Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Riepilogo

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Abstract

Le tecniche convenzionali di microelettrodi intracellulari per quantificare l'elettrofisiologia dei cardiomiociti sono estremamente complesse, ad alta intensità di lavoro e tipicamente eseguite a bassa produttività. La rapida e continua espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) presenta un nuovo standard nella ricerca cardiovascolare e sono ora necessari metodi alternativi per aumentare la produttività dei dati elettrofisiologici a livello di singola cellula. VF2.1Cl è un colorante sensibile alla tensione di recente derivazione che fornisce una rapida risposta a canale singolo e di alta grandezza alle fluttuazioni del potenziale di membrana. Possiede una cinetica superiore a quella di altri indicatori di tensione esistenti e rende disponibili dati funzionali equivalenti a quelli delle tecniche tradizionali di microelettrodo. Qui, dimostriamo la caratterizzazione semplificata e non invasiva del potenziale d'azione nei cardiomiociti umani derivati da iPSC a ritmo esterno utilizzando un sistema di fotometria modulare e altamente conveniente.

Introduzione

La modellazione elettrofisiologica dei cardiomiociti e la costruzione di piattaforme efficienti per lo screening dei farmaci cardiaci è essenziale per lo sviluppo di strategie terapeutiche per una varietà di disturbi aritmici. La rapida espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha prodotto promettenti incursioni nella modellizzazione delle malattie umane e nell'indagine farmacologica utilizzando cardiomiociti derivati da pazienti isolati (iPSC-CM). Le tecniche "Gold standard" per la caratterizzazione elettrofisiologica di queste cellule attraverso patch-clamp (current-clamp) possono quantificare la morfologia e la durata del potenziale d'azione (AP), tuttavia, questo metodo è incredibilmente complesso e lento e non adatto per l'acquisizione di dati ad alto rendimento¹. IPSC-CM sono regolarmente segnalati per avere un aumento del potenziale di membrana diastolica e una maggiore corrente di dispersione rispetto ai cardiomiociti nativi adulti². Si suggerisce che le dimensioni più piccole delle cellule e la ridotta capacità della membrana osservata nelle iPSC-CM possano produrre qualche errore sistematico quando si utilizza la tecnica del morsetto di corrente, forse spiegando queste deviazioni³. Al fine di massimizzare l'utilità di una piattaforma iPSC-CM, un metodo aggiuntivo è prezioso per aumentare la produttività e garantire l'accuratezza dei dati quando si caratterizzano le variazioni di tensione transmembrana a livello di singola cella in iPSC-CM.

I coloranti sensibili alla tensione (VSD) sono stati a lungo un metodo proposto per fornire un'analisi più rapida, non invasiva ed equivalente della cinetica AP cardiaca rispetto a quelle delle tecniche tradizionali⁴. Un recente studio ha dimostrato l'idoneità della fotometria della sonda sensibile alla tensione di tensione per quantificare con precisione l'AP^{5 cardiaco.} Inoltre, la capacità di scalare prontamente gli approcci di fotometria ottica conferisce questa tecnica a schermi cardiotossicità su larga scala critici nello sviluppo di farmaci terapeutici (ad esempio, CiPA). Lo sviluppo di protocolli di cardiotossicità standardizzati in uno studio multi-sito in cieco utilizzando array di microelettrodi e tecniche ottiche di rilevamento della tensione ha dimostrato il valore chiave di questo approccio⁶.

Molti coloranti potenziometrici sono disponibili in commercio e lo sviluppo sintetico in corso di nuove sonde mostra un potenziale entusiasmante per semplificare la loro efficacia in una varietà di costrutti cardiaci e neurali. Il VSD ideale avrà una cinetica e una sensibilità aumentate, mentre mostra una diminuzione del carico capacitivo, del fotoscissicità e della citotossicità. Il VF2.1Cl (FluoVolt) recentemente sintetizzato esprime molte di queste proprietà benefiche in gran parte grazie alla sua nuova struttura molecolare a filo, condivisa da altri membri della nuova famiglia VoltageFluor (VF)⁷. In contrasto con i comuni VSD elettrocromici in cui semplici sonde si coniugano molecolarmente ed elettricamente alla membrana plasmatica, questo colorante è costituito da un filo sintetico inserito passivamente, che abbraccia la membrana che accoppia un donatore ricco di elettroni con un fluoroforo di fluoresceina modificato (FITC). I dettagli meccanicistici sono forniti nella Figura 1. Questo colorante dimostra un'eccellente sensibilità alle fluttuazioni di tensione della membrana, mostrando una variazione del 27% dell'intensità di emissione per 100 mV rispetto a ~ 10% osservata in altre sonde comuni a velocità comparabili⁷. Inoltre, i sistemi PeT a filo non interagiscono direttamente con il campo elettrico cellulare che produce interferenze elettriche minime e cambiamenti trascurabili nel carico capacitivo cellulare.

