מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Summary

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

Abstract

טכניקות מיקרו-אלקטרוקטרודה תאיות קונבנציונליות לכימות אלקטרופיזיולוגיה של קרדיומיוצית הן מורכבות ביותר, עתירות עבודה, ובדרך כלל מבוצעות בתפוקה נמוכה. התרחבות מהירה ומתמשכת של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC) מציגה סטנדרט חדש במחקר לב וכלי דם ושיטות חלופיות נחוצות כעת כדי להגדיל את התפוקה של נתונים אלקטרופיזיולוגיים ברמת תא אחד. VF2.1Cl הוא צבע רגיש למתח שנגזר לאחרונה המספק ערוץ יחיד מהיר, תגובה בעוצמה גבוהה לתנודות בפוטנציאל הממברנה. יש לו קינטיקה עדיפה על אלה של מחווני מתח קיימים אחרים ועושה נתונים פונקציונליים זמינים שוות ערך לזה של טכניקות מיקרו-ectrode מסורתיות. כאן, אנו מדגימים אפיון פוטנציאלי פעולה פשוטה ולא פולשנית ב cardiomyocytes אנושיים בקצב חיצוני באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית ובמחיר סביר מאוד.

Introduction

מידול אלקטרופיזיולוגי של קרדיומיוציטים ובניית פלטפורמות יעילות להקרנת תרופות לב חיוניות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למגוון הפרעות קצב. התרחבות מהירה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה (iPSC) יצרה חדירה מבטיחה למידול מחלות אנושיות ולחקירה פרמקולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בחולה מבודד (iPSC-CM). טכניקות "תקן זהב" לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תאים אלה באמצעות מהדק תיקון (מהדק זרם) יכולות לכמת את פוטנציאל הפעולה (AP) מורפולוגיה ומשך זמן, עם זאת, שיטה זו מורכבת ואיטית להפליא, ואינה מתאימה לרכישת נתוני תפוקה גבוהה¹. iPSC-CMs מדווחים באופן קבוע יש פוטנציאל ממברנה דיאסטולית מוגברת וזרם דליפה מוגבר בהשוואה לקרדיומיוציטים ילידים למבוגרים². הוא הציע כי גודל תא קטן יותר קיבוליות ממברנה מופחתת שנצפו iPSC-CMs עלול לייצר כמה שגיאה שיטתית בעת שימוש בטכניקת מלחציים הנוכחי, אולי להסביר את הסטיות האלה³. על מנת למקסם את התועלת של פלטפורמת iPSC-CM, שיטה נוספת היא בעלת ערך כדי להגדיל את התפוקה ולהבטיח דיוק נתונים בעת אפיון שינויי מתח transmembrane ברמת תא יחיד ב- iPSC-CMs.

צבעים רגישים למתח (VSD) כבר זמן רב שיטה מוצעת כדי לספק ניתוח מהיר יותר, לא פולשני שווה ערך של קינטיקה AP לב בהשוואה לאלה של טכניקות מסורתיות⁴. מחקר שנערך לאחרונה הדגים את ההתאמה של פוטומטריה רגישה למתח רציטרי כדי לכמת במדויק את AP הלב⁵. יתר על כן, היכולת להגדיל בקלות את הגישות פוטומטריה אופטית מעניק טכניקה זו בקנה מידה גדול מסכי cardiotoxicity קריטי בפיתוח תרופות טיפוליות (למשל, CiPA). פיתוח פרוטוקולי cardiotoxicity מתוקננים במחקר מרובה אתרים עיוור באמצעות מערך microelectrode וטכניקות אופטיות חישת מתח הדגים את הערך העיקרי של גישה זו⁶.

