Method Article
הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ליישומים ניסיוניים רבים.
במחקר עיניים, יש צורך חזק מודלים במבחנה של נוירורטינה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור culturing organotypic שלהרשתית הנוירולוגיתשל העכבר עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם (RPE). בהתאם לשאלת המחקר, רטינות יכולות להיות מבודדות מבעלי חיים מסוג בר או ממודלים של מחלות, כדי ללמוד, למשל, רטינופתיה סוכרתית או ניוון רשתית תורשתי. עיניים מתחילת היום שלאחר הלידה 2-9 בעלי חיים הם enucleated בתנאים אספטיים. הם מתעכלים חלקית בחלבון K כדי לאפשר ניתוק של choroid מן RPE. תחת הסטריאוסקופ, חתך קטן נעשה בקרנית יצירת שני קצוות מהמקום שבו choroid ו sclera ניתן לקלף בעדינות מן RPE ו neuroretina. לאחר מכן מסירים את העדשה, וה eyecup נחתך בארבע נקודות כדי להעניק לה צורה בעלת ארבעה טריזים הדומה לעלה תלתן. הרקמה מועברת לבסוף בירידה תלויה לתוך תרבית תאים להוסיף מחזיק קרום culturing פוליקרבונט. התרבויות נשמרות לאחר מכן במדיום R16, ללא סרום או אנטיביוטיקה, בתנאים מוגדרים לחלוטין, עם שינוי בינוני בכל יום שני.
ההליך המתואר מאפשר בידוד של הרשתית ושמירה על ההקשר הפיזיולוגי וההיסטוטיפי הרגיל שלה לתקופות של שבועיים לפחות. תכונות אלה הופכות את תרבויות האקספלנט ברשתית האורגנוטיפית למודל מצוין עם ערך חיזוי גבוה, למחקרים על התפתחות הרשתית, מנגנוני מחלות ואלקטרופיזיולוגיה, תוך מתן אפשרות להקרנה תרופתית.
במחקר עיניים, מגוון מודלים זמינים ללמוד את הרשתית, כולל תרביות תאי רשתית ראשוניות, קווי תאים שמקורם ברשתית, אורגנואידים ברשתית, ובמודלים של בעלי חיים vivo 1,2,3,4,5. עם זאת, כל אחד מהמודלים הללו סובל מחסרונות. לדוגמה, תאים גדלים בבידוד בעוד הרשתית היא רשת מורכבת עם שפע של אינטראקציות תא לתא. לכן, ההתנהגות של תרביות תאים מבודדים עשויה להיות מלאכותית בהשוואה לזה שנצפה ברקמה שלמה. בעיה זו יכולה להיות מתוקנת בחלקה באמצעות אורגנואידים רשתית מובחנים במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד התפתחות וביולוגיה בסיסית6. עם זאת, נכון להיום, דור האורגנואידים ברשתית עדיין גוזל זמן רב, עתיר עבודה וסובל מבעיות רבייה, הדורשות עבודת פיתוח משמעותית נוספת לפני שניתן יהיה להשתמש באורגנואידים למחקר רשתית תרגום. לבסוף, מחקרים על בעלי חיים חיים, בעוד שניתן לטעון את המודל הקרוב ביותר לדרישות של מחקר עיניים, קשורים עם חששות אתיים חזקים. פשרה טובה בין היעילות של מערכות תרביות תאים לבין המצב האמיתי של מודלים של בעלי חיים in vivo הם תרבויות explant רשתית organotypic. תרבויות כאלה גם להפחית את הסבל של בעלי חיים מאז אין התערבויות in vivo מבוצעים.