Figura 1: Parametri chimici, spettrali e meccanicistici del colorante VF2.1Cl. (A) Struttura chimica di VF2.1Cl. Le caratteristiche molecolari da notare includono più gruppi alchilici all'interno del filo molecolare fenilene vinilene che facilitano l'inserimento nella membrana plasmatica. Un gruppo di acido solfonico caricato negativamente coniugato alla sonda FITC assicura la stabilizzazione del fluoroforo sulla superficie extracellulare e aiuta vicino all'inserzione perpendicolare rispetto al campo elettrico del doppio strato lipidico. (B) Schema semplificato dell'incorporazione perpendicolare di VF2.1Cl nella membrana plasmatica di una cellula bersaglio. (C) Spettri di assorbimento ed emissione del colorante VF2.1Cl. Gli spettri sono identici a quello delle sonde FITC e GFP standard. (D) Rappresentazione del meccanismo d'azione di VF2.1Cl. In condizioni di riposo (iperpolarizzato), tensioni intracellulari negative guidano gli elettroni liberi verso il fluoroforo rostrale. L'abbondanza di elettroni assicura che il trasferimento di elettroni fotoindotto (PeT) sia favorito come via d'uscita dallo stato eccitato dopo l'eccitazione ottica, spegnendo efficacemente la fluorescenza. Al contrario, un potenziale di membrana depolarizzato influenza il movimento verso il basso degli elettroni favorendo la fluorescenza all'eccitazione ottica. La risposta fluorescente risultante è linearmente correlata alla tensione di membrana e può essere utilizzata con precisione per raccogliere informazioni temporali dettagliate sulla cinetica elettrofisiologica cellulare. (E) Immagini rappresentative a campo luminoso (superiore) e fluorescenza a 470 nm (inferiore) di cardiomiociti leporina caricati con pila VF2.1Cl. (F) Z di un singolo cardiomiocita caricato. Le frecce indicano aree di chiara localizzazione di VF2.1Cl alla membrana cellulare. Le immagini sono state acquisite con un sistema confocale a disco rotante costituito da una testa confocale a disco rotante X-lightv3 con un modello stenopeico da 50 μm; Illuminatore LDI-7; Fotocamera Prime95B e obiettivo PlanApo Lambda 100x. Barra della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La sonda FITC coniugata a VF2.1Cl assicura che possa essere utilizzata efficacemente nelle configurazioni standard e dei filtri GFP e richiede solo un sistema di acquisizione a canale singolo, entrambe caratteristiche comuni delle piattaforme di imaging fluorescenti. Analisi di monostrati iPSC-CM umani densi con questo colorante è stata recentemente riportata^8,9,10,11. Il nostro protocollo differisce da questi studi a causa della nostra indagine su singoli iPSC-CM isolati, imperturbabili dalle influenze elettriche e paracrine di densi monostrati sinciziali e dal nostro uso di un sistema di fotometria economico e personalizzabile rispetto a complesse disposizioni di imaging confocale o ad ampio campo.

Qui, descriviamo il nostro protocollo per l'acquisizione rapida e l'analisi di robusti AP ottici da cardiomiociti umani isolati derivati da iPSC e cardiomiociti nativi (vedi File supplementare). Utilizziamo VF2.1Cl abbinato a una piattaforma all'avanguardia personalizzabile per misure fotometriche a cella singola. Questi protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico del Centro medico universitario di Gottinga (n. 10/9/15).

Protocollo

1. Preparati cellulari

NOTA: Le iPSC umane utilizzate in questo protocollo sono state derivate da donatori sani e differenziate in monostrati utilizzando la modulazione di piccole molecole completamente definita delle tecniche di segnalazione WNT e di purificazione del lattato come precedentemente descritto^12,13,14. I CM iPSC sono stati mantenuti ogni 2-3 giorni con un terreno di coltura descritto di seguito.