צבעים פוטנציומטריים רבים זמינים מסחרית, ופיתוח סינתטי מתמשך של בדיקות חדשות מראה פוטנציאל מרגש לייעול האפקטיביות שלהם על פני מגוון מבנים לב ועצביים. VSD האידיאלי יהיה קינטיקה מוגברת ורגישות, תוך הצגת עומס קיבולי מופחת, ליטוף פוטו וציטוטוקסיות. VF2.1Cl מסונתז לאחרונה (FluoVolt) מבטא רבים של תכונות מועילות אלה בעיקר בשל המבנה המולקולרי מבוסס חוט החדש שלה, משותף על ידי חברים אחרים של מתח Fluor החדש (VF) משפחה⁷. בניגוד VSDs אלקטרוכרומי נפוץ שבו בדיקות פשוטות מצומדות מולקולרית וחשמלית לקרום הפלזמה, צבע זה מורכב חוט סינתטי מוחדר באופן פסיבי, המשתרע על פני ממברנה אשר משייך תורם עשיר באלקטרונים עם פלואורופור פלואורסין שונה (FITC). פרטים מכניים מסופקים באיור 1. צבע זה מדגים רגישות מעולה לתנודות מתח הממברנה, ומציג שינוי של 27% בעוצמת הפליטה לכל 100 mV לעומת ~ 10% שנראה בבדיקות נפוצות אחרות במהירויות^{דומות 7}. בנוסף, מערכות PeT מבוססות חוט אינן מתקשרות ישירות עם השדה החשמלי הסלולרי המייצר הפרעות חשמליות מינימליות ושינויים זניחים בעומס הקיבולי התאי.

איור 1: פרמטרים כימיים, ספקטרליים ומכניסטיים של צבע VF2.1Cl. (A)מבנה כימי של תכונות מולקולריות VF2.1Cl. לציין כוללים קבוצות אלקיל מרובות בתוך חוט מולקולרי פנילן וינילן אשר להקל על החדרה לתוך קרום הפלזמה. קבוצת חומצה גופרתית טעונה שלילית הצומדת בגשושית FITC מבטיחה ייצוב פלואורופור על פני השטח החוץ-תאיים ומסייעת ליד החדרה מאונכת ביחס לשדה החשמלי של דו-שכבתי השומנים. (B)סכמטי פשוט של VF2.1Cl מאונך מוטבע לתוך קרום הפלזמה של תא יעד. (C)ספקטרום ספיגה ופליטה של צבע VF2.1Cl. ספקטרה זהה לזו של בדיקות FITC ו- GFP סטנדרטיות. (ד)תיאור של מצב הפעולה המכניסטי של VF2.1Cl. בתנאי מנוחה (היפרפולרי), מתחים תאיים שליליים מניעים אלקטרונים חופשיים לכיוון הפלואורופור של הרוסטרל. שפע אלקטרונים מבטיח העברת אלקטרונים המושרה על ידי תמונה (PeT) מועדף כמסלול מחוץ למצב הנרגש לאחר העירור האופטי, למעשה מרווה פלואורסצנטיות. לעומת זאת, פוטנציאל ממברנה דה קוטבי משפיע על תנועת אלקטרונים כלפי מטה ומעדיף פלואורסצנטיות על עירור אופטי. התגובה הפלואורסצנטית המתקבלת קשורה באופן ליניארי למתח הממברנה וניתן להשתמש בה במדויק כדי לאסוף מידע זמני מפורט על קינטיקה אלקטרופיזיולוגית תאית. (E)נציג brightfield (עליון) ופלואורסצנטיות ב 470 ננומטר (נמוך יותר) תמונות של קרדיומיוציטים לפולין טעון עם VF2.1Cl. (F)Z מחסנית Z של קרדיומיוציטים טעון יחיד. החצים מציינים אזורים של לוקליזציה ברורה של VF2.1Cl לממברנה התאית. תמונות נרכשו עם מערכת קונפוקלית דיסק מסתובב המורכבת ראש קונפוקלי דיסק מסתובב X-lightv3 עם תבנית חור סיכה 50 מיקרומטר; תאורת LDI-7; מצלמת Prime95B ומטרת PlanApo Lambda 100x. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הבדיקה FITC הצומדת ל- VF2.1Cl מבטיחה שניתן יהיה להשתמש בה ביעילות בתצורות מסנן רגילות ו- GFP, והיא דורשת רק מערכת רכישה של ערוץ אחד, שתיהן תכונות נפוצות של פלטפורמות הדמיה פלואורסצנטיות. ניתוח של מונוליות IPSC-CM אנושי צפוף עם צבע זה דווח לאחרונה^8,9,10,11. הפרוטוקול שלנו שונה ממחקרים אלה עקב החקירה שלנו של iPSC-CMs יחידים, מבודדים, ללא הפרעה על ידי ההשפעות החשמליות והפרקרינית של monolayers סינכרוני צפוף, והשימוש שלנו במערכת פוטומטריה במחיר סביר וניתן להתאמה אישית בניגוד לסידורי הדמיה קונפוקליים או רחבים מורכבים.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לרכישה וניתוח מהירים של APs אופטי חזק מקרדיומיוציטים אנושיים מבודדים וקרדיומיוציטים מקומיים (ראה קובץ משלים). אנו משתמשים VF2.1Cl בשילוב עם המדינה הניתנת להתאמה אישית של פלטפורמת האמנות למדידות פוטומטריה של תא יחיד. פרוטוקולים ניסיוניים אלה אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי האוניברסיטאי גטינגן (מס '10/9/15).

