Долгосрочное, без сыворотки культивирование органотипических мышь Сетчатки Explants с Intact сетчатки Пигмент Эпителий

Резюме

Протокол описывает органотипические экспланты мышечной нейро сетчатки,культивируемые вместе с эпителием пигмента сетчатки (RPE), в R16 определяется среда, без сыворотки и антибиотиков. Этот метод относительно прост в работе, дешевле и оторится по сравнению с экспериментами in vivo и может быть адаптирован к многочисленным экспериментальным приложениям.

Аннотация

В офтальмологических исследованиях существует сильная потребность в моделях in vitro нейроретины. Здесь мы представляем подробный протокол для органотипического культивирования мыши нейро сетчатки снетронутыми эпителия пигмента сетчатки (RPE). В зависимости от исследовательского вопроса, сетчатка может быть изолирована от диких животных типа или от моделей заболеваний, для изучения, например, диабетической ретинопатии или наследственной дегенерации сетчатки. Глаза с раннего послеродового дня 2-9 животных окутылись в асептических условиях. Они частично перевариваются в протеиназе K, чтобы обеспечить отделение хороида от RPE. Под стереоскопом, небольшой разрез делается в роговице, создавая два края, откуда хороид и склера могут быть аккуратно очищены от RPE и нейроретины. Объектив затем удаляется, и глазная чашка разрезается на четыре точки, чтобы придать ему четырехклинтовую форму, напоминающую лист клевера. Ткань, наконец, передается в висячие капли в клеточной культуры вставить проведение поликарбонат культивирования мембраны. Культуры затем поддерживаются в R16 среде, без сыворотки или антибиотиков, в полностью определенных условиях, со средним изменением каждый второй день.

Описанная процедура позволяет изоляции сетчатки и сохранению ее нормального физиологического и гистотипического контекста для культивирования периодов не менее 2 недель. Эти особенности делают органотипические культуры экзацации сетчатки отличной моделью с высокой прогно производительности, для исследований в области развития сетчатки, механизмов заболевания и электрофизиологии, в то же время позволяя фармакологический скрининг.

Введение

В офтальмологических исследований, различные модели доступны для изучения сетчатки, в том числе первичных культур клеток сетчатки, сетчатки полученных клеточных линий, органоидов сетчатки, и in vivo животных^{моделей 1,2,3,4,5}. Однако каждая из этих моделей страдает от недостатков. Например, клетки растут изолированно, в то время как сетчатка является сложной сетью с множеством взаимодействий между клетками и клетками. Таким образом, поведение изолированных клеточных культур, вероятно, будет искусственным по сравнению с поведением, наблюдаемым во всей ткани. Эта проблема может быть частично устранена с помощью in vitro дифференцированных органоидов сетчатки, которые могут быть использованы для изучения развития и основной биологии⁶. Тем не менее, на сегодняшний день, генерация органоидов сетчатки по-прежнему является трудоемкой, трудоемкой, и страдает от проблем воспроизводимости, требующих существенной дальнейшей работы по развитию, прежде чем органоиды могут быть использованы для трансляционных исследований сетчатки. Наконец, исследования на живых животных, в то время как, возможно, модель, которая ближе всего к требованиям офтальмологических исследований, связаны с сильными этическими проблемами. Хорошим компромиссом между эффективностью систем клеточной культуры и реальной ситуацией моделей животных in vivo являются органотипические культуры эксплантации сетчатки. Такие культуры также уменьшают страдания животных, поскольку никаких вмешательств in vivo не проводится.

Несколько методов были описаны для культивирования сетчатки explants от различных^{видов 5,7,8}. Наш протокол описывает метод изоляции нейроретина мыши вместе с его эпителием пигмента сетчатки (RPE). Этот метод также будет подходит для крыс сетчатки культур⁹. Культура нейроретины вместе с RPE имеет большое значение для успеха. RPE выполняет основные функции для сетчатки: транспортировка питательных веществ, ионов, воды, поглощение света и защита от фотооксиды, ре-изомеризация все-транс-сетчатки в 11-cis-retinal, что имеет решающее значение для визуального цикла, фагоцитоз пролить фоторецептор мембраны, и секреция основных факторов^{для структурной целостности сетчатки 10}. Поддержание RPE позволяет успешно развлёрку фоторецептора внешних и внутренних сегментов, сохраняя сетчатку жизнеспособной в течение более длительного^{времени 11}. Описанная ниже процедура сохраняет гистотипические и физиологические характеристики сетчатки, по крайней мере, в течение двух^{недель 12}. Кроме того, культивирование органотипических экзплантов сетчатки в безотко сыворотке, без антибиотиков среде позволяет избежать присутствия неизвестных веществ и позволяет простой интерпретации^{результатов 12}.