1. Preparare un terreno di coltura di mezzo basale (RPMI 1640) e un supplemento al 2% (B27). Conservare a 4 °C. Utilizzare a temperatura ambiente (RT).
2. Preparare un mezzo di placcatura di mezzo basale (RPMI 1640), supplemento al 2% (B27) e inibitore ROCK 1:2000. Conservare a 4 °C. Utilizzare in RT.
3. Coperchi in vetro rotondo #0 da 10 mm sterilizzati con 150 μL di matrice di membrana basale libera da 1:60 fattori e incubare a 4 °C per 4 ore.
   NOTA: l'ottimizzazione del volume del coverslip è necessaria per garantire che l'intero vetro sia coperto mantenendo un'adeguata tensione superficiale per evitare fuoriuscite. 150 μL è consigliato per coperture rotonde da 10 mm. Le dimensioni del lotto, il tipo di coverslip, il volume del coverslip e il tipo di piastra di coltura possono essere adatti alle esigenze degli sperimentatori.
4. Iniziare la dissociazione iPSC-CM con un reagente di dissociazione cellulare basato su EDTA. Assicurarsi che il monostrato sia completamente staccato lavando delicatamente con una pipetta da 1.000 μL.
5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere un mezzo di placcatura a doppio volume. Centrifuga per 10 min a 100 x g.
6. Risuspenare il pellet con un volume desiderato (volume di risuspensione) del mezzo di placcatura. Contare le celle manualmente o elettronicamente.
7. Selezionare la densità ottimale per coverslip (15.000) che consentirà l'analisi cellulare isolata in un secondo momento.
8. Calcola il volume di sospensione cellulare "attiva" (A) necessaria per placcare tutti i coverslip a questa densità desiderata. Applicare la seguente formula e prelevare in un tubo separato:
   
9. Calcolare il volume di mezzo di placcatura supplementare (B) necessario per accogliere ogni coverslip al volume desiderato. Applicare la seguente formula e aggiungere il volume risultante al tubo di sospensione attiva:
   
10. Rimuovere la matrice dai coverslip e applicare il "volume coverslip" della sospensione cellulare (A + B) su ciascun coverslip. Riaspensare regolarmente nel tubo per garantire una distribuzione cellulare uniforme.
11. Incubare a 37 °C per 1 ora. Riempire delicatamente il pozzo con il mezzo di placcatura.
12. Dopo 24 ore, scambiare i supporti con il normale terreno di coltura e mantenere ogni 2-3 giorni.

2. Configurazione sperimentale

1. Equipaggiare un microscopio a epifluorescenza invertita con un ingrandimento 40x, una lente ad alta apertura numerica (N.A: > 0,75) per condurre esperimenti.
2. Accoppiare un LED bianco caldo a commutazione rapida alla porta di illuminazione trasmessa del microscopio. Inserire un semplice filtro rosso a 660 nm nel percorso della luce trasmessa.
   NOTA: Questa luce può essere attivata durante gli esperimenti di fotometria per osservare il campione senza contaminare il segnale fluorescente verde.
3. Montare una testina LED a commutazione rapida da 470 nm per la registrazione fotometrica. Inserire un filtro di eccitazione 470/40 sulla porta epifluorescente del microscopio per ripulire la luce generata dal LED.
   NOTA: per una quantificazione ottimale del segnale si consiglia un sistema di illuminazione con controllo del feedback ad alta velocità dell'uscita ottica.
4. Inserire un cubo di microscopio contenente uno splitter a fascio passante lungo 495 nm nel carosello dell'unità a specchio all'interno del microscopio.
5. Montare un braccio di rilevamento contenente un diaframma a campo regolabile sulla porta C-mount del microscopio per consentire la selezione della regione di interesse.
6. Accoppiare separatamente un rilevatore di fotomoltiplicatori (PMT) e una fotocamera USB al microscopio. Questo sarà la base del sistema di rilevamento delle emissioni.
7. Inserire un cubo filtrante contenente uno splitter a fascio passante lungo 565 nm e un filtro di emissione 535/50 nella porta PMT. Questo divide la luce di emissione tra i due rivelatori.
   NOTA: una telecamera collegata alla porta trasmessa del sistema di rilevamento delle emissioni è in grado di rilevare la luce trasmessa sotto il campo luminoso durante tutti gli esperimenti.
8. Accoppiare il PMT a un alimentatore e a un amplificatore PMT. Collegare l'uscita dell'amplificatore PMT a un pin di ingresso analogico di un sistema di acquisizione dati.
9. Filtrare i dati analogici dal PMT a 1 kHz o superiore.
10. Digitalizzare i dati a una frequenza almeno doppia rispetto alla frequenza più alta presente nel segnale analogico (2 kHz o superiore) per soddisfare i criteri di Nyquist e prevenire l'aliasing.

