Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

Resumo

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Resumo

Na pesquisa oftalmica, há uma forte necessidade de modelos in vitro da neuroretina. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a cultura organotípica daretina neurodo camundongo com epitélio pigmento de retina intacto (RPE). Dependendo da questão da pesquisa, as retinas podem ser isoladas de animais do tipo selvagem ou de modelos de doenças, para estudar, por exemplo, retinopatia diabética ou degeneração da retina hereditária. Olhos do início do pós-natal 2-9 animais são enucleados sob condições assépticas. São parcialmente digeridos em proteinase K para permitir um descolamento do coroide do RPE. Sob o estereoscópio, uma pequena incisão é feita na córnea criando duas bordas de onde o coroide e esclera podem ser suavemente descascados do RPE e neuroretina. A lente é então removida, e a pálpebra é cortada em quatro pontos para dar-lhe uma forma de quatro cunhas semelhante a uma folha de trevo. O tecido é finalmente transferido em uma gota de enforcamento em uma inserção de cultura celular segurando uma membrana de cultivo de policarbonato. As culturas são então mantidas em meio R16, sem soro ou antibióticos, em condições totalmente definidas, com uma mudança média a cada dois dias.

O procedimento descrito permite o isolamento da retina e a preservação de seu contexto fisiológico normal e histotípico para períodos de cultivo de pelo menos 2 semanas. Essas características tornam as culturas de explantização da retina organotípica um excelente modelo com alto valor preditivo, para estudos sobre desenvolvimento da retina, mecanismos de doença e eletrofisiologia, ao mesmo tempo em que permitem o rastreamento farmacológico.

Introdução

Em pesquisas oftálmicas, uma variedade de modelos estão disponíveis para estudar a retina, incluindo culturas primárias de células da retina, linhas celulares derivadas da retina, organoides de retina e modelos in vivo animais^1,2,3,4,5. No entanto, cada um desses modelos sofre de desvantagens. Por exemplo, as células crescem isoladamente enquanto a retina é uma rede complexa com uma infinidade de interações célula-célula. Assim, o comportamento das culturas celulares isoladas é provável que seja artificial em comparação com o observado em todo um tecido. Esse problema pode, em parte, ser remediado usando organoides in vitro diferenciados da retina, que podem ser usados para estudar o desenvolvimento e a biologia básica⁶. No entanto, a partir de hoje, a geração organoide da retina ainda é demorada, intensiva em mão-de-obra, e sofre de problemas de reprodutibilidade, exigindo um trabalho substancial de desenvolvimento antes que os organoides possam ser usados para pesquisas translacionais da retina. Finalmente, estudos sobre animais vivos, embora indiscutivelmente o modelo que se aproxima mais dos requisitos da pesquisa oftalmóica, estão associados a fortes preocupações éticas. Um bom compromisso entre a eficiência dos sistemas de cultura celular e a situação real dos modelos in vivo animais são culturas organotípicas de explant retina. Tais culturas também reduzem o sofrimento animal, uma vez que não são realizadas intervenções in vivo.

Vários métodos foram descritos para a cultura de explanações de retina de diferentes espécies^5,7,8. Nosso protocolo descreve uma técnica para o isolamento da neuroretina do camundongo juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE). Esta técnica também será adequada para culturas de retina de ratos⁹. A cultura da neuroretina junto com seu RPE é de grande importância para o sucesso. O RPE realiza funções essenciais para a retina: transporte de nutrientes, íons, água, absorção de luz e proteção contra fotooxidação, re-isomerização de toda trans-retinal em 11-cis-retinal, que é crucial para o ciclo visual, fagocitose de membranas fotorreceptoras de galpão, e secreção de fatores essenciais para a integridade estrutural da retina¹⁰. A manutenção do RPE permite um desenvolvimento bem-sucedido de segmentos externos e internos fotorreceptor, mantendo a retina viável por mais tempo¹¹. O procedimento descrito abaixo preserva as características histópicas e fisiológicas da retina por pelo menos duas semanas¹². Além disso, a cultura das explanações de retina organotípicas em meio livre de soro e sem antibióticos evita a presença de substâncias desconhecidas e permite uma interpretação direta dos resultados¹².