Органотипические культуры экзплантации сетчатки имеют важное значение для улучшения наших знаний о развитии^{сетчатки и дегенерации 7,13,14}. Мы показываем здесь, что они также являются полезным инструментом для фармакологического скрининга и что они могут быть использованы для моделирования различных заболеваний сетчатки, в том числе диабетической ретинопатии.

протокол

Протоколы животных, соответствующие No 4 немецкого закона о защите животных, были рассмотрены и утверждены комитетом Тюбингенского университетапо защите животных (Эйнрихтунг фюр Тиршутц, Тьерцтлихен Дьенст и Лабортьеркунде; Номер регистрации AK02/19M). В этом исследовании, сетчатки были получены от диких типов (WT) и rd1 мышей, последний является хорошо охарактеризованной моделью для наследственной дегенерации^{сетчатки 15}. Мыши размещались под стандартным белым циклическим освещением, имели свободный доступ к пище и воде и использовались независимо от пола.

1. Контрольный список

1. Для обеспечения стерильных условий и избежать загрязнения, очистить и дезинфицировать ламинарный воздушный поток капот с 70% этанола. Обязательно дайте этанолу полностью испариться, чтобы предотвратить интоксикацию культур сетчатки.
2. Инструменты автоклава (например, ножницы, типсы и офтальмологический микроскоп, выскабливание ложки) перед использованием.
3. Подготовьте следующие средства заранее под капотом ламинарного потока, в стерильных условиях: Базал R16 средний (BM) (может храниться при 4 КК в течение 4 недель), БМ с 20% фетальной сыворотки теленка (FCS) (в тот же день использования), BM с 0 0,12% протеиназы K (44 мЭнсон U/mg) раствор (в тот же день использования) и полный R16 среды с добавками (CM), как описано Romijn^{16 (может} храниться при 4 КК в течение 3 недель) (см. таблицы S1, S2 и S3).
4. Разогреть раствор протеиназы K при 37 градусов по Цельсию, чтобы активировать его и использовать его в шаге 2.5.

2. Подготовка

1. Пожертвование rd1/WT животных в послеродовой день (P) 5 путем обезглавливания. Для животных старше P11 используйте CO_{2 и/или} вывих шейки матки в соответствии с местными правилами защиты животных.
2. В зависимости от возраста животного, до enucleation, при необходимости, открыть крышки глаз с помощью типсов и очень тщательно отделить крышки глаз, не касаясь или царапин глаза ниже.
3. Быстро окутывают глаза под стереоскоп с помощью изогнутых типсов.
4. Инкубировать глаза в БМ в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
5. Инкубировать глаза в разогретой БМ, с 0,12% протеиназы K при 37 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
6. Выполните следующие шаги внутри капота потока ламинарного воздуха, чтобы обеспечить стерильные условия. Для инактивации протеиназы K, передача глаз на БМ, содержащие 20% FCS и инкубировать в течение 5 минут на RT.
7. Рассекают глаза под стереоскопом, асептически, в чашке Петри, содержащей свежий БМ на RT. Инициировать вскрытие как можно скорее после enucleation. Чем дольше на этот раз, тем труднее вскрыть сетчатку, глаза становятся очень мягкими.
   1. С типсами, держать глаз от зрительного нерва. Используя тонкие ножницы, сделать небольшой разрез в роговице создания 2 края, откуда роговица, хороид и склера могут быть аккуратно очищены с помощью 2 пар тонких типсов(рисунок 1 шаги А-С). Кроме того, используйте канюлю узкого калибра, чтобы сделать первый разрез в роговицу, а затем вставить один из лезвий ножницы в отверстие.
   2. Возьмитесь за объектив с мелкими типсами. Поместите вторую пару типсов перпендикулярно первым, чтобы первые типсы были между 2 хвостовиком второго. Вытяните, чтобы извлечь объектив из чашки глаза. Если стекловидное и цилиарное тело все еще прикреплены к сетчатке, удалите их тщательно(рисунок 1 шаг D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.7.1 и 2.7.2 нуждаются в практике и обеспечивают осторожность, чтобы не повредить сетчатку.
   3. Разрежьте сетчатку перпендикулярно ее краям в четырех точках, создавая четырехлистную формуклевера (рисунок 1 шаг E-F).
   4. Используя пипетку с широко вырезанной основой кончика 1 мл, удерживайте сетчатку в подвесной капле среды и перенесите ее в вставку фильтра культуры, помещенную в пластину культуры 6-хорошо. Слой RPE должен выйти на мембрану(рисунок 1 шаг G).
   5. Используя пипетку, аккуратно снимите излишки среды с вставки.
   6. Со стороны колодец добавьте 1 мл СМ на колодец и инкубировать в стерильном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% CO_2. Не погружать сетчатку в среду, как это позволит уменьшить оксигенацию и вызвать дегенерацию тканей. Эксплант должен оставаться на стыке жидкости и воздуха, покрытый только тонкой пленкой жидкости, созданной поверхностным натяжением воды.
8. Оставьте сетчатку нетронутой в течение первых 48 ч, чтобы облегчить восстановление после процедуры эксплантации.
9. Изменение среды каждый второй день (48 ч). Отбросьте 700 МКЛ среды из каждой хорошо и добавить 900 йл свежего CM в колодец. Таким образом, количество среды, потерянной в результате испарения восстанавливается и сетчатки эксплантации сохраняет некоторые из нейропротекторных факторов, производимых в предыдущих 48 ч.
10. Инкубировать удаленную среду в отдельную и закрытую трубку микроцентрифуга вместе с культурами для контроля и оценки возможного загрязнения (т.е. изменения цвета среды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатки explants могут храниться в культуре, по крайней мере 2 недели¹².