מספר שיטות תוארו עבור culturing גולים רשתית ממינים שונים5,7,8. הפרוטוקול שלנו מתאר טכניקה לבידוד של נוירורטינה העכבר יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE). טכניקה זו תתאים גם לתרבויות רשתית עכברוש9. התרבות של נוירורטינה יחד עם RPE שלה הוא בעל חשיבות רבה להצלחה. RPE מבצע פונקציות חיוניות עבור הרשתית: הובלת חומרים מזינים, יונים, מים, ספיגת אור והגנה מפני פוטואוקסידציה, איזומריזציה מחדש של כל טרנס-רשתית לתוך 11-cis-רשתית, אשר חיוני עבור מחזור הראייה, phagocytosis של ממברנות פוטורצפטור לשפוך, והפרשת גורמים חיוניים לשלמות המבנית של הרשתית10. שמירה על RPE מאפשר פיתוח מוצלח של קטעים החיצוניים והפנימיים photoreceptor, שמירה על הרשתית קיימא במשך זמן רב יותר11. ההליך המתואר להלן משמר את המאפיינים ההיסטוטיפיים והפיזיולוגיים של הרשתית לפחות שבועיים12. יתר על כן, culturing explants הרשתית organotypic במדיום ללא סרום, ללא אנטיביוטיקה נמנע נוכחות של חומרים לא ידועים ומאפשר פרשנות ישירה של התוצאות12.
תרבויות אקספלנט רשתית organotypic היו חיוניים לשיפור הידע שלנו על התפתחות הרשתית ניוון7,13,14. אנו מראים כאן כי הם גם כלי שימושי עבור הקרנה תרופתי וכי הם יכולים להיות מועסקים כדי מודל מגוון רחב של מחלות רשתית, כולל רטינופתיה סוכרתית.
פרוטוקולים של בעלי חיים התואמים את §4 לחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה להגנה על בעלי חיים באוניברסיטת טיבינגן (Einrichtung für Tierschutz , Tierärztlichen Dienst ו- Labortierkunde; מספר רישום AK02/19M). במחקר זה, רשתית התקבלו סוג פראי (WT) ועכברים rd1, האחרון להיות מודל מאופיין היטב עבור ניוון רשתיתתורשתית 15. עכברים שוכנו תחת תאורה מחזורית לבנה סטנדרטית, הייתה להם גישה חופשית למזון ומים, ושימשו ללא קשר למגדר.
1. רשימת פעולות לביצוע
2. הכנה
3. לאחר הכת
הערה: Explants יכול לשמש עבור יישומים ניסיוניים שונים (כתם מערבי, היסטולוגיה, mounts שלם, ניתוח גנטי, אלקטרופיזיולוגיה). בהתאם ליישום, explants רשתית organotypic ניתן לצלם קפוא, lysed, או מוכן cryosectioning. השלבים הבאים מתארים הכנה היסטולוגית.
איור 1: הליך שלב אחר שלב להכנת תרבויות אקספלנט רשתית אורגנוטיפיות. (A)עיני עכבר מורחבות ומועברות לפתרון של פרוטאינאז K כדי לאפשר הפרדת סקלרה וכורוידים מהרשתית וה- RPE. חתך קטן בשכבת סקלרה / choroid הוא הציג. (B)שני מלקחיים משמשים לקלף את שכבת סקלרה / choroid. (ג)ניתן לראות את שכבת הצ'ורויד השחורה במהלך הקילוף. אפיתל פיגמנט רשתית כהה קו תחתון (RPE) נשאר מחובר לגלגל העין. הסקלרה והכורוידים מוסרים יחד עם עצב הראייה. (D)העדשה והזירם מופקים עם מלקחיים. גוף ciliary