Protocol

1. הכנות סלולריות

הערה: IPSCs אנושיים המשמשים בפרוטוקול זה נגזרו מתורמים בריאים והובדלו בשכבות מונו-שכבתיות באמצעות אפנון מולקולות קטנות מוגדרות לחלוטין של טכניקות איתות וטיהור לקטט כפי שתואר בעבר^12,13,14. iPSC-CMs נשמרו כל 2-3 ימים עם מדיום תרבות המתואר להלן.

1. הכן מדיום תרבותי של בינוני בזאלי (RPMI 1640) ותוספת של 2% (B27). יש לאחסן ב-4 °C (75°F). יש להשתמש בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכן מדיום ציפוי של בינוני בזאלי (RPMI 1640), תוספת של 2% (B27) ומעכב רוק 1:2000. יש לאחסן ב-4 °C (75°F). השתמש ב- RT.
3. מעיל מעוקר 10 מ"מ זכוכית עגולה #0 מכסה עם 150 μL של 1:60 גורם ללא פקטור מטריצת קרום מרתף חינם ודגרה ב 4 °C (4 °F) עבור 4 שעות.
   הערה: אופטימיזציה של נפח כיסוי יש צורך להבטיח את הזכוכית כולה מכוסה תוך שמירה על מתח משטח נאות כדי למנוע שפיכה. 150 μL מומלץ עבור כיסויים עגולים 10 מ"מ. גודל אצווה, סוג כיסוי, כיסוי נפח וסוג צלחת תרבות יכול להתאים לצרכים של הנסיינים.
4. התחל ניתוק iPSC-CM עם ריאגנט דיסוציאציה של תאים מבוססי EDTA. ודא כי monolayer מנותק לחלוטין על ידי שטיפה בעדינות עם פיפטה 1,000 μL.
5. מעבירים את המתלים הסלולריים לצינור 15 מ"ל ומוסיפים ציפוי כפול. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-100 x גרם.
6. resuspend הכדור עם נפח הרצוי (נפח resuspension) של מדיום ציפוי. ספירת תאים באופן ידני או אלקטרוני.
7. בחר צפיפות אופטימלית לכל כיסוי (15,000) אשר יאפשר ניתוח תאי מבודד מאוחר יותר.
8. חשב את הנפח של מתלה סלולרי 'פעיל' (A) הדרוש כדי צלחת כל כיסויים בצפיפות הרצויה. החל את הנוסחה הבאה ונסוג לתוך צינור נפרד:
   
9. חשב את עוצמת הנפח של מדיום ציפוי נוסף (B) הדרוש כדי להתאים לכל כיסוי בנפח הרצוי. החל את הנוסחה הבאה והוסף את הנפח המתקבל לצינור של השעיה פעילה:
   
10. הסר את המטריצה מכיסויים והחל את 'עוצמת הכיסוי' של השעיית התא (A+B) על כל כיסוי. באופן קבוע resuspend בצינור כדי להבטיח אפילו הפצה סלולרית.
11. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 1 שעות. ממלאים בעדינות את הבאר בחישוב בינוני.
12. לאחר 24 שעות, להחליף מדיה עם בינוני תרבות נורמלית ולשמור כל 2-3 ימים.