3. После культивирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты могут быть использованы для различных экспериментальных применений (западная помарка, гистология, целые крепления, генетический анализ, электрофизиология). В зависимости от применения, органотипические экза растениями сетчатки могут быть заморожены, лизированы или подготовлены к криозиции. В приведенных ниже шагах описывается гистологическая подготовка.

1. Выполните 45-минутную фиксацию с 4% параформалдегидом (PFA), а затем постепенную криопротезирование сахарозы (10% сахарозы в течение 10 мин, 20% в течение 20 мин и 30% для 2 ч при комнатной температуре (RT) или на ночь (ON) при температуре 4 градусов по Цельсию). Добавьте эти буферы прямо в колодец.
2. Вырежьте мембрану вокруг экзплантов сетчатки.
3. Встраивать как мембраны и ткани сетчатки в среде для замороженных тканей.

Рисунок 1: Пошаговая процедура подготовки органотипических культур сетчатки. (A)Мышиные глаза инкульируется и передаются в раствор протеиназы K, чтобы позволить отделение склеры и хороида от сетчатки и RPE. Вводится небольшой разрез в склере/хороидном слое. (B)Два типса используются для очистки слоя склеры/хороида. (C)Черный слой хороида можно увидеть во время пилинга. Подмыкающий темный пигмент сетчатки эпителия (RPE) остается прикрепленным к глазному яблоку. Склера и хороид удаляются вместе с зрительным нервом. (D)Объектив и стекловидное дело извлекаются с помощью типсов.  Оставшееся цилиарное тело удаляется. (E)Сетчатка сохраняет форму, похожую на чашу. (F) Чтобы сгладить сетчатку для культивирования в блюдо, 4 разреза на равном расстоянии вокруг сетчатки сделаны ножницами, придавая ему клеверную форму. Культура сетчатки переносится в мембранную культурную вставку в пластине из 6 колодец с использованием наконечника пипетки с разрезом 1 мл. Сетчатка по-прежнему сохраняет некоторые чаши формы. Однако при удалении лишней жидкости, окружающей сетчатку, она развернется до планарной структуры. (G)В установке мембраны культуры культура сетчатки опирается на пористую поликарбонатную мембрану (PC) поверх раствора полной среды R16. Чтобы обеспечить жизнеспособность, культура должна храниться во влажном стерильном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5% CO_2,и среда должна быть заменена каждые 48 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры

Результаты

После следовать протоколу, расчлененные и культурные экспланты сетчатки сохраняют свою нормальную архитектуру тканей, с различными слоями, от RPE до слоя ганглионных клеток (GCL), как показано на рисунке 2. Внешний ядерный слой (ONL) и размер внутреннего ядерного слоя (INL) оставались в основном стабильными в течение 2-3 недель, при этом медленно прогрессирующая потеря клеток и постепенное истончение этих слоев становилось все более и более очевидным, если период культивирования продлевается до 4 недель и далее. В GCL, напротив, из-за аксотомии зрительного нерва, заметное истончение обычно наблюдается в течение первых 4 дней культивирования. После этого, оставшаяся популяция клеток в GCL (в основном перемещенных клеток амакрин) будет по-прежнему жизнеспособным в течение еще 3-4 недель^17,18,19.

Рисунок 2: Типы клеток, найденных в культуре эксплантации сетчатки. Культура посадки сетчатки на P11, полученная от мутантов rd1 (A)и WT животных (B ),показывающихядерное окрашивание с DAPI (слева, синий), фоторецепторы стержня (в центре, красный) и клетки Мюллера (справа, зеленый). Ядерное окрашивание выделяет все основные клеточные слои сетчатки, такие как, эпителий пигмента сетчатки (RPE), внешний ядерный слой (ONL), внутренний ядерный слой (INL) и слой ганглионных клеток (GCL). Специфические типы клеток в ядерных слоях, таких как стержни и клетки Мюллера, иммунолабелированы^{альфа-арестином 26} и^{глутамин-синтезетазом 27} антител, соответственно. (C) Показывает полную длину раздела   всей сетчатки мыши rd1, с DAPI окрашивания подчеркнув консистенцию, интеграцию и развитие сетчатки. Эти сетчатки были культурны в течение 6 дней. Описание процедуры: Сетчатка и RPE, полученные из животных rd1 или WT, были изолированы в P5 и культурировались, как описано в протоколе, до P11 со средним изменением каждые 48 ч. Культуры были зафиксированы с 4% PFA на P11 и криозекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры

Безытовая среда и устойчивая среда in vitro позволяют иметь полный контроль над экспериментальными условиями. Здесь мы привести два примера для конкретных приложений этого протокола.
Первый пример иллюстрирует возможность использования экза растений сетчатки для тестирования на наркотики или скрининга. Органотипические культуры экза растений сетчатки были подготовлены из моделей мышей дикого типа (WT) и rd1. Последний является хорошо охарактеризованной моделью для дегенерации сетчатки¹⁵. В сетчатке мыши rd1 дегенерация ONL вызвана аномально высоким уровнем cGMP в фоторецепторах^{стержня 6,20}. Чрезмерное cGMP вызывает повышенную активность циклических нуклеотидных закрытых ионных каналов (CNGCs) и cGMP-зависимой белковой киназы (PKG), что приводит к^{гибели клеток 21}. Обработка сетчатки мыши rd1 со структурным аналогом cGMP (циклический нуклеотидный #3; CN003), которая нацелена как на ПКГ, так и на CNGC, была протестирована. После эксплантации на P5, парадигма лечения, описанная на рисунке 3A, была соблюдена. Explant культур были зафиксированы с 4% PFA на P11 и подготовлены для криозирования (Рисунок 3A). Для оценки клеточной смерти гистологических секций от обработанных, необработанные (NT) и WT образцов, был выполнен терминальный дезоксинуклеотидный трансферазы dUTP nick end маркировки (TUNEL) анализ^22. Анализ TUNEL помечены клетки показали высокий процент умирающих клеток в ONL из rd1 необработанных образцов, в то время как CN003 защищены rd1 мыши фоторецепторы при применении в концентрации 50^{МК 23} (Рисунок 3B).

Частым осложнением диабета является диабетическая ретинопатия, ослепляющая болезнь, которую трудно точно воспроизвести в животных моделях^5. Второй пример подчеркивает использование органотипических культур экзплантации сетчатки для характеристики жизнеспособности клеток сетчатки в условиях, омулирующих сахарный диабет типа-2 (T2DM)²⁴. Здесь мы использовали 20 мМ ингибитора гликолиза 2-дези-глюкозы (2-DG)²⁵ и вводили его в культурную среду в течение 24 ч от P10 до P11. Мы показываем, что подвержение WT сетчатки explants таких в пробирке моделируемых диабетических условий приводит к обширной нейрональной клеточной смерти сетчатки (Рисунок 3C). Эта парадигма, в свою очередь, может быть использована, например, для изучения дегенеративных механизмов или для тестирования ретинопротекторного лечения в контексте диабета.

