사할 NP의 이온 용액의 다양한 농도를 가진 동일한 매트릭스, 질량 및 크기의 수제 참조 표준물질을 사내에서 생산할 수 있습니다. 액적의 부피는 μDG로 측정된 액적 직경을 기반으로 쉽게 계산할 수 있습니다. 이것은 직경이 다른 액적의 광범위한 분포를 생성하는 PN에서는 불가능합니다^10,11. μDG의 100%의 높은 수송 효율에서 균일한 시료 주입으로 인해 높은 기기별 분석물 감도를 달성할 수 있습니다. 사용된 매트릭스에 따라 이는 PN¹²를 기반으로 하는 기존 주입 시스템의 결과와 비교할 때 입자 질량 및 크기의 검출 한계(LOD)를 낮춥니다. 그러나 μDG의 설계로 인해 ICP-MS 시스템이 아직 작동 중일 때는 시료를 쉽게 교환할 수 없습니다. 서로 다른 샘플을 측정하는 사이에 μDG를 세척한 후 시스템 안정화를 위해 샘플 용액으로 세척해야 합니다. 또한 무거운 매트릭스 샘플에 대한 내성은 크게 테스트되지 않았습니다. 더욱이, 매우 낮은 유속으로 인해 좋은 통계를 얻기 위한 분석 시간이 매우 길어질 수 있으며, 이는 예를 들어 환경 용수와 같은 "실제" 샘플을 분석해야 하는 경우 실제 사용에 제한이 있습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 μDG는 이전에 이중 흡입 시스템¹³이라는 이름이 부여된 기존의 공압 분무기 기반 시스템과 함께 작동되었습니다. Ramkorun-Schmidt 등은 공압 분무기를 통해 μDG 및 NP 현탁액을 사용한 보정 표준을 ICP-MS에 도입함으로써 두 시스템을 모두 활용할 수 있었습니다¹³. Au 및 Ag NP의 금속 질량 분율에 대한 매우 정확한 측정이 이루어졌으며, 운송 효율을 결정할 필요가 없었습니다. 그러나 이 이중 주입 시스템에서는 입자 수 농도가 측정되지 않았습니다. 또한 μDG 시스템의 세척 및 정렬은 일상적인 분석에 대한 적용을 복잡하게 만들었습니다.

이 논문에서는 NP 입자 크기와 입자 수 농도를 결정하기 위한 유연한 이중 주입구 인터페이스를 제안하고 이의 조립 및 실제 사용을 시연합니다. Ramkorun-Schmidt 등의 시스템과 마찬가지로 μDG와 PN 시료 주입 시스템으로 구성됩니다. 우리는 현재 개발 단계에서 이중 주입구 시스템을 통해 금속 함유 NP를 조사하고 특성화하기 위해 세 가지 독립적인 분석 모드를 적용할 수 있음을 보여줍니다. 당사의 이중 주입구 시스템은 NP 측정을 위한 교정 절차를 단순화하고 분석 수치, 특히 정확도¹⁴를 향상시킵니다. 주입구 시스템을 통해 ICP-MS가 계속 작동 중일 때에도 μDG의 편리한 시료 교환 및 세척이 가능하므로 전체 분석 시간과 정렬 불량 위험을 줄일 수 있습니다. 시스템 성능을 테스트하기 위해 잘 특성화된 참조 NP(60 nm AuNP – NIST 8013, 75 nm AgNP – NIST 8017)가 방법 검증 및 비교에 사용됩니다.

프로토콜

1. 이중 주입구 시료 주입 설정 조립

참고: 다른 부품에 대한 자세한 내용은 표 1에 나와 있습니다.

	구성 요소
파트 1	약 10mm 생크 길이의 유리 암 구형 볼 조인트
	약 10mm 섕크 길이의 유리 수 볼 조인트
	금속 T-피스(치수: 1/4인치)
	유리-금속 접착제
	구형 유리 접합부를 위한 2개의 클램프
파트 2	ICP-MS 스프레이 챔버(권장 유형: 임팩트 비드 스프레이 챔버, 사이클론 스프레이 챔버 또는 이와 유사함)
	공압 분무기(권장 유형: 동심 분무기)
	클램프
파트 3	O-링 프리 쿼츠 토치
	가스 라인 커넥터 폐쇄형
	가스 라인 커넥터 개방형
	전도성 및 가동 가능한 실리콘 관
파트 4	압전 마이크로 액적 생성 장치
파트 5	마이크로 액적 제어 장치

표 1: 이중 입구 설정을 구축하는 데 사용되는 구성 요소 목록.