הנותרים מוסר. הרשתיתשומרת על צורה דמוית קערה. (ו)כדי לשטח את הרשתית עבור culturing בצלחת, 4 חתכים במרחק שווה סביב הרשתית נעשים עם מספריים, נותן לו צורה דמוית תלתן. תרבות הרשתית מועברת לתרבות קרום להכניס צלחת 6-באר עם שימוש טיפ פיפטה לחתוך 1 מ"ל. הרשתית עדיין שומרת על חלק מצורת הקערה. עם זאת, עם הסרת הנוזל העודף המקיף את הרשתית, הוא ייפתח למבנה מישורי. (G) במערך קרום התרבות, תרבות הרשתית נחה על קרום פוליקרבונט נקבובי (PC) על גבי פתרון של מדיום R16 מלא. כדי להבטיח את הכדאיות, יש לשמור את התרבות באינקובטור סטרילי לח ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2, ואת המדיום צריך להיות מוחלף כל 48 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה
לאחר ביצוע הפרוטוקול, גישושים ברשתית מנותח ותרבותי משמרים את ארכיטקטורת הרקמות הרגילה שלהם, עם שכבות נפרדות, מ- RPE לשכבת תא הגנגליון (GCL), כפי שמוצג באיור 2. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) וגודל השכבה הגרעינית הפנימית (INL) נשארו יציבים ברובם במשך 2-3 שבועות, עם אובדן תאים מתקדם לאט ודילול הדרגתי של שכבות אלה הופכים ברורים יותר ויותר אם תקופת הכת ממושכת ל -4 שבועות ומעבר. ב- GCL, לעומת זאת, בגלל האקסוטומיה של עצב הראייה, דילול מסומן נצפתה בדרך כלל בתוך 4 הימים הראשונים של culturing. לאחר מכן, אוכלוסיית התאים הנותרים ב- GCL (בעיקר תאי אקרין עקורים) תמשיך להיות בת קיימא עוד 3-4 שבועות17,18,19.
איור 2: סוגי תאים הנמצאים בתרבות האקספלנט ברשתית. תרבות ההסבר ברשתית ב- P11 נגזרת מחיות מוטנט rd1 (A)ו- WT (B) המציגות כתמים גרעיניים עם DAPI (שמאל, כחול), פוטורצפטורים מוט (מרכז, אדום) ותאי מולר (ימין, ירוק). הכתם הגרעיני מדגיש את כל השכבות התאיות העיקריות של הרשתית כגון אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), שכבה גרעינית חוצה (ONL), שכבה גרעינית פנימית (INL) ושכבת תא גנגליון (GCL). סוגי תאים ספציפיים בשכבות הגרעיניות, כגון מוטות ותאי מולר, הם immunolabeled עם אלפא arrestin26 ו גלוטמין סינתטאז27 נוגדנים, בהתאמה. (C) מציג קטע באורך מלא של רשתית עכברrd1 שלמה, עם כתמי DAPI המדגישים את העקביות, האינטגרציה וההתפתחות של הרשתית. הרשתיתות האלה היו תרבותיות במשך 6 ימים. תיאור הנוהל: רשתית ו- RPE הנגזרים מבעלי חיים rd1 או WT בודדו ב- P5 ותרבית כמתואר בפרוטוקול, עד P11 עם שינוי בינוני כל 48 שעות. תרבויות תוקנו עם 4% PFA ב P11 ו cryosectioned. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה
מדיום ללא סרום וסביבת הפריה חוץ גופית מתמשכת מאפשרים שליטה מלאה על תנאי הניסוי. כאן, אנו מספקים שתי דוגמאות ליישומים ספציפיים של פרוטוקול זה.