Рисунок 3: Два примера для применения органотипических культур сетчатки explant. (A)Описание процедуры: Сетчатка и RPE, полученные из rd1 или WT животных были изолированы в послеродовой день (P) 5 и культурны, как описано выше, со средним изменением каждые 48 ч. На P7 и P9 отласытая среда была выброшена, а в тарелку был добавлен свежий СМ, содержащий активное соединение в концентрации 50 МКМ. Культуры были зафиксированы с 4% PFA на P11 и криозекции. (B)Подворье тестирования на сетчатке rd1. Разделы были получены из WT, лечение (003), и необработавных (NT) органотипических культур сетчатки explant. АНАЛИЗ TUNEL (красный) был использован в качестве маркера для клеточной смерти. Ядерное окрашивание с DAPI (синий). Квантификация, показанная на графике баров, иллюстрирует процент умирающих клеток в wt, rd1 NT и rd1 003. Лечение соединением 003 значительно уменьшило смерть фоторецепторных клеток rd1. (C) Моделирование сахарного диабета типа-2 (T2DM) на сетчатке WT с использованием 2-дезиокси-глюкозы (2-DG) лечения. Анализ TUNEL проводился на образцах NT и T2DM. Количественная оценка указывает на значительное увеличение смертности клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры

Таблица S1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить таблицу  

Таблица S2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить таблицу  

Таблица S3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить таблицу  

Обсуждение

Представленный протокол описывает органотипические культуры эксплантации сетчатки мыши с нетронутой RPE в определенной среде R16, свободной от сыворотки и антибиотиков. Этот протокол был первоначально разработан, начиная с конца 1980-х^{годов 7,28} и с тех^{пор он был постоянно уточнены 6,11,12}. Известные применения включают исследования механизмов наследственной дегенерации сетчатки и выявление ретинопротекторных^{препаратов 23,29,30.}

Для успешного эксперимента необходимо принять во внимание некоторые важные соображения. Вот несколько важных моментов устранения неполадок, которые помогут повысить качество культур. Во-первых, культуры сетчатки могут отображать чрезмерное складывание и/ или образование^{розетки 31}. Это может быть вызвано касанием сетчатки мипсами во время процедуры эксплантации. Кроме того, цилиарное тело должно быть полностью удалено из экспланта, так как это может увеличить складывание сетчатки во время культуры. Во-вторых, во время передачи сетчатки на пластину хорошо в висячие капли, если сетчатка лица мембраны неправильную сторону вниз, держать его в капле висит от кончика пипетки и очень осторожно нажмите среды в и из кончика (без отсоединения висячие капли), чтобы перевернуть сетчатку вокруг. Наконец, если RPE остается прикрепленным к склере и отделяется от сетчатки, это, скорее всего, вызвано недостаточным predigestion склеры. Эта проблема может быть особенно важна при работе с глазами пожилых животных или не грызунов видов (например, свиней) и может быть решена за счет увеличения концентрации протеиназы K.

Проведение органотипических культур экзплантации сетчатки является сложной процедурой, которая требует адекватной подготовки и опыта. Отсутствие подготовки может привести к изменчивости качества экзплантов сетчатки. По этим причинам важно контролировать и проверять жизнеспособность и воспроизводимость, характеризовав, например, уровень смертности клеток с помощью анализа TUNEL. Использование среды, свободной от антибиотиков, делает экзпланты сетчатки уязвимыми для загрязнения бактериями и грибками. Чтобы свести к минимуму этот риск, мы рекомендуем, чтобы особое внимание было принято для работы в действительно асептических условиях. Еще одним ограничением культивирования сетчатки в пробирке являются различия в физиохимической среде по сравнению с сетчаткой виво (например, хороидная и сетчатка крови, уровень кислорода и глюкозы, внутриглазное давление, состав стекловидного тела). Непрерывная перфузионная система, возможно, встроенная в специальный биореактор^32, может приблизить эту модель к состоянию in vivo. Кроме того, аксотомия зрительного нерва во время вскрытия сетчатки приведет к гибели ганглионных клеток, что может вызвать стресс ответы⁸. Поэтому рекомендуется оставить эксплант для адаптации к условиям культивирования в течение не менее 2 дней в пробирке, прежде чем он подвергается конкретной манипуляции или лечения.