1. T-피스 커넥터 유닛의 구성(그림 1, 파트 1).
   참고: 이 부분은 기존 시료 주입 시스템(1.2단계)과 μDG 수송 장치(1.3단계)를 연결합니다.
   1. 암수 볼 조인트를 T-피스 커넥터의 반대쪽 개구부에 삽입합니다.
   2. 유리-금속 접착제(예: 실리콘 접착제)를 사용하여 수형 및 암형 볼 조인트를 고정합니다.
   3. 클램프를 사용하여 암 볼 조인트를 ICP-MS의 주입기에 연결합니다.
2. 기존 시료 주입 시스템의 부착(그림 1, 파트 2)
   알림: 이 부분은 T-피스 커넥터 유닛에 연결됩니다(1.1단계).
   1. ICP-MS 스프레이 챔버를 사용 중인 스프레이 챔버에 맞는 공압 분무기(PN)와 결합합니다.
   2. cl 사용amp 스프레이 챔버 배출구를 T-피스 커넥터의 수 볼 조인트에 연결합니다(1.1단계에서 설명).
      알림: 스프레이 챔버 배출구에는 일반적으로 암 볼 조인트 커넥터가 장착되어 있습니다. 그림 1 에 표시된 조합은 분무기와 충격 비드 스프레이 챔버로 구성됩니다. 임팩트 비드 스프레이 챔버 대신, 2 내지 10% 이상의 범위의 운송 효율을 가진 다른 스프레이 챔버를 사용할 수 있습니다.
3. 미세방울 수송 장치의 구성(그림 1, 파트 3)
   참고: 이 부분은 T-피스 커넥터 유닛(1.1단계)과 μDG 유닛(1.4단계)을 연결합니다.
   1. 인젝터 튜브가 제거된 분리 가능한 석영 토치를 적절한 클램프를 사용하여 토치 입구가 상단에 있는 실험실 스탠드에 부착합니다.
   2. 토치 플라즈마/보조 가스 주입구를 닫힌 끝 가스 커넥터로 막습니다.
      참고: 샘플은 연동 펌프를 사용하여 분무기로 운반됩니다. 아르곤 가스는 시료를 스프레이 챔버로 분무하고 플라즈마로 추가로 운반하는 데 사용됩니다.
   3. 적절한 가스 커넥터를 사용하여 냉각 가스 주입구를 통해 헬륨 가스 라인을 토치에 연결합니다.
      참고: 적용된 헬륨 가스는 생성된 액적의 탈용매화에 사용되며 피복 가스로 작용하여 액적이 설비 벽과 충돌하는 것을 방지하고 ICP-MS 기기가 대기 중 산소를 삽입하는 것을 방지하는 동시에 μDG의 시료 주입 헤드는 세척 및 시료 교환을 위해 제거해야 합니다.
   4. 어댑터를 사용하여 30cm 길이의 전도성 및 유연한 실리콘 튜브(i.d. 0.75cm)를 토치의 출구 끝(토치 하단)에 연결합니다.
   5. 유연한 실리콘 튜브를 나머지 수직 금속 연결 위로 늘려 실리콘 튜브의 아래쪽 끝을 T-피스 커넥터 장치에 연결합니다.
      참고: 유연한 실리콘 튜브를 사용하면 연결된 설정으로 ICP-MS 기기의 x-y-z를 조정할 수 있습니다.
4. 미세방울 발생 장치와 미세 방울 생성 제어 장치의 연결(그림 1, 파트 4, 파트 5)
   알림: 이 부분은 μDG 전송 장치에 연결됩니다(1.3단계).
   1. μDG 헤드를 토치의 샘플 주입구 끝에 삽입하여 준비된 μDG 장치를 미세방울 수송 장치에 연결합니다.
   2. 전원 공급 장치를 μDG 제어 장치에 연결합니다.
      알림: 여기에 설명된 설정은 시중에서 판매되는 μDG 헤드와 μDG 전원 공급 장치로 구성됩니다. 사용된 μDG 헤드에 따라 설정을 적절하게 조정해야 합니다.