As culturas organotípicas de explantamento da retina têm sido essenciais para melhorar nosso conhecimento sobre desenvolvimento da retina e degeneração^7,13,14. Mostramos aqui que eles também são uma ferramenta útil para a triagem farmacológica e que eles podem ser empregados para modelar uma variedade de doenças da retina, incluindo a retinopatia diabética.

Protocolo

Os protocolos animais em conformidade com o §4º da lei alemã de proteção animal foram revisados e aprovados pelo Comitê de Proteção Animal da Universidade de Tübingen (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registro Nº. AK02/19M). Neste estudo, as retinas foram obtidas a partir de camundongos do tipo selvagem (WT) e rd1, sendo este último um modelo bem caracterizado para degeneração da retina hereditária¹⁵. Os camundongos estavam alojados sob iluminação cíclica branca padrão, tinham livre acesso a alimentos e água, e eram usados independentemente do sexo.

1. Lista de verificação

1. Para garantir condições estéreis e evitar contaminações, limpe e desinfete a capa de fluxo de ar laminar com 70% de etanol. Certifique-se de deixar o etanol evaporar completamente, para evitar a intoxicação das culturas da retina.
2. Ferramentas de autoclave (por exemplo, tesoura, fórceps e colher de raspagem de microscópio oftálmico) antes de usar.
3. Prepare as seguintes mídias com antecedência sob uma coifa de fluxo laminar, sob condições estéreis: meio Basal R16 (BM) (pode ser armazenado a 4 °C por 4 semanas), BM com soro de bezerro fetal de 20% (FCS) (uso do mesmo dia), BM com 4 °C 0,12% proteinase K (44 mAnson U/mg) solução (uso do mesmo dia) e meio R16 completo com suplementos (CM) como descrito por Romijn¹⁶ (pode ser armazenado a 4 °C por 3 semanas) (ver Tabelas S1, S2 e S3).
4. Pré-aqueça a solução proteinase K a 37 °C para ativá-la e usá-la na etapa 2.5.

2. Preparação

1. Sacrifício do animal rd1/WT no dia pós-natal (P) 5 por decapitação. Para animais com idade inferior a P11, utilize CO₂ e/ou luxação cervical, de acordo com as normas locais de proteção animal.
2. Dependendo da idade do animal, antes da enucleação, se necessário, abra as pálpebras dos olhos usando fórceps e separe cuidadosamente as pálpebras, sem tocar ou coçar o olho abaixo.
3. Enuclear rapidamente os olhos sob um estereóscópio usando fórceps curvas.
4. Incubar os olhos em BM por 5 min a temperatura ambiente (RT).
5. Incubar os olhos em BM pré-aquecido, com 0,12% de proteinase K a 37 °C por 15 min.
6. Realize as seguintes etapas dentro de uma coifa de fluxo de ar laminar para garantir condições estéreis. Para inativar proteinase K, transfira os olhos para BM contendo 20% de FCS e incubar por 5 min na RT.
7. Disseca os olhos sob um estereóscópio, asepticamente, em uma placa de Petri contendo BM fresco na RT. Inicie a dissecção o mais rápido possível após a enucleação. Quanto mais tempo este tempo é, mais difícil é dissecar a retina, os olhos ficando muito macios.
   1. Com fórceps, segure o olho do nervo óptico. Usando uma tesoura fina, faça uma pequena incisão na córnea criando 2 bordas de onde a córnea, o coroide e a esclera podem ser delicadamente descascados usando 2 pares de fórceps finos(Figura 1 passos A-C). Alternativamente, use uma cânula de bitola estreita para fazer uma primeira incisão na córnea e, em seguida, inserir uma das lâminas da tesoura na abertura.
   2. Segure a lente com fórceps finos. Coloque um segundo par de fórceps perpendicularmente para os primeiros para que os primeiros fórceps estejam entre as 2 hastes do segundo. Puxe para extrair a lente do copo dos olhos. Se o vítreo e o corpo ciliar ainda estiverem presos à retina, remova-os cuidadosamente(Figura 1 passo D).
      NOTA: As etapas 2.7.1 e 2.7.2 precisam de prática e garantir cautela para não danificar a retina.
   3. Corte a retina perpendicular às suas bordas em quatro pontos, criando uma forma de trevo de quatro folhas(Figura 1 passos E-F).
   4. Usando uma pipeta com base amplamente cortada de uma ponta de 1 mL, segure a retina em uma gota de meio e transfira-a para uma inserção de filtro de prato de cultura colocada em uma placa de cultura de 6 poços. A camada RPE deve enfrentar a membrana (Figura 1 passo G).
   5. Com uma pipeta, remova cuidadosamente o excesso de meio da inserção.
   6. Dos lados do poço, adicione 1 mL de CM por poço e incuba em uma incubadora estéril a 37 °C com 5% de CO₂. Não submergir a retina no meio, pois isso reduzirá a oxigenação e causará degeneração tecidual. A explanta deve permanecer na interface entre líquido e ar, coberta apenas por uma fina película de líquido criada pela tensão superficial da água.
8. Deixe a explantização da retina intacta durante as primeiras 48 horas para facilitar a recuperação após o procedimento de explantação.
9. Mude o meio a cada dois dias (48 h). Descarte 700 μL de meio de cada poço e adicione 900 μL de CM fresco ao poço. Dessa forma, a quantidade de médio perdido pela evaporação é recuperada e a explanta da retina mantém alguns dos fatores neuroprotetores produzidos nas 48 h anteriores.
10. Incubar o meio removido em um tubo de microcentrifuge separado e fechado, juntamente com as culturas para controlar e avaliar possíveis contaminações (ou seja, mudança de cor do meio).
    NOTA: As explantas de retina podem ser mantidas na cultura por pelo menos 2 semanas¹².