הדוגמה הראשונה ממחישה את האפשרות להשתמש בקללות רשתית למטרות בדיקות סמים או סינון. תרבויות אקספלנט רשתית אורגנוטיפיות הוכנו מדגמי עכברים מסוג פראי (WT) ו- rd1. זה האחרון הוא מודל מאופיין היטב עבור ניוון רשתית15. ברשתית העכבר rd1, ניוון ONL מופעלת על ידי רמות גבוהות באופן חריג של cGMP ב מוט photoreceptors6,20. cGMP מוגזם גורם לפעילות מוגברת של תעלות יון מגודרות נוקלאוטידים מחזוריים (CNGCs) וקינאז חלבון תלוי cGMP (PKG), המוביל למוות תאי21. הטיפול ברשתיות עכבר rd1 עם אנלוגי מבני ל- cGMP (נוקלאוטידים מחזוריים #3; CN003), אשר מטרות הן PKG ו CNGC, נבדק. לאחר הסברה ב-P5, הגיעה הפרדיגמה הטיפולית המתוארת באיור 3A. תרבויות האקספלנט תוקנו עם 4% PFA ב-P11 והוכנו להקפאה(איור 3A). כדי להעריך את מוות התא של חלקים היסטולוגיים ממטופלים, שאינם מטופלים (NT), ודגימות WT, deoxynucleotidyl מסוף transferase dUTP ניק סוף תיוג (TUNEL) assay22 בוצע. הניתוח של תאים המסומנים בתווי TUNEL הראה אחוז גבוה של תאים גוססים ב- ONL של הדגימות הלא מטופלות rd1, בעוד CN003 מוגן rd1 פוטורצפטורים של העכבר כאשר מוחל בריכוז של 50 מיקרומטר23 (איור 3B).
סיבוך שכיח של סוכרת הוא רטינופתיה סוכרתית, מחלה מסנוורת שקשה להתרבות בנאמנות במודלים של בעליחיים 5. הדוגמה השנייה מדגישה את השימוש בתרבויות אקספלנט רשתית organotypic לאפיין את הכדאיות של התא ברשתית בתנאים לחקות סוכרת מסוג 2 (T2DM)24. כאן, השתמשנו 20 מ"מ של מעכב גליקוליזה 2-deoxy-גלוקוז (2-DG)25 ונתנו אותו למדיום התרבות במשך 24 שעות מ P10 ל P11. אנו מראים כי הכפפת מקלפי רשתית WT לתנאים סוכרתיים מדומים במבחנה מובילה למוות תאי עצבי נרחב של הרשתית(איור 3C). פרדיגמה זו בתורה עשויה לשמש, למשל, כדי ללמוד מנגנונים ניווניים או כדי לבדוק טיפולים retinoprotective בהקשר סוכרת.
איור 3: שתי דוגמאות ליישומים של תרבויות אקספלנט רשתית אורגנוטיפיות. (A) תיאור הליך: רשתית ו- RPE הנגזרים מחיות rd1 או WT בודדו ביום שלאחר הלידה (P) 5 ותרבית כמתואר לעיל, עם שינוי בינוני כל 48 שעות. ב P7 ו P9, המדיום בילה הושלך CM טרי המכיל תרכובת פעילה בריכוז של 50 מיקרומטר נוסף לצלחת. תרבויות תוקנו עם 4% PFA ב P11 ו cryosectioned. (B)בדיקות מורכבות על רשתית rd1. קטעים התקבלו מתרבויות WT, מטופלים (003) ולא מטופלים (NT) ברשתית. מבחני TUNEL (אדום) שימשו כסמן למוות תאי. כתמים גרעיניים עם DAPI (כחול). הכימות המוצג בגרף עמודות מדגים את אחוזי התאים הגוססים במצב WT, rd1 NT ו- rd1 003. טיפול עם תרכובת 003 מופחת באופן משמעותי rd1 פוטורצפטור מוות תא. (C) סימולציה של סוכרת מסוג 2 (T2DM) על רשתית WT באמצעות טיפול 2-deoxy-גלוקוז (2-DG). מבחני TUNEL בוצעו בדגימות NT ו- T2DM. הכימות מצביע על עלייה משמעותית מאוד במוות התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה
שולחן S1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה
שולחן S2. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה
שולחן S3. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה
הפרוטוקול שהוצג מתאר תרבויות הסבר אורגנוטיות של רשתית עכבר עם RPE שלם במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. פרוטוקול זה פותח במקור החל מסוף שנות השמונים7,28 ומאז הוא שוכלל ברציפות6,11,12. יישומים בולטים כוללים מחקרים לתוך המנגנונים של ניוון רשתית תורשתית וזיהוי של תרופות retinoprotective23,29,30.