2. 액적 크기의 정량화

1. 스트로보스코프 조명과 CCD 카메라(예: 개방형 구성에서는 그림 1 크기 측정 구성 참조)를 사용하여 μDG에 의해 생성된 액적의 이미지를 촬영합니다.
2. μm 범위에서 알려진 크기의 물체(예: 직경 150μm의 구리선)의 이미지를 촬영하여 CCD 카메라를 보정합니다.
3. 실험에 사용된 설정에서 최소 1,000방울의 이미지를 촬영합니다( 표 2 참조).
4. 적절한 그래픽 소프트웨어 프로그램( 재료 표 참조)을 사용하여 다음 단계에서 물체 및 낙하 크기와 관련된 이미지를 평가합니다.
   1. 파일 및 열기를 클릭하여 개체의 이미지를 로드합니다.
   2. 이미지 | 조정 | 임계값: 스크롤 막대를 이동하여 개체의 영역을 정의합니다.
   3. 적용을 클릭하여 설정을 적용합니다.
   4. Straight segment 버튼을 클릭합니다.
   5. 마우스 왼쪽 버튼을 길게 클릭하여 개체 옆에 선을 그립니다.
   6. Ctrl + M을 눌러 개체 크기를 측정합니다.
   7. 5개의 다른 지점에서 물체의 직경을 측정합니다.
   8. 스프레드시트 소프트웨어에 "결과" 테이블을 복사하여 붙여넣습니다.
   9. "Length" 열의 산술 평균을 계산합니다.
   10. 픽셀 종횡비(PAR) 계산: 이미지의 실제 개체 크기(μm)/평균 개체 크기(px).
   11. File(파일) | 가져오기 | Image Sequence를 사용하여 물방울의 이미지를 가져오고 로드합니다.
   12. 사각형을 클릭하고 첫 번째 이미지의 드롭릿을 표시합니다.
   13. 마우스 패드를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제를 선택하여 이미지 시퀀스의 물방울을 이미지의 나머지 부분과 분리합니다.
   14. 2.4.2단계에서 지정한 대로 배경에서 방울을 분리합니다.
   15. 프로세스 | 바이너리 | 침식하여 액적 표면의 빛 반사를 제거합니다.
   16. 프로세스 | 바이너리 | 팽창시켜 "침식" 단계를 반대로 합니다.
   17. Analyze(분석) | 파티클 분석 | 모든 물방울을 측정하려면 좋습니다.
   18. "Summary(요약)" 또는 "Result(결과)" 테이블을 복사하여 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다.
   19. 페럿 지름의 산술 평균을 px 단위로 계산합니다.
   20. PAR을 사용하여 지름을 μm 단위로 변환합니다. 페럿 지름을 px/PAR 단위로 변환합니다.
       알림: μDG에 의해 형성된 액적의 크기는 피에조 소자⁷에 적용되는 전류 펄스의 선택된 길이와 지속 시간에 따라 다릅니다.

3. 시료 준비

1. 묽은 산(예: HCl(0.5 v/v),_HNO3 (3.5 v/v))에서 0.2 - 20 μg/L의 농도 범위에서 측정할 분석물의 이온 보정 용액을 준비합니다.
2. 묽은 산에서 1 - 10 μg/L 사이의 농도 범위에서 1점 보정을 위한 이온 용액을 준비합니다.
3. 제조업체의 지침 또는 사내 프로토콜에 따라 NP 표준 서스펜션을 준비합니다.
   참고: 3.3.1 – 3.3.4단계는 Ag, Au, CeO₂ NP를 예로 고려하여 NP 표준 서스펜션의 준비를 설명합니다.
   1. PN의 경우 0.05μg/L AuNP 용액 10mL를 준비하고 μDG의 경우 초순수에 1μg/L AuNP 용액을 준비합니다. 사용하기 전에 20-60초 동안 소용돌이.
   2. PN의 경우 0.05μg/L AgNP 용액과 초순수에 대한 2μg/L AgNP 용액을 μDG의 경우 준비합니다. ¹⁵개를 사용하기 전에 20-60초 동안 잘 흔드십시오.
   3. 금속 산화물^16,17에 대해 앞서 설명한 바와 같이 사용할 CeO₂ NP 용액을 준비합니다.
   4. PN의 경우 0.05μg/L CeO₂ NP 용액을, μDG의 경우 1μg/L 용액을 준비합니다.
      1. 총 15 mL – 20 mL의 유리 용기에 25.6 mg/mL CeO₂ NP의 무게를 측정하고 초순수에서 준비된 10 (v/v) BSA 용액 0.05 (v/v) 용액을 추가합니다.
      2. 7.35W의 출력을 가진 손가락 끝 초음파 발생기를 사용하여 입자 용액을 309초 동안 균질화합니다.

4. 악기 튜닝 및 매개 변수

1. MDG 발생기가 꺼져 있는지 확인하고 1단계에서 구축한 이중 주입구 시료 주입 설정을 클램프로 ICP-MS 기기의 주입기에 연결합니다. 분무기 가스(Ar)와 액적 수송 가스(He)로 흡입 시스템을 5 – 10분 동안 세척합니다.
   참고: ICP-MS 기기는 높은 수준의 산소가 플라즈마실로 침투하지 않도록 보호해야 합니다.
2. 액적 수송 가스(He)를 끄고 ICP-MS 시스템을 시작합니다.
3. ICP-MS 시스템 제조업체에서 지정한 기기 표준 튜닝 솔루션을 사용하여 활용하려는 측정 모드에서 기기를 튜닝합니다.
   알림: 표준 튜닝 솔루션은 예를 들어 2.5%(v/v) 질산과 0.5%(v/v) 염산의 혼합물에 바륨, 세륨, 인듐, 우라늄, 비스무트, 코발트, 리튬(모두 1μg/L)으로 구성됩니다.
4. PN의 샘플 흡수율 측정.
   1. 용기에 물 15mL를 채웁니다.
   2. 용기의 무게를 잰다.
   3. 용기를 PN의 튜브에 연결합니다.
   4. 기기 소프트웨어에서 연동 펌프 시작 버튼을 클릭하여 연동 펌프를 시작합니다.
   5. 5분 타이머를 시작합니다.
   6. 5분 직후에 용기에서 흡기 라인을 제거합니다. 용기의 무게를 다시 잰다.
   7. 다음 공식을 사용하여 샘플 흡수율(mL/min)을 계산합니다: vessel weight before - vessel weight after / time duration.
5. 필요한 경우 기기 파라미터를 최적화하여 분석물 감도를 개선합니다(예: 분무기 가스 유량, 샘플링 깊이, 플라즈마 출력).
   참고: ICP-MS 시스템에서 최적화할 수 있는 기기 파라미터의 예는 표 2 를 참조하십시오.
6. 일정한 신호 속도가 방울 형성 속도의 함수로 감지될 수 있을 때까지 He 가스 흐름을 조정합니다.