3. Após a colheita

NOTA: Explantas podem ser usadas para diferentes aplicações experimentais (mancha ocidental, histologia, montagens inteiras, análise genética, eletrofisiologia). Dependendo da aplicação, as explanações organotípicas da retina podem ser congeladas, diluidas ou preparadas para a crioseção. Os passos abaixo descrevem a preparação histológica.

1. Realize uma fixação de 45 min com 4% de paraformaldeído (PFA), seguido de crioproteção gradual de sacarose (10% de sacarose por 10 min, 20% para 20 min e 30% para 2h em temperatura ambiente (RT) ou durante a noite (ON) a 4 °C). Adicione esses buffers diretamente no poço.
2. Corte a membrana ao redor das explantas da retina.
3. Incorpore a membrana e o tecido da retina no meio para tecido congelado.

Figura 1: Procedimento passo a passo para a preparação de culturas organotípicas de explant retina. (A) Os olhos do rato são enucleados e transferidos para uma solução de proteinase K para permitir a separação de esclera e coroide da retina e RPE. Um pequeno corte na camada esclera/coroide é introduzido. (B) Dois fórceps são usados para descascar a camada esclera/coroide. (C) A camada coroide preta pode ser vista durante o peeling. O epitélio de pigmento de retina escura sublinhado (RPE) permanece preso ao globo ocular. A esclera e o coroide são removidos junto com o nervo óptico. (D) A lente e o vítreo são extraídos com fórceps.  O corpo ciliar restante é removido. (E) A retina mantém uma forma semelhante a uma tigela. (F) Para achatar a retina para a colheita em um prato, 4 cortes em igual distância ao redor da retina são feitos com uma tesoura, dando-lhe uma forma de trevo. A cultura da retina é transferida para uma inserção de cultura de membrana em uma placa de 6 poços com o uso de uma ponta de pipeta de 1 mL cortada. A retina ainda retém um pouco da forma da tigela. No entanto, após a remoção do excesso de líquido ao redor da retina, ele se desdobrará para uma estrutura planar. (G) Na configuração da membrana de cultura, a cultura da retina está repousando sobre uma membrana porosa de policarbonato (PC) em cima de uma solução de meio R16 completo. Para garantir a viabilidade, a cultura deve ser mantida em uma incubadora estéril umidificada a 37 °C com 5% de CO₂, e o meio deve ser substituído a cada 48 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura

Resultados

Após seguir o protocolo, explanações de retina dissecadas e cultivadas preservam sua arquitetura de tecido normal, com camadas distintas, do RPE à camada de células gânglios (GCL), como mostra a Figura 2. A camada nuclear externa (ONL) e o tamanho da camada nuclear interna (INL) permaneceram principalmente estáveis por 2-3 semanas, com uma perda celular em progresso lento e a redução gradual dessas camadas se tornando cada vez mais aparente se o período de cultivo for prolongado para 4 semanas e além. Na GCL, em contraste, por causa da axotomia do nervo óptico, um afinamento acentuado é geralmente observado nos primeiros 4 dias de cultivo. Posteriormente, a população de células remanescentes no GCL (células amacrinas deslocadas) continuará a ser viável por mais 3-4 semanas^17,18,19.