2. התקנה ניסיונית

1. צייד מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות הפוך בהגדלה של פי 40, עדשת צמצם מספרי גבוה (N.A: > 0.75) כדי לערוך ניסויים.
2. זוג נורית LED לבנה חמה במהירות ליציאת התאורה המשודרת של המיקרוסקופ. הכנס מסנן אדום פשוט של 660 ננומטר לנתיב האור ששודר.
   הערה: אור זה יכול להיות מופעל לאורך ניסויי פוטומטריה כדי לצפות במדגם מבלי לזהם את האות הפלואורסצנטי הירוק.
3. הר ראש LED מיתוג מהיר 470 ננומטר להקלטת פוטומטריה. הכנס מסנן עירור 470/40 ביציאת האפיפלואורסצנטית של המיקרוסקופ כדי לנקות את האור שנוצר על-ידי נורית ה- LED.
   הערה: לכימות אותות אופטימלי מומלץ מערכת תאורה עם בקרת משוב במהירות גבוהה של פלט אופטי.
4. הכנס קוביית מיקרוסקופ המכילה מפצל קרן מעבר באורך 495 ננומטר בקרוסלת יחידת המראה בתוך המיקרוסקופ.
5. התאם זרוע זיהוי המכילה דיאפרגמת שדה מתכווננת ליציאת המיקרוסקופ C-הרכבה כדי לאפשר בחירת אזור עניין.
6. בנפרד זוג גלאי photomultiplier (PMT) ומצלמת USB למיקרוסקופ. זה יהווה את הבסיס של מערכת זיהוי הפליטה.
7. הכנס קוביית מסנן המכילה מפצל קרן מעבר ארוך של 565 ננומטר ומסנן פליטה של 535/50 ליציאת PMT. זה מפצל את אור הפליטה בין שני הגלאים.
   הערה: מצלמה המחוברת ליציאה המשודרת של מערכת זיהוי הפליטות יכולה לזהות אור משודר מתחת לברייטפילד לאורך כל הניסויים.
8. צמד את PMT לאספקת חשמל ומגבר PMT. חבר את פלט מגבר PMT לפין קלט אנלוגי של מערכת רכישת נתונים.
9. סנן נתונים אנלוגיים מה- PMT במהירות של 1 קילו-הרץ ומעלה.
10. דיגיטציה של נתונים בתדר שהוא לפחות כפול מזה של התדירות הגבוהה ביותר הקיימת באות אנלוגי (2 kHz ומעלה) כדי למלא קריטריוני Nyquist ולמנוע כינוי.

3. טעינה סלולרית עם VF2.1Cl

הערה: כל השלבים הכרוכים בצבע זה חייבים להתבצע בתנאי תאורה חלשה.

1. הכן את פתרון האמבטיה של טיירוד (ב- mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז, 4 KCl, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, pH = 7.35 וחם עד 37 °C (7°F).
2. הכן aliquot של פתרון טעינה בצינור microcentrifuge על ידי ערבוב 5 μL של 1,000x VF2.1Cl ו 50 μL של 20% פתרון פולוקסמר solubilizing.
3. יש למרוח 5 מיקרו-אל של תמיסת הטעינה על 5 מ"ל של הפתרון של טיירוד מחומם (ריכוז צבע 0.1x) בצלחת פטרי 20 מ"מ.
   הערה: ריכוז הצבע הסופי הוא פי 0.1. זה 1/10^th שהוצע על ידי היצרן. זה חוסך במשאבים, מבטיח ציטוקסיות זניחה, וחשוב מכך, עדיין שומר אותות אופטיים ברורים מתאים טעונים עם יחסי אות לרעש גבוהים.
4. מוסיפים לצלחת פתק כיסוי IPSC-CM יחיד ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. להרכיב תא הדמיה תא חי מחומם. לעלות על במת המיקרוסקופ ולמלא עם 500 μL של הפתרון של טיירוד טרי.
6. לשטוף את כיסוי עם פתרון טרי של טיירוד ב 37 °C (50 °F).
7. יש למרוח בזהירות את כיסוי ה-iPSC-CM על תא האמבטיה שהתחמם מראש באמצעות מלקחיים עדינים.
   הערה: ודאו שהתא ותכולתו תמיד מחוממים בטמפרטורות פיזיולוגיות. אם תרצה, התחילו עם זלוף מתמשך של הפתרון של טיירוד מחומם.