Описанный метод обычно выполняется на незрелых тканях сетчатки, которые могут хорошо выжить в течение 4 недель в пробирке^7,33. Тем не менее, процедура адаптируется к различным приложениям, включая культивирование взрослой сетчатки. Хотя различные опубликованные подходы описывают изоляцию сетчатки взрослого человека без RPE^34,35, инкубации с раствором папаина на срок до 1 ч при 37 градусов по Цельсию до вскрытия позволяет RPE оставаться прикрепленным к сетчатке, даже если производные от взрослых^{мыши 36}.

Среда, свободная от сыворотки, и химически определенная среда in vitro обеспечивают полностью определенные и воспроизводимые манипуляции экспериментальными условиями. Таким образом, органотипические культуры экзплантации сетчатки являются ценными инструментами в области офтальмологии и неврологии, и были использованы для^{изучения заболеваний сетчатки 37},^{развитие сетчатки 38,39}, терапия стволовыми клетками^{сетчатки 40}, генетические^{изменения 41}, и фармакологический скрининг. В качестве конкретного примера тестирования на наркотики, здесь мы использовали сетчатки explant культур для тестирования аналога cGMP (CN003), как известно, уменьшить смерть фоторецепторных клеток в животных моделях для наследственных заболеваний^{сетчатки 23} (Рисунок 3B). Другое возможное применение метода описано на рисунке 3C, который иллюстрирует, как точный контроль среды тканей может быть использован для эмулировать диабетических^{условий 24}. Из-за сохранения архитектуры тканей в течение всего периода культивирования, органотипические культуры эксплантации сетчатки также подходят для электрофизиологических исследований. Нейронная функциональность на сетчатке explants были исследованы с помощью патч-зажим^{записи 42} и мульти-электрод-array (MEA)^{запись 33,43}. Последний позволяет одновременно записывать электрическую активность популяций нейронов и используется для характеристики фоторецептора и функциональности ганглионных клеток в культурных условиях. В более широкой перспективе, органотипические системы культуры explant также могут быть применены в доклинических исследованиях, где экзплантные культуры были использованы для проверки терапевтической^{эффективности гипотермии 44}.

Органотипический метод культивирования explant относительно прост в работе и, по сравнению с соответствующими экспериментами in vivo, является менее дорогостоящим и трудоемким, и позволяет избежать этических проблем, связанных с живыми исследованиями на животных. Точный контроль над экспериментальными условиями и сохранение RPE и сложности тканей делают метод ценным инструментом для улучшения наших знаний о физиологии сетчатки и патофизиологии и позволяют многочисленные экспериментальные применения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotin	Sigma	B4639
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid)	Sigma	T1395
BSA	Sigma	B4639
CDP-Choline-Na	Sigma	30290
Corticosterone	Sigma	C2505
CuSO4 × 5H2O	Sigma	C8027
DL-Tocopherol	Sigma	T1539
Ethanolamine	Sigma	E0135
FCS	Sigma	F7524
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm	SARSTEDT	83.3942.101	for Basal Medium
Forceps	F.S.T	15003-08
Glutamine	Sigma	G8540
Glutathione	Sigma	G6013
Insulin	Sigma	I6634
L-CysteineHCl	Sigma	C7477
Linoleic Acid	Sigma	L1012
Linolenic Acid	Sigma	L2376
MnCl2 x 4H2O	Sigma	M5005
Na-pyruvate	Sigma	P3662
NaSeO3 x 5H2O	Sigma	S5261
Ophthalmic microscope scaping spoon	F.S.T.	10360-13
Progesteron	Sigma	P8783
Proteinase K	MP Biomedicals	21935025	44 mAnson U/mg
R16	Gibco	07491252A
Retinol	Sigma	R7632
Retinyl acetate	Sigma	R7882
Scissors	F.S.T	15004-08
Sterile filter 0.22µm	MILLEX GP	SLGP033RS	for supplements
T3	Sigma	T6397
Tocopherylacetate	Sigma	T1157
Transferrin	Sigma	T1283
Transwell permeable supports	Corning	3412
Vitamin B1	Sigma	T1270
Vitamin B12	Sigma	V6629
Vitamin C	Sigma	A4034