Figura 2: Tipos celulares encontrados na cultura da explant da retina. A cultura de explantamento de retina em P11 derivada de animais mutantes rd1 (A) e WT(B) mostrando coloração nuclear com DAPI (esquerda, azul), fotorreceptores de vara (centro, vermelho) e células Müller (direita, verde). A coloração nuclear destaca todas as principais camadas celulares da retina, tais como, epitélio de pigmento da retina (RPE), camada nuclear externa (ONL), camada nuclear interna (INL) e camada celular de gânglio (GCL). Tipos de células específicas nas camadas nucleares, como varas e células Müller, são imunolabeled com prisão alfa em²⁶ e sitese glutamina²⁷ anticorpos, respectivamente. (C) Mostra a seção de comprimento total de uma retina inteira do rato   RD1, com a coloração DAPI destacando a consistência, integração e desenvolvimento da retina. Essas retinas foram cultivadas por 6 dias. Descrição do procedimento: Retina e RPE derivados de animais rd1 ou WT foram isolados em P5 e cultivados como descrito no protocolo, até P11 com uma alteração média a cada 48 h. As culturas foram fixadas com 4% de PFA na P11 e criosectionadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura

O meio sem soro e o ambiente in vitro sustentado permitem ter controle total sobre as condições experimentais. Aqui, fornecemos dois exemplos para aplicações específicas deste protocolo.
O primeiro exemplo ilustra a possibilidade de usar explanações de retina para testes ou rastreamento de drogas. As culturas organotípicas de explant de retina foram preparadas a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem (WT) e rd1. Este último é um modelo bem caracterizado para degeneração da retina¹⁵. Na retina do rato rd1, a degeneração ONL é desencadeada por níveis anormalmente altos de cGMP em fotorreceptores de vara^6,20. O CGMP excessivo causa aumento da atividade dos canais de íons fechados nucleotídeos cíclicos (CNGCs) e da quinase proteica dependente de CGMP (PKG), levando à morte celular²¹. O tratamento de retinas de camundongos rd1 com um análogo estrutural ao cGMP (nucleotídeo cíclico #3; CN003), que tem como alvo pkg e CNGC, foi testado. Após a explantação em P5, seguiu-se o paradigma de tratamento descrito na Figura 3A. As culturas explant foram fixadas com 4% de PFA na P11 e preparadas para o criosectioning(Figura 3A). Para avaliar a morte celular de seções histológicas de amostras tratadas, não tratadas (NT) e WT,^foi realizado um ensaio terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). A análise das células rotuladas tunel mostrou uma alta porcentagem de células moribundas no ONL dos espécimes não tratados rd1, enquanto o CN003 protegeu os fotorreceptores do rato rd1 quando aplicados a uma concentração de 50 μM²³ (Figura 3B).

Uma complicação frequente do diabetes é a retinopatia diabética, uma doença cegante que é difícil de reproduzir fielmente nos modelos animais⁵. O segundo exemplo destaca o uso de culturas organotípicas de explant retina para caracterizar a viabilidade celular da retina em condições que emulam diabetes mellitus tipo 2 (T2DM)²⁴. Aqui, usamos 20 mM do inibidor de glicolise 2-desoxy-glicose (2-DG)²⁵ e administrámo-lo ao meio de cultura por 24 horas de P10 a P11. Mostramos que submeter explanações de retina WT a tais condições diabéticas simuladas in vitro leva à morte celular neuronal extensiva da retina(Figura 3C). Esse paradigma, por sua vez, pode ser utilizado, por exemplo, para estudar mecanismos degenerativos ou testar tratamentos retinoprotetores em um contexto de diabetes.