4. גירוי שדה חשמלי

הערה: הפעלה חיצונית של iPSC-CM היא אופציונלית אך שימושית לתקנון של דינמיקה תאית ופרמטרים ניסיוניים. זה מגביר את קלות הניתוח ומאפשר חקירה של השפעות תלויות תדירות.

1. חברו תוספת גירוי עם שתי אלקטרודות פלטינה מרווחות זו מזו ב-5 מ"מ לתא ההקלטה.
2. חבר ממריץ חיצוני לתוספת הגירוי. מוגדר לפולסים דו קוטביים של 5 ms ב 0.5 הרץ.
3. לקבוע מתח גירוי אופטימלי על ידי הגדלת הגירוי מ 1 V ומעלה. גירוי סף מוגדר כמתח הנמוך ביותר שבו תאים מתחילים להתכווץ. החל מתחים בערך 25% מעל סף זה. הטווח הנורמלי הוא בין 1 V ו 30 V.
4. תקן תדירות גירוי עם הממריץ החיצוני או הפעל אותו באמצעות תוכנת רכישה.

5. רכישה פוטנציאלית של פעולה אופטית

הערה: פרוטוקול זה משתמש בתוכנה מסחרית לרכישה וניתוח.

1. דמיינו את המיאוציטים בתצוגת Brightfield באמצעות נתיב האור המשודר ומצלמת ה- USB.
2. בחר תא מבודד וחתוך בחוזקה את הנתיב האופטי שלו עם הסרעפת של השדה המבטיחה שרק אור מתא העניין מנוטר.
3. הפעל את מגבר PMT והגדר את אספקת PMT ל- 750 V.
4. הפעל את פרוטוקול הגירוי (ראה שלב 4) יחד עם תוכנת הרכישה ובו זמנית הפעל את נורית העירור של 470 ננומטר. זה האחרון יכול להיעשות באמצעות לוח מרוחק או אוטומטי בעוצמה קבועה (אות TTL).
5. התאם רווח והיסט של מגבר PMT כדי לוודא שהאות אינו רווי וממוטב לטווח הזיהוי של מערכת ההקלטה.
6. הקלט 10 סריקות המבטיחות זיהוי פוטנציאל פעולה יציב.
7. המשך להקליט והזז מיד את שלב המיקרוסקופ כדי לרכוש בקצרה אות רקע מאזור נטול תאים. כבה את נורית העירור.
   הערה: ערך רקע זה_(היסט F) ישמש לחשבון כל פלואורסצנטיות ברקע.
8. אם תרצה, מקומי לשוטט תרופות התייחסות כגון 1 μM nifedipine כדי לזהות תגובות הסלולר מניפולציה פרמקולוגית.
9. באופן רציף, חזור על שלבים 5.2-5.7, בכל פעם בחירת תא חדש. החליפו כיסויים אם רוצים להבטיח מחזור ניסיוני גבוה בישיבה אחת.
   הערה: פרוטוקולי טעינה ורכישת תמונות מתוארים באיור 2.