매개 변수	값
ICP – 석사:
플라스마 파워 (W)	1600
샘플링 깊이 (mm)	4
유량 (L min-1) :
보조 가스	0.65
냉각 가스	14
시간 (초)
데이터 수집 (들)	1200
체류 시간(초)	0.01
인터페이스:
PN 시료 흡수율(mL min-1)	0.21
분무기 가스 (L min-1)	0.92
μDG는 다음과 같습니다.
모세관 직경 (μm)	75
드랍률(Hz)	10
그는 메이크업 가스 (L min-1)	0.27
작동 모드	트리플 펄스
	세트1	세트2	세트3
전압 (V)	53	51	47
펄스 폭(μs)	20	25	12
펄스 지연(μs)	4	2	1

표 2: 사용된 도구 매개변수의 값.

5. 나노 입자 샘플의 다중 모드 측정

1. μDG 제어 장치 준비
   1. μDG 제어 장치의 전원 공급 스위치를 켭니다.
   2. 첫 번째 화면에서 시작을 클릭하여 제어 장치를 시작합니다.
   3. 전역 설정을 클릭하여 사용할 펄스 모드를 선택합니다.
   4. 펄스 모드에서 오른쪽 그래픽 버튼을 클릭하여 트리플 펄스 모드를 선택합니다.
      알림: 트리플 펄스 모드에 대한 설정은 표 2에 나와 있습니다.
2. μDG 단위 준비
   1. On/Off를 클릭하여 μDG를 시작합니다.
   2. 샘플 용기에 측정할 샘플 용액을 채웁니다.
   3. 샘플 용기를 μDG 단위에 연결합니다.
   4. 10mL 주사기를 사용하여 용기와 μDG 장치를 통해 공기를 퍼지합니다.
   5. 주사기를 샘플 용기 용기의 주사기 포트에 연결합니다.
   6. μDG 헤드에서 일정한 액체 흐름이 나오는 것이 관찰될 때까지 주사기 플런저를 밉니다.
   7. 10초 동안 압력을 유지하십시오.
   8. 주사기를 제거합니다.
   9. μDG 단위를 CCD 카메라의 초점 영역에 배치하여 형성된 물방울을 관찰합니다.
   10. CCD 카메라를 PC나 노트북에 연결합니다.
   11. CCD 카메라 소프트웨어를 시작하여 형성된 액적을 관찰합니다.
   12. 시작을 클릭하여 드롭릿의 실시간 보기를 확인합니다.
   13. 일정한 액적 형성을 관찰하십시오.
   14. μDG 헤드를 이중 주입구 시료 주입 시스템의 반전 토치에 놓습니다.
3. 반복되는 다중 포인트 보정을 측정하여 각 관심 요소에 대한 μDG 단위와 PN을 모두 검증합니다.
   참고: ICP-MS 데이터 수집의 경우 기기와 연결된 소프트웨어를 사용하십시오.
4. 실험 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 가져와서 다점 보정의 선형 범위를 결정합니다.
   1. 각 캘리브레이션 포인트의 산술 평균을 계산합니다.
   2. 절편, 기울기 및 상관 계수를 결정합니다.
      참고: sp-ICP-MS의 경우 상관 계수는 >0.99¹⁸이어야 합니다.
5. 나중에 one-point calibration을 위해 calibration curves의 선형 범위 내에서 농도를 선택하십시오.
6. 다중 모드 나노 물질 정량화의 측정 및 검증(NIST 8012, NIST 8013 또는 NIST 8017 또는 이와 유사한 참조 물질 사용)을 위해 아래 단계를 따르십시오(그림 2).
   1. 관심 있는 분석물에 따라 나노 입자와 이온 표준물질을 선택합니다.
   2. 이온 표준 용액으로 5.2에 따라 μDG 단위를 준비합니다.
   3. PN을 통해 희석된 산용액(예: 0.5% v/v HCl)을 추가합니다.
   4. 시간 분해 모드에서 ICP-MS 시스템의 측정을 시작합니다.
   5. 120초 후 On/Off 를 클릭하여 μDG를 중지하고 PN에서 묽은 산 용액을 이온 표준물질로 교환합니다.
   6. 330초 후 PN에서 이온 표준물질을 다시 한 번 묽은 산 용액으로 교환합니다.
   7. 한편 설정에서 μDG 단위를 제거합니다.
   8. μDG 단위를 세척하기 위해 μDG 단위의 샘플 용기(유리 바이알)를 희석된 산 용액(예: 3.5% HNO₃)이 들어 있는 용기로 교환합니다.
      1. 10mL 주사기에 공기를 채웁니다.
      2. 주사기를 μDG 장치의 주입 포트에 연결하고 μDG 헤드에서 액체 제트가 나타날 때까지 주사기를 비우고 30초 동안 압력을 유지합니다.
      3. NP 샘플과 함께 5.2단계에서 지정한 대로 μDG를 준비하고 μDG 단위를 510초에서 설정에 다시 연결합니다.
   9. 810초 후 On/Off 를 클릭하여 μDG를 중지합니다.
   10. PN에서 묽은 산 용액을 NP 샘플과 교환하고 300 초 더 측정합니다.
   11. 약 1,200초 후에 측정을 중지합니다.
   12. 5.5.8단계에서 지정한 대로 μDG 단위를 청소합니다.