Figura 3: Dois exemplos para aplicações de culturas organotípicas de explantamento de retina. (A) Descrição do procedimento: Retina e RPE derivados de animais rd1 ou WT foram isolados no dia pós-natal (P) 5 e cultivados como descrito acima, com uma mudança média a cada 48 h. Em P7 e P9, o meio gasto foi descartado e o cm fresco contendo composto ativo em uma concentração de 50 μM foi adicionado à placa. As culturas foram fixadas com 4% de PFA na P11 e criosectionadas. (B) Teste composto na retina rd1. As seções foram obtidas a partir de culturas de TR, tratadas (003) e não tratadas (NT) de explantagem organotípica da retina. O ensaio TUNEL (vermelho) foi usado como marcador para morte celular. Coloração nuclear com DAPI (azul). A quantificação mostrada no gráfico da barra ilustra as percentagens das células moribundas em WT, rd1 NT e rd1 003 condição. Tratamento com composto 003 reduziu significativamente a morte celular do fotorreceptor rd1. (C) Simulação do diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) na retina WT utilizando tratamento 2-deoxy-glicose (2-DG). O ensaio TUNEL foi realizado em amostras NT e T2DM. A quantificação indica um aumento altamente significativo na morte celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura

Tabela S1. Clique aqui para baixar a tabela  

Mesa S2. Clique aqui para baixar a tabela  

Mesa S3. Clique aqui para baixar a tabela  

Discussão

O protocolo apresentado descreve culturas organotípicas de explantagem organotípica de retina de camundongos com RPE intacto em meio R16 definido, livre de soro e antibióticos. Este protocolo foi originalmente desenvolvido a partir do final da década de 1980^7,28 e desde então tem sido continuamente refinado^6,11,12. Aplicações notáveis incluem estudos sobre os mecanismos de degeneração da retina hereditária e a identificação de medicamentos retinoprotetores^23,29,30.

Para um experimento bem-sucedido, algumas considerações importantes precisam ser levadas em conta. Aqui estão alguns pontos importantes de solução de problemas para ajudar a melhorar a qualidade das culturas. Em primeiro lugar, as culturas da retina podem apresentar dobramento excessivo e/ou formação de roseta³¹. Isso pode ser causado por tocar a retina com um fórceps durante o procedimento de explantação. Além disso, o corpo ciliar deve ser completamente removido da explanta, pois isso pode aumentar a dobra da retina durante a cultura. Em segundo lugar, durante a transferência da retina para a placa do poço em uma gota pendurada, se a retina enfrentar a membrana do lado errado para baixo, mantenha-a na gota pendurada na ponta da pipeta e empurre suavemente o meio para dentro e para fora da ponta (sem desprender a gota de suspensão) para virar a retina ao redor. Finalmente, se o RPE permanecer ligado à esclera e se desprender da retina, é provavelmente causado por uma predigesção insuficiente da esclera. Esse problema pode ser especialmente importante quando se trabalha com olhos de animais mais velhos ou espécies não-roedores (por exemplo, porcos) e pode ser resolvido aumentando a concentração de proteínas.

A realização de culturas organotípicas de explant retina é um procedimento complexo que requer treinamento e experiência adequados. A falta de treinamento pode levar à variabilidade na qualidade das explantas da retina. Por essas razões, é importante monitorar e verificar a viabilidade e a reprodutibilidade, caracterizando, por exemplo, a taxa de morte celular com o ensaio TUNEL. O uso de um meio livre de antibióticos torna as explantas da retina vulneráveis à contaminação por bactérias e fungos. Para minimizar esse risco, recomendamos que se seja tomado um cuidado especial para trabalhar em condições verdadeiramente assépticas. Outra limitação da cultura in vitro da retina são as diferenças no ambiente fisioquímico quando comparadas com a retina in vivo (por exemplo, fonte sanguínea choroidal e retina, níveis de oxigênio e glicose, pressão intraocular, composição do vítreo). Um sistema contínuo de perfusão, talvez incorporado em um bioreator^{dedicado 32} poderia tornar este modelo mais próximo da condição in vivo. Além disso, a axotomia do nervo óptico durante a dissecção da retina levará à morte celular de gânglio, que pode induzir respostas ao estresse⁸. Portanto, é recomendável que a explanta seja deixada para se adaptar às condições de cultivo por pelo menos 2 dias in vitro antes de ser submetida a uma manipulação ou tratamento específico.