6. ניתוח נתונים

1. פתח הקלטה שמורה עם תוכנת הניתוח וממוצע 10 סריקות המכילות פוטנציאל פעולה מגורה מתא בודד.
2. קח ממוצע של האות הבסיסי המייצג_היסט F והפחת אותו מהעקב הממוצע.
3. חשב ∆F/F0 עם הנוסחה הבאה (כאשר F נמדד פלואורסצנטיות ו- F0 הוא פלואורסצנטיות דיאסטולית):
   
4. זהה את קו הבסיס של המעקב (דיאסטולי) ואת תחום העניין (AP) ולמדוד את הפרמטרים הפוטנציאליים הרצויים של פעולת הלב. זה כולל אך אינו מוגבל לזמן הריקבון עבור 50% (APD₅₀) ו 90% (APD₉₀) repolarization.
5. יצא את הנתונים מתא בודד זה לתוכנת גיליון אלקטרוני.
6. חזור על שלבים 6.1 – 6.5 עבור כל ההקלטות. להעריך תוצאות עם בדיקות לא משוערות מתאימות או ניתוח של שונות.

איור 2: פרוטוקולי טעינה ורכישת תמונות. (A)תרשים זרימה של פרוטוקול טעינה מלא של VF2.1Cl עבור iPSC-CMs וקרדיומיוציטים מקומיים. (B)סכמטי פשוט יותר של מפצל קרן (BS) ותצורות מסנן המשמשות בפרוטוקול זה לעריפה וזיהוי של פליטת VF2.1Cl בתגובה לשינויים במתח transmembrane. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

איור 3: פרופילי פוטנציאל פעולה אופטי (AP) של קרדיומיוציטים מקומיים מבודדים ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם נגזרים קרדיומיוציטים (iPSC-CM). (A)AP אופטי מייצג של קרדיומיוצייט מורין יחיד (במרכז) עם ממוצע...

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי כדי לרכוש בקלות פרופילי AP מפורטים מ- iPSC-CMs מבודדים המתאימים למידול אלקטרופיזיולוגי והקרנת תרופות לב. אנו מזהים APs רגילים וחזקים מה- iPSC-CMs שלנו עם זרעים דלילות, מה שמרמז הן על פונקציונליות המחוון והן על נאמנות מתודולוגית.

בשל הספקטרום הרחב של מתוד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
0.25 Trypsin EDTA	Gibco	25200056
B27 Supplement	Gibco	17504044
CaCl2	Carl Roth	HN04.2
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica	ITW Reagents	A1422
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FluoVolt Membrane Potential Kit	Invitrogen	F10488
HEPES	Carl Roth	HN77.4
KCl	Sigma-Aldrich	6781.1
Lamanin	Sigma-Aldrich	114956-81-9
Matrigel	BD	354230
NaCl	Sigma-Aldrich	9265.2
Nifedipine	Sigma-Aldrich	21829-25-4
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
ROCK Inhibitor Y27632	Stemolecule	04-0012-10
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Versene EDTA	Gibco	15040033
Equipment
495LP Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices
Circle Coverslips, Thickness 0	Thermo Scientific	CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B	Molecular Devices
Dual OptoLED Power Supply	Cairn Research
ET470/40x Excitation Filter	Chroma Technology
ET535/50m	Chroma Technology
Etched Neubauer Hemacytometer	Hausser Scientific
Filter Cubes	Cairn Research
IX73 Inverted Microscope	Olympus
MonoLED	Cairn Research
Multiport Adaptors	Cairn Research
Myopacer Cell Stimulator	IonOptix
Optomask Shutter	Cairn Research
Optoscan System Controller	Cairn Research
PH-1 Temperature Controlled Platform	Warner Instruments
Photomultiplier Detector	Cairn Research
PMT Amplifier Insert	Cairn Research
PMT Supply Insert	Cairn Research
RC-26G Open Bath Chamber	Warner Instruments
SA-OLY/2AL Stage Adaptor	Olympus
T565lpxr Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
T660lpxr Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
TC-20 Dual Channel Temperature Controller	npi Electronic
UPLFLN 40X Objective	Olympus
USB 3.0 Colour Camera	Imaging Source
Software
Clampex 11.1	Molecular Devices
Clampfit 11.1	Molecular Devices
IC Capture 2.4	Imaging Source
Prism 8	Graphpad