그림 2: 다중 모드 나노 물질 정량화를 위한 측정 전략. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 데이터 분석

참고: 모든 계산 단계를 단순화하기 위해 해당 스프레드시트가 준비되었습니다( 보충 파일 참조).

1. 데이터 프레임을 처리할 수 있는 스프레드시트 또는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 측정된 데이터를 가져옵니다. 전체 측정의 intensity 값을 스프레드시트 소프트웨어(전자 보충 자료에 포함됨)의 A 열에 붙여넣으면 데이터가 시각화됩니다. 계산에 필요한 모든 실험 파라미터를 "Input Parameter" 테이블에 입력합니다.
2. 적절한 스프레드시트 셀을 선택하여 μDG 이온(I), PN 이온(II), μDG NP(III) 및 PN NP(IV)에 대한 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 준비된 시트의 그래프를 사용하여 ROI의 경계를 정의하고 값을 "관심 영역 결정" 테이블(셀 C1:E7)에 입력합니다.
3. 각 데이터 세트를 복사하여 별도의 열에 붙여넣습니다. 준비된 시트에서 ROI 복사 버튼을 눌러 측정을 4개의 ROI(M:P 열)로 분할합니다.
4. I와 II의 산술 평균을 계산합니다.
5. 반복 접근법을 적용하여 III 및 IV에 대한 입자 또는 액적 신호와 배경을 분리합니다.
   1. 모든 측정값의 산술 평균과 표준 편차를 계산합니다.
   2. 평균값 + 5*표준 편차로 한계 또는 컷오프 값을 계산합니다.
   3. 식별된 입자 신호에 대해 Cut 명령을 사용하여 한계값 III과 IV보다 작은 모든 신호를 제거합니다. 붙여넣기 를 사용하여 별도의 열에 붙여넣습니다.
   4. 평균값과 표준 편차가 일정해질 때까지 1-3단계를 반복합니다.
      참고: 준비된 시트의 Q열에서 BD열에서 배경 신호와 입자 신호를 분리하기 위한 반복 접근 방식이 5번 수행됩니다.
6. III과 IV의 식별된 입자 신호의 산술 평균을 계산합니다.
7. 분석물의 검출 기기 한계(LOD - 개수), 분석물 민감도(S_{, C, 이온} – 계수/(μg/L)), 시료 흡수율(q_s – mL/min), 수송 효율(η – 상대 단위) 및 벌크 물질 밀도(ρ – g/cm³)를 사용하여 μDG NP 및 PN NP에 대한 최소 검출 가능 입자 크기(LOD_크기 - nm)를 계산합니다.
   1. 
   2. 
8. 표준 용액의 이온 금속 농도(c_{, a} - μg/L)와 플라즈마의 이온 플럭스(counts/s)를 고려하여 적용된 세 가지 분석 모드에 따라 μDG NP 및 PN NP에 대해 식별된 입자 신호의 질량(m_{, a,p}) 및 입자 크기(d – nm)를 계산합니다.
   1. 미사:
   2. 크기:
9. 검출된 입자 수(q_p), 샘플의 입자 농도(c_{p, used} - 1/mL), PN 및 MDG의 분석물 감도(S_{m, ionic, PN,} S_{m, ionic, MDG} – counts/(μg/L)), 액적의 부피(V_drop – pL), 체류 시간 (t_d – ms), PN의 수송 효율 (η_PN), μDG의 수송 효율 (η_μDG), PN 및 μDG에 의해 측정 된 이온 용액의 강도 (I_{ionc, PN,} I_{ionic, μDG} – counts) 및 두 주입 시스템에 사용되는 이온 용액의 농도 (c_{ionic, PN,} c_{이온성, μDG} - μg/L):
   1. 모드 I:
   2. 모드 II:
   3. 
   4. 
   5. 
   6. 
10. μDG의 수송 효율이 1:¹⁹라고 가정합니다.
    1. 
11. 측정 중 주입된 시료량(V_주입)을 고려하여 분석된 NP 용액의 입자 수 농도를 계산합니다.
    
    참고: 준비된 시트에서 모든 계산은 분할 후 자동으로 수행됩니다. 결과는 "출력 매개 변수" 테이블(BH7:BR35 셀)에 표시되며 개별 계산 단계를 포함하여 위에서 설명한 수식을 포함합니다.

결과

그림 3: CCD 카메라로 액적 크기 측정. 150μm 구리선(A)으로 CCD 카메라를 보정하고 달성된 액적 사진을 이진 색상 사진(B)으로 변환한 후 액적 크기를 측정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 이중 입구 설정 검증. 금(Au), 은(Ag) 및 세륨(Ce)에 대한 μDG(A) 및 PN(B) 주입 시스템의 다점 교정. 0.2 – 20 μg ^mL-1 범위의 사용 농도는 감지 된 이벤트 당 질량으로 사용 된 실험 조건에 따라 변환됩니다. 제시된 데이터는 세 개의 독립적인 반복실험의 평균값입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 이중 입구 설정에 대한 측정값을 나타냅니다. 다양한 주입 단계에 대해 그림 2와 같이 컬러 막대가 있는 CeO₂ NP의 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

견본	분석 모드 /	NP 시료용 주입구	교정 표준물질용 주입구	η	M, A, P	NP 크기 (d)	#NPs		회수 (%)
	η PN 측정			(%)	(에프지)	(뉴멕시코)	(mL-1 x103)
재질 보기 56 nm	모드-I /	증권 시세 표시기	PN: Au 이온 및 AuNP 표준	1.8 (0.1)	1.9 (0.5)	57.2 (4.3)	28.1 (0)		100
NIST 8013 (영문)	계수 방법
	모드-II /	증권 시세 표시기	PN/μDG:	1.9 (0.1)	2 (0.4)	58 (3.6)	25.6 (1.6)		91
	감도 비율		Au 이온 표준물질
	모드-III /	μDG (마이크로디지)	μDG는 다음과 같습니다.	100	1.7 (0.2)	55 (2.4)	394.4 (29.3)		70
	ημDG = 1		Au 이온 표준
예상 크기(nm)						56.0 (0.5)
은 75 nm의	모드-I /	증권 시세 표시기	PN: Ag ionic & AgNP 표준	2.3 (0.2)	1.9 (0.2)	70.2 (2.3)	21.6 (0)		100
NIST 8017 (영문)	계수 방법
	모드-II /	증권 시세 표시기	PN/μDG:	2.5 (0.2)	2 (0.2)	71.5 (2.1)	20.5 (1.9)		95
	감도 비율		Ag 이온 표준물
	모드-III /	μDG (마이크로디지)	μDG는 다음과 같습니다.	100	2.5 (0.2)	76.7 (2.3)	757.1 (68.7)		88
	ημDG = 1		Ag 이온 표준
예상 크기(nm)						74.6 (3.8)
CEO2 JRC NM212	모드-I /	증권 시세 표시기	PN : Ce ionic & AuNP 표준	1.7 (0)	0.90 (0.09)	61.9 (2.0)	7.59 (0.32)		-
10-100 nm 수준	계수 방법
	모드-II /	증권 시세 표시기	PN/μDG:	4.9 (1.4)	1.36 (0.35)	70.6 (5.9)	5.42 (1.7)		-
	감도 비율		Ce 이온 표준
	모드-III /	μDG (마이크로디지)	μDG는 다음과 같습니다.	100	1.63 (0.62)	74.4 (9.2)	590 (168)		-
	ημDG = 1		Ce 이온 표준

표 3: 이중 입구 설정의 결과. 세 가지 분석 모드와 세 가지 운송 효율 측정 방법을 사용하여 Au NIST 8013, Ag NIST 8017 및 CeO₂ JRC NM 212 (n=3) NP 재료에 대한 수송 효율, 금속 질량 분율, 직경 및 NP 수 농도. 회수율(%)은 예상 #NPs에 대한 결정된 #NPs의 비율로 정의됩니다. 이 표는 참고^{문헌 14}의 허가를 받아 다시 인쇄되었습니다.

여기에 제시된 프로토콜을 통해 입자 질량과 수 농도를 측정할 수 있습니다. 액적 크기(그림 3)를 포함한 μDG 액적 형성을 사전에 특성화했습니다(표 3).