O método descrito é geralmente realizado em tecidos imaturos da retina, que podem sobreviver bem por 4 semanas in vitro^7,33. No entanto, o procedimento é adaptado para uma variedade de aplicações, incluindo a cultura de retina adulta. Embora diferentes abordagens publicadas descrevam o isolamento da retina adulta sem seu RPE^34,35, a incubação com solução de papain por até 1 h a 37 °C antes da dissecção permite que o RPE fique preso à retina mesmo quando derivado de um rato adulto³⁶.

O meio sem soro e o ambiente in vitro quimicamente definido proporcionam uma manipulação totalmente definida e reprodutível das condições experimentais. Portanto, as culturas organotípicas de explantização da retina são ferramentas valiosas no campo da oftalmologia e neurociência, e têm sido utilizadas para estudar doenças da retina^37,desenvolvimento da retina^38,39,terapia de células-tronco da retina^40,modificações genéticas⁴¹e triagem farmacológica. Como exemplo específico de teste de drogas, aqui usamos culturas de explant da retina para testar um análogo cGMP (CN003), conhecido por reduzir a morte celular fotorreceptora em modelos animais para doença de retina hereditária²³ (Figura 3B). Outra possível aplicação da técnica é descrita na Figura 3C,que ilustra como o controle preciso do ambiente tecidual pode ser explorado para emular condições diabéticas²⁴. Devido à preservação da arquitetura tecidual durante todo o período de cultivo, as culturas organotípicas de explant da retina também são adequadas para estudos eletrofisiológicos. A funcionalidade neuronal em explantas de retina tem sido investigada usando a gravação de patch-clamp⁴² e multi-eletrodo-array (MEA) gravando^33,43. Este último permite o registro da atividade elétrica das populações neuronais ao mesmo tempo e tem sido explorado para caracterizar a funcionalidade de células fotorreceptoras e gânglios em condições culturais. Em uma perspectiva mais ampla, os sistemas organotípicos de cultura explant também podem ser aplicados em pesquisas pré-clínicas, onde culturas de explant foram utilizadas para testar a eficácia terapêutica da hipotermia⁴⁴.

A técnica de cultivo de plantas organotípicas é relativamente simples de realizar e, quando comparada aos experimentos in vivo correspondentes, é menos cara e demorada, e evita as preocupações éticas relacionadas aos estudos em animais vivos. O controle preciso sobre as condições experimentais e a preservação da RPE e da complexidade tecidual fazem do método uma ferramenta valiosa para melhorar nosso conhecimento sobre fisiologia da retina e fisiopatologia e possibilitar inúmeras aplicações experimentais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotin	Sigma	B4639
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid)	Sigma	T1395
BSA	Sigma	B4639
CDP-Choline-Na	Sigma	30290
Corticosterone	Sigma	C2505
CuSO4 × 5H2O	Sigma	C8027
DL-Tocopherol	Sigma	T1539
Ethanolamine	Sigma	E0135
FCS	Sigma	F7524
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm	SARSTEDT	83.3942.101	for Basal Medium
Forceps	F.S.T	15003-08
Glutamine	Sigma	G8540
Glutathione	Sigma	G6013
Insulin	Sigma	I6634
L-CysteineHCl	Sigma	C7477
Linoleic Acid	Sigma	L1012
Linolenic Acid	Sigma	L2376
MnCl2 x 4H2O	Sigma	M5005
Na-pyruvate	Sigma	P3662
NaSeO3 x 5H2O	Sigma	S5261
Ophthalmic microscope scaping spoon	F.S.T.	10360-13
Progesteron	Sigma	P8783
Proteinase K	MP Biomedicals	21935025	44 mAnson U/mg
R16	Gibco	07491252A
Retinol	Sigma	R7632
Retinyl acetate	Sigma	R7882
Scissors	F.S.T	15004-08
Sterile filter 0.22µm	MILLEX GP	SLGP033RS	for supplements
T3	Sigma	T6397
Tocopherylacetate	Sigma	T1157
Transferrin	Sigma	T1283
Transwell permeable supports	Corning	3412
Vitamin B1	Sigma	T1270
Vitamin B12	Sigma	V6629
Vitamin C	Sigma	A4034