3. Caricamento cellulare con VF2.1Cl

NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono questo colorante devono essere eseguite in condizioni di scarsa illuminazione.

1. Preparare una soluzione da bagno di Tyrode di (in mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucosio, 4 KCl, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, pH = 7,35 e caldo a 37 °C.
2. Preparare un'aliquota della soluzione di carico in un tubo di microcentrifuga mescolando 5 μL di 1.000x VF2.1Cl e 50 μL di soluzione di poloxamer solubilizzante al 20%.
3. Applicare 5 μL della soluzione di carico a 5 mL di soluzione di Tyrode riscaldata (concentrazione totale di colorante 0,1x) in una capsula di Petri da 20 mm.
   NOTA: la concentrazione finale del colorante è 0,1x. Questo è 1/10^di quello suggerito dal produttore. Ciò preserva le risorse, garantisce una citotossicità trascurabile e, soprattutto, conserva ancora chiari segnali ottici da cellule caricate con elevati rapporti segnale/rumore.
4. Aggiungere un singolo coperchio iPSC-CM al piatto e incubare a 37 °C per 20 minuti.
5. Assemblare una camera di imaging a cellule vive riscaldata. Montare sullo stadio del microscopio e riempire con 500 μL di soluzione di Tyrode fresca.
6. Lavare il coperchio con la soluzione fresca di Tyrode a 37 °C.
7. Applicare con attenzione il coverslip iPSC-CM sulla camera da bagno preriscaldata utilizzando una pinna a punto fine.
   NOTA: Assicurarsi che la camera e il suo contenuto siano sempre riscaldati a temperature fisiologiche. Se lo si desidera, iniziare con una perfusione continua della soluzione di Tyrode riscaldata.

4. Stimolazione elettrica del campo

NOTA: L'attivazione esterna di iPSC-CM è facoltativa ma utile per la standardizzazione della dinamica cellulare e dei parametri sperimentali. Aumenta la facilità di analisi e consente l'indagine degli effetti dipendenti dalla frequenza.

1. Collegare un inserto di stimolazione con due elettrodi di platino distanziati di 5 mm nella camera di registrazione.
2. Collegare uno stimolatore esterno all'inserto di stimolazione. Impostare su impulsi di campo bipolare da 5 ms a 0,5 Hz.
3. Determinare la tensione di stimolazione ottimale aumentando lo stimolo da 1 V in su. Lo stimolo di soglia è definito come la tensione più bassa alla quale le cellule iniziano a contrarsi. Applicare tensioni di circa il 25% al di sopra di questa soglia. L'intervallo normale è compreso tra 1 V e 30 V.
4. Fissa la frequenza di stimolazione con lo stimolatore esterno o attivala con un software di acquisizione.

5. Acquisizione del potenziale d'azione ottico

NOTA: questo protocollo utilizza un software commerciale per l'acquisizione e l'analisi.

1. Visualizza i miociti in vista a campo luminoso utilizzando il percorso della luce trasmessa e la telecamera USB.
2. Selezionare una cella isolata e ritagliare strettamente il suo percorso ottico con il diaframma di campo assicurando che venga monitorata solo la luce proveniente dalla cella di interesse.
3. Attivare l'amplificatore PMT e impostare l'alimentazione PMT su 750 V.
4. Eseguire il protocollo di stimolazione (vedere il passaggio 4) insieme al software di acquisizione e contemporaneamente attivare la luce di eccitazione a 470 nm. Quest'ultimo può essere fatto tramite un pannello remoto o automatizzato ad un'intensità fissa (segnale TTL).
5. Regolare il guadagno e l'offset dell'amplificatore PMT per assicurarsi che il segnale non si saturi e sia ottimizzato per il raggio di rilevamento del sistema di registrazione.
6. Registra 10 sweep assicurando che vengano rilevati potenziali d'azione stabili.
7. Continuare a registrare e spostare immediatamente lo stadio del microscopio per acquisire brevemente il segnale di fondo da una regione priva di cellule. Spegnere la spia di eccitazione.
   NOTA: questo valore di sfondo_(offset F) verrà utilizzato per tenere conto di qualsiasi fluorescenza di fondo.
8. Se lo si desidera, perfondere localmente farmaci di riferimento come la nifedipina da 1 μM per identificare le risposte cellulari alla manipolazione farmacologica.
9. In modo sequenziale, ripetere i passaggi da 5.2 a 5.7, ogni volta selezionando una nuova cella. Sostituire le coverslip se lo si desidera per garantire un elevato turnover sperimentale in una singola seduta.
   NOTA: i protocolli di caricamento e acquisizione delle immagini sono descritti nella Figura 2.

6. Analisi dei dati

1. Apri una registrazione salvata con il software di analisi e in media 10 sweep contenenti potenziali d'azione stimolati da una singola cella.
2. Prendi una media del segnale di base che rappresenta_l'offset F e sottrai questo dalla traccia mediata.
3. Calcola ∆F/F0 con la seguente formula (dove F è misurata la fluorescenza e F0 è la fluorescenza diastolica):
   
4. Identificare la traccia basale (diastolica) e l'area di interesse (AP) e misurare i parametri del potenziale d'azione cardiaco desiderati. Ciò include, ma non è limitato al tempo di decadimento per la ripolarizzazione del 50% (APD₅₀₎e del 90% (APD_90).
5. Esporta i dati da questa singola cella a un software per fogli di calcolo.
6. Ripetere i passaggi 6.1 – 6.5 per tutte le registrazioni. Valutare i risultati con appropriati test non accoppiati o analisi della varianza.

Figura 2: Protocolli di caricamento e acquisizione delle immagini. (A) Diagramma di flusso del protocollo di carico VF2.1Cl completo per iPSC-CM e cardiomiociti nativi. (B) Schema semplificato di beam splitter (BS) e configurazioni di filtri utilizzati in questo protocollo per l'eccitazione e il rilevamento dell'emissione di VF2.1Cl in risposta alle variazioni della tensione transmembrana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Figura 3: Profili del potenziale d'azione ottico (AP) di cardiomiociti nativi isolati e cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CM). (A) AP ottico rappresentativo di un singolo cardiomiocita murino (al centro) con SEM ± media di APD₅₀ e APD₉₀ (n = 7, destra). (B) AP ottico rappresentativo di ...

Discussione

Qui descriviamo un protocollo di base per acquisire facilmente profili AP dettagliati da iPSC-CM isolati adatti per la modellazione elettrofisiologica e lo screening di farmaci cardiaci. Rileviamo AP regolari e robusti dai nostri iPSC-CM scarsamente seminati, il che suggerisce sia la funzionalità dell'indicatore che la fedeltà metodologica.

A causa dell'ampio spettro di metodologie commerciali per la riprogrammazione iPSC e della mancanza di standardizzazione per i protocolli di differenziaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
0.25 Trypsin EDTA	Gibco	25200056
B27 Supplement	Gibco	17504044
CaCl2	Carl Roth	HN04.2
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica	ITW Reagents	A1422
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FluoVolt Membrane Potential Kit	Invitrogen	F10488
HEPES	Carl Roth	HN77.4
KCl	Sigma-Aldrich	6781.1
Lamanin	Sigma-Aldrich	114956-81-9
Matrigel	BD	354230
NaCl	Sigma-Aldrich	9265.2
Nifedipine	Sigma-Aldrich	21829-25-4
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
ROCK Inhibitor Y27632	Stemolecule	04-0012-10
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Versene EDTA	Gibco	15040033
Equipment
495LP Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices
Circle Coverslips, Thickness 0	Thermo Scientific	CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B	Molecular Devices
Dual OptoLED Power Supply	Cairn Research
ET470/40x Excitation Filter	Chroma Technology
ET535/50m	Chroma Technology
Etched Neubauer Hemacytometer	Hausser Scientific
Filter Cubes	Cairn Research
IX73 Inverted Microscope	Olympus
MonoLED	Cairn Research
Multiport Adaptors	Cairn Research
Myopacer Cell Stimulator	IonOptix
Optomask Shutter	Cairn Research
Optoscan System Controller	Cairn Research
PH-1 Temperature Controlled Platform	Warner Instruments
Photomultiplier Detector	Cairn Research
PMT Amplifier Insert	Cairn Research
PMT Supply Insert	Cairn Research
RC-26G Open Bath Chamber	Warner Instruments
SA-OLY/2AL Stage Adaptor	Olympus
T565lpxr Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
T660lpxr Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
TC-20 Dual Channel Temperature Controller	npi Electronic
UPLFLN 40X Objective	Olympus
USB 3.0 Colour Camera	Imaging Source
Software
Clampex 11.1	Molecular Devices
Clampfit 11.1	Molecular Devices
IC Capture 2.4	Imaging Source
Prism 8	Graphpad