셋업을 조립하고(그림 1) 액적 크기를 결정한 후, 두 주입 시스템 모두 이온 표준물질로 검증되었습니다(그림 4). r² > 0.99의 정확도는 조사된 모든 요소에 대해 두 사출 시스템을 모두 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 도입 및 수송되는 분석물의 양으로 인해 두 시스템 모두에 차이점이 있습니다. μDG는 수송 효율이 매우 높기 때문에(최대 100%), 낮은 질량 입력과 동시에 PN에 비해 더 높은 분석물 민감도가 관찰됩니다. 그러나 μDG에 의해 도입된 측정된 농도는 두 개의 선형 범위로 분리되어야 합니다. Ag의 경우 첫 번째 선형 범위는 0과 0.5 fg ^event-1 사이에서 관찰될 수 있고 두 번째 선형 범위는 0.5와 fg ^event-1 사이에서 관찰될 수 있습니다. 대조적으로, Ce의 첫 번째 선형 범위는 0에서 0.25 fg ^event-1 사이이고 두 번째 선형 범위는 0.25에서 3 fg ^event-1 사이입니다. 측정된 농도에 대한 PN의 선형 범위는 더 높은 것으로 보입니다. 이는 검출 이벤트당 ICP-MS에 유입된 질량의 차이와 관련이 있을 가능성이 큽니다. μDG는 방울 및 검출 이벤트당 낮은 부피로 일정한 절대량을 주입하여 PN과 함께 샘플을 도입하는 것에 비해 검출 질량을 낮춥니다.

성공적인 검증 후 그림 2에 설명된 대로 실험을 수행할 수 있습니다. 이러한 실험의 결과는_CeO2 NP의 입자 크기 및 수 농도를 측정하기 위해 그림 5에 예시되어 있습니다. 여기에서 μDG 및 PN을 통해 도입된 이온 및 NP 용액에 대한 신호를 식별할 수 있습니다. 조사된 모든 입자에 대해 삼중 측정이 수행되었습니다.

획득된 데이터의 평가는 상기와 같이 수행되었으며, 표 3에 요약되어 있다. 듀얼-인레트 설정 및 세 가지 분석 모드의 검증에 사용되는 Au 및 Ag NP의 경우, 수행된 모든 분석 모드에서 인증된 입자 크기 및 수 농도를 달성할 수 있습니다. CeO₂ 에 대해 얻은 평균 입자 크기는 제조업체가 지정한 범위인 10nm에서 100nm 사이입니다.

그림 1: 이중 흡입구 인터페이스 설정 설계. Part 1 - 커넥터 유닛, Part 2 - 기존 도입 시스템, Part 3 - 미세 방울 수송 장치, Part 4 - 미세 방울 생성 장치, Part 5 - 미세 방울 제어 장치 및 스트로보 스코프 조명 및 CCD 카메라를 포함한 입자 크기 측정을위한 개방형 구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

개발된 이중 주입구 설정의 목적은 조사할 분석물과 독립적으로 다양한 분석 모드를 사용하여 NP의 크기 및 개수 농도와 관련하여 가능한 한 정확하게 NP의 특성화 및 정량화를 수행하는 것입니다. 저용량(pL) 및 높은 질량 수송(최대 100%), 주입 시스템(μDG)을 기존 주입 시스템(PN)과 결합하면 이를 달성할 수 있습니다. 이 작업에 제시된 설정을 사용하여 입자 질량의 정량화에 필요한 원소별 기반 수송 효율을 이온 표준을 기반으로 NP 참조 물질과 독립적으로 결정할 수 있습니다. 또한, μDG와 함께 ICP-MS에 도입된 NP는 더 좁은(AuNP) 또는 유사한(AgNP) 입자 크기 분포를 갖습니다. 그렇지 않으면 CeO₂ 의 경우 μDG에 대한 더 넓은 크기 분포가 관찰되었으며 이는 분석된 샘플의 더 높은 다분산성에 기인할 수 있습니다. 낮은 볼륨의 도입으로 인해, 2개의 NP들이 서로 개별적으로 검출될 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 종래의 셋업⁽¹⁴)에서 1개의 NP로 해석될 것이다.

μDG 전송 장치의 장점은 유연한 실리콘 튜브로 인한 높은 수준의 유연성으로, 이는 설정의 정렬을 단순화합니다. 인젝터가 있는 토치는 ICP-MS에 연결된 상태에서 설정 중에 조정할 수도 있습니다. 추가로 적용된 He 가스 흐름은 μDG 헤드에 의해 형성된 액적과 튜빙 벽⁽²⁰)의 충돌을 방지합니다. 또한 He 가스는 ICP-MS가 아직 작동 중일 때에도 샘플 교환 중에 μDG 헤드를 제거할 수 있습니다. ICP를 작동 상태로 유지하는 것은 안정적이고 견고한 측정을 위해 매우 중요합니다. μDG 헤드는 모든 새로운 샘플 또는 표준물질로 세척하고 헹궈야 하기 때문에 He 흐름은 이 작업에 도입된 주입 시스템의 작동에 매우 중요합니다. 또한 이중 흡입구 설정의 모든 부분을 올바르게 연결하여 산소가 시스템으로 침투하는 것을 방지해야 합니다. 제시된 설정에서 산소를 줄이기 위해 시스템은 플라즈마가 점화되기 전에 최소 5-10분 동안 분무기와 액적 운반 가스로 플러시됩니다.

형성된 액적이 커넥터 장치에 도달하면 습식 플라즈마 상태라고도 하는 분무된 액체 흐름에 의해 플라즈마로 운반됩니다. 건조 플라즈마 조건의 사용과 비교하여 이는 플라즈마의 액체 함량을 증가시킵니다. 결과적으로, 신호 강도는 감소할 뿐만 아니라 신호 증가의 변동, 즉 평균 측정 신호⁽¹³)의 더 높은 표준 편차가 발생합니다. 그러나, μDG를 사용함으로써, 0.2 μg/L 범위의 농도 신호를 배경에서 검출할 수 있다. 액적당 해당 주입 질량은 금속 함량이 낮으며, 이는 일부 원소(즉, Au, Ag, Ce)에 대한 검출 한계에 가깝습니다. 이 한계를 따라 보정을 위해 다른 농도를 사용하는 경우, Ce의 경우 약 0.05μg/L 및 Ag의 경우 2μg/L에서 중첩으로 두 개의 선형 영역을 관찰할 수 있습니다. 중첩 영역 아래에서 관찰된 신호는 원소 특정 배경²¹에 가깝습니다. 이 한계 이상에서는 μDG의 선형 작업 범위를 식별할 수 있습니다. 낮은 농도를 측정할 수 있는 능력에도 불구하고, 액적 내에서 동일한 분석물의 이온과 NP가 동시에 존재하는 경우 이를 구별하는 것은 불가능합니다. 그렇지 않으면, 종래의 도입 시스템을 사용하여 평균 이온 배경을 결정하고 모든 신호에서 빼서 입자 신호만 얻을 수 있습니다.

MDG 기반 시스템에는 제안된 이중 흡입 시스템의 적용으로 부분적으로 우회할 수 있는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 그러나 μDG의 액적 주파수가 50Hz를 초과하면 일관된 액적 패턴을 생성할 수 없습니다. 형성된 액적이 충돌할 수 있으며, 따라서 분석물의 교환이 발생할 수 있습니다. 가스 유량의 올바른 조정은 PN의 올바른 작동뿐만 아니라 ICP-MS 시스템으로 액적의 안정적인 운송을 위해 중요합니다. 제안된 이중 주입 시스템은 현재 샘플 용액을 수동으로 변경해야 하는 요구 사항이 있기 때문에 측정 절차의 자동화를 지원하지 않습니다.

앞으로 μDG는 복잡한 매트릭스 및 환경 시료에서 NP를 특성화하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 용액 점도, 복잡성 및 표면 장력이 높아 μDG가 막히는 것을 방지하려면 적절한 헤드 설계를 사용해야 합니다. μDG 헤드 설계 및 전원 공급 장치의 작동에 따라 표준 참조 물질을 전혀 사용할 수 없는 세포, 미셀 또는 지질 운반체와 같은 입자 유사 시스템을 포함하는 액적을 생성할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Au ionic (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85550.18E
Ag ionic (1000 mg L-1 stock)	Ultra Scientific, RI, USA	ICM-103
Ag NP (75nm, NIST 8017)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		no longer available
Au NP (60nm, NIST 8013)	NIST, Gaithersburg, MD, USA		no longer available
Ce ionic (1000 mg L-1 stock)	VWR, UK	85557.18E
CeO2 (10-100nm, NM212)	EU Joint Research Centre	NM212
Excel 2016	Microsoft
Fiji	ImageJ
Glass female spherical ball + Glass male ball	Fisher Scientific	12499016
HCl (emprove bio)	Merck, Germany	100317
ICP-MS spray chamber with ipact bead	LabKings	LK6-45013 (OEM 3600170)
Metal clamps for spherical glass joint	Fisher Scientific	11322015
Metal T-Piece	Swagelok	SS-4-VCR-T
Microdrop Dispenser Head, non heated	microdrop Technologies	944
Microdrop Dispensing System MD-E-3000	microdrop Technologies
MilliQ water (MilliPore gradient)	Merck MilliPore, Darmstadt, Germany
O-ring free quartz torch	Analytical West	450-301
PFA-ST concentric nebulizer	Elemental Scientific	ES-2042
Silicone Rubber Tubing - 60° Shore - Platinum Cured - Black	Silex
XIMEA Cam Tool	XIMEA