לניסוי מוצלח, יש לקחת בחשבון כמה שיקולים חשובים. להלן מספר נקודות חשובות לפתרון בעיות שיסייעו בשיפור איכות התרבויות. ראשית, תרבויות הרשתית עשויות להציג קיפול מוגזם ו / או היווצרות רוזט31. זה יכול להיגרם על ידי נגיעה ברשתית עם מלקחיים במהלך הליך ההסברה. יתר על כן, הגוף ciliary חייב להיות מוסר לחלוטין מן explant, כמו זה יכול להגדיל את קיפול הרשתית במהלך התרבות. שנית, במהלך העברת הרשתית לצלחת הבאר בטיפה תלויה, אם הרשתית פונה לקרום בצד הלא נכון למטה, לשמור אותו בירידה תלוי מקצה פיפטה בעדינות רבה לדחוף את המדיום פנימה והחוצה של הקצה (מבלי לנתק את טיפת התלייה) כדי להפוך את הרשתית מסביב. לבסוף, אם RPE נשאר מחובר סקלרה וניתוקים מן הרשתית, זה נגרם ככל הנראה על ידי עיכול לא מספיק של סקלרה. בעיה זו יכולה להיות חשובה במיוחד כאשר עובדים עם עיניים מבעלי חיים מבוגרים או מינים שאינם מכרסמים (למשל, חזירים) וניתן לפתור אותה על ידי הגדלת ריכוז החלבון K.
ניהול תרבויות רשתית אורגנוטיפית הוא הליך מורכב הדורש הכשרה וניסיון נאותים. חוסר אימון יכול להוביל לשונות באיכות של מקלפי הרשתית. מסיבות אלה, חשוב לנטר ולאמת את הכדאיות ואת הרבייה, המאפיינים, למשל, את שיעור המוות של תאים עם הבדיקה TUNEL. השימוש במדיום ללא אנטיביוטיקה הופך את מקללי הרשתית לפגיעים לזיהום על ידי חיידקים ופטריות. כדי למזער סיכון זה, אנו ממליצים כי טיפול מסוים נלקח לעבוד בתנאים אספטיים באמת. מגבלה נוספת של פולחן רשתית במבחנה הם הבדלים בסביבה הפיזיוכימית בהשוואה לרשתית in vivo (למשל, אספקת דם choroidal ורשתית, רמות חמצן וגלוקוז, לחץ תוך עיני, הרכב של הזגוגית). מערכת זלוף רציפה, אולי מוטבע לתוך bioreactor ייעודי32 יכול להפוך את הדגם הזה קרוב יותר למצב in vivo. יתר על כן, אקסוטומיה של עצב הראייה במהלך ניתוח רשתית יוביל למוות תא גנגליון, זה יכול לגרום לתגובות מתח8. לכן, מומלץ להשאיר את ההסבר להסתגל לתנאי culturing לפחות 2 ימים במבחנה לפני שהוא נתון מניפולציה ספציפית או טיפול.
השיטה המתוארת מבוצעת בדרך כלל על רקמות רשתית לא בוגרות, אשר עשוי לשרוד היטב במשך 4 שבועות במבחנה7,33. עם זאת, ההליך מותאם למגוון יישומים, כולל culturing של רשתית למבוגרים. למרות גישות שפורסמו שונים לתאר את הבידוד של הרשתית הבוגרת ללא RPE שלה34,35, הדגירה עם פתרון פפאין עד 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח מאפשר RPE להישאר מחובר לרשתית גם כאשר נגזר עכבר בוגר36.
המדיום נטול הסרום וסביבת הפריה המוגדרת כימית מספקים מניפולציה מוגדרת לחלוטין וניתן לשחזור של תנאי הניסוי. לכן, תרבויות הסבר רשתית organotypic הם כלים בעלי ערך בתחום הרפואת עיניים ומדעי המוח, ושימשו לחקר מחלות רשתית37, התפתחות הרשתית38,39, טיפול בתאי גזע ברשתית40, שינויים גנטיים41, הקרנה תרופתית. כדוגמה ספציפית לבדיקות סמים, השתמשנו כאן בתרבויות של אקספלנט ברשתית כדי לבדוק אנלוגי cGMP (CN003), הידוע כמפחית מוות של תאי פוטורצפטור במודלים של בעלי חיים למחלת רשתית תורשתית23 (איור 3B). יישום אפשרי נוסף של הטכניקה מתואר באיור 3C, הממחיש כיצד ניתן לנצל את השליטה המדויקת בסביבת הרקמה כדי לחקות תנאי סוכרת24. בשל שימור ארכיטקטורת הרקמות לאורך כל תקופת הכת, תרביות האקספלנט הרשתית האורגנוטיפיות מתאימות גם למחקרים אלקטרופיזיולוגיים. פונקציונליות עצבית על explants רשתית נחקרו באמצעות הקלטת תיקון מהדק42 ו multi-electrode-מערך (MEA) הקלטה33,43. זה האחרון מאפשר הקלטה של פעילות חשמלית של אוכלוסיות עצביות באותו זמן כבר מנוצל לאפיין פוטורצפטור פונקציונליות תא גנגליון בתנאי תרבות. בפרספקטיבה רחבה יותר, ניתן ליישם את מערכות תרבות ההסברה האורגנוטיפיות גם במחקר פרה-קליני, שבו תרבויות הסבר שימשו לבדיקת היעילות הטיפולית של היפותרמיה44.
טכניקת culturing explanuring organotypic הוא פשוט יחסית לבצע, בהשוואה לניסויים מקבילים vivo, הוא פחות יקר זמן רב, ומונע את החששות האתיים הקשורים מחקרים בבעלי חיים. השליטה המדויקת בתנאי הניסוי ובשימור RPE ומורכבות הרקמות הופכים את השיטה לכלי רב ערך לשיפור הידע שלנו על פיזיולוגיה ברשתית ופתופיזיולוגיה ולאפשר יישומים ניסיוניים רבים.
למחברים אין מה לחשוף.
עבודת מחקר זו זכתה לתמיכה כספית מהאיחוד האירופי (transMed; H2020-MSCA-765441), מועצת המחקר הגרמנית (DFG; PA1751/8-1, 10-1) ומועצת המלגות של סין.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biotin | Sigma | B4639 | |
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) | Sigma | T1395 | |
BSA | Sigma | B4639 | |
CDP-Choline-Na | Sigma | 30290 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
CuSO4 × 5H2O | Sigma | C8027 | |
DL-Tocopherol | Sigma | T1539 | |
Ethanolamine | Sigma | E0135 | |
FCS | Sigma | F7524 | |
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm | SARSTEDT | 83.3942.101 | for Basal Medium |
Forceps | F.S.T | 15003-08 | |
Glutamine | Sigma | G8540 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I6634 | |
L-CysteineHCl | Sigma | C7477 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
MnCl2 x 4H2O | Sigma | M5005 | |
Na-pyruvate | Sigma | P3662 | |
NaSeO3 x 5H2O | Sigma | S5261 | |
Ophthalmic microscope scaping spoon | F.S.T. | 10360-13 | |
Progesteron | Sigma | P8783 | |
Proteinase K | MP Biomedicals | 21935025 | 44 mAnson U/mg |
R16 | Gibco | 07491252A | |
Retinol | Sigma | R7632 | |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | |
Scissors | F.S.T | 15004-08 | |
Sterile filter 0.22µm | MILLEX GP | SLGP033RS | for supplements |
T3 | Sigma | T6397 | |
Tocopherylacetate | Sigma | T1157 | |
Transferrin | Sigma | T1283 | |
Transwell permeable supports | Corning | 3412 | |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
Vitamin C | Sigma | A4034 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved