İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Özet

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

Özet

Kardiyomiyosit elektrofizyolojisini ölçmek için geleneksel hücre içi mikroelektrot teknikleri son derece karmaşık, emek yoğun ve tipik olarak düşük verimde gerçekleştirilir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı ve sürekli genişlemesi kardiyovasküler araştırmalarda yeni bir standart sunun ve elektrofizyolojik verilerin verimini tek bir hücre düzeyinde artırmak için alternatif yöntemler artık gereklidir. VF2.1Cl, membran potansiyelindeki dalgalanmalara hızlı bir tek kanallı, yüksek büyüklükte tepki sağlayan yakın zamanda türetilmiş voltaja duyarlı bir boyadır. Diğer mevcut voltaj göstergelerinden daha üstün kinetiklere sahiptir ve geleneksel mikroelekrod tekniklerine eşdeğer işlevsel verileri kullanıma sunmaktadır. Burada, modüler ve son derece uygun fiyatlı bir fotometri sistemi kullanarak harici tempolu insan iPSC türevli kardiyomiyositlerde basitleştirilmiş, invaziv olmayan eylem potansiyeli karakterizasyonunu gösteriyoruz.

Giriş

Kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik modellemesi ve kardiyak ilaç taraması için verimli platformların inşası, çeşitli aritmik bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesi için gereklidir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı genişlemesi, izole hasta türevli kardiyomiyositler (iPSC-CM) kullanılarak insan hastalığı modellemesi ve farmakolojik araştırmalara umut verici yollar üretmiştir. Bu hücrelerin yama kelepçesi (akım kelepçesi) yoluyla elektrofizyolojik karakterizasyonu için "altın standart" teknikler, eylem potansiyelini (AP) morfolojiyi ve süresini ölçebilir, ancak bu yöntem inanılmaz derecede karmaşık ve yavaştır ve yüksek ver....

Protokol

1. Hücresel hazırlıklar

NOT: Bu protokolde kullanılan insan iPSC'leri sağlıklı donörlerden türetilmiş ve daha önce açıklandığı gibi WNT sinyalizasyon ve laktat saflaştırma tekniklerinin tam tanımlı küçük molekül modülasyonu kullanılarak monolayerlerde farklılaştırılmıştır^12,13,14. iPSC-CM'ler her 2-3 günde bir aşağıda özetlenen bir kültür ortamı ile sürdürülmektedir.

1. Bazal ortam (RPMI 1640) ve %2 takviye (B27) kültür ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın. Oda sıcaklığında (RT) kullanın.
2. Bazal ortam (RPMI 1640), %2 takviye (B27) v....

Sonuçlar

Şekil 3: İzole edilmiş yerli kardiyomiyositlerin optik eylem potansiyeli (AP) profilleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler (iPSC-CM). (A) APD 50 ve APD_90'ın Ortalama ± SEM'i_(n = 7, sağ) ile tek bir murine kardiyomiyosit (ortada) temsili optik AP. (B) TEK bir insan iPSC türetilmiş kardiy.......

Tartışmalar

Burada, elektrofizyolojik modelleme ve kardiyak ilaç taraması için uygun izole iPSC-CM'lerden ayrıntılı AP profillerini kolayca elde etmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Seyrek tohumlu iPSC-CM'lerimizden hem gösterge işlevselliğini hem de metodolojik doğruluğu öneren düzenli ve sağlam AP'ler tespit ediyoruz.

iPSC yeniden programlama için geniş ticari metodoloji yelpazesi ve kardiyak farklılaşma protokolleri için standardizasyon eksikliği nedeniyle, iPSC tabanlı m.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
0.25 Trypsin EDTA	Gibco	25200056
B27 Supplement	Gibco	17504044
CaCl2	Carl Roth	HN04.2
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica	ITW Reagents	A1422
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FluoVolt Membrane Potential Kit	Invitrogen	F10488
HEPES	Carl Roth	HN77.4
KCl	Sigma-Aldrich	6781.1
Lamanin	Sigma-Aldrich	114956-81-9
Matrigel	BD	354230
NaCl	Sigma-Aldrich	9265.2
Nifedipine	Sigma-Aldrich	21829-25-4
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
ROCK Inhibitor Y27632	Stemolecule	04-0012-10
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Versene EDTA	Gibco	15040033
Equipment
495LP Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices
Circle Coverslips, Thickness 0	Thermo Scientific	CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B	Molecular Devices
Dual OptoLED Power Supply	Cairn Research
ET470/40x Excitation Filter	Chroma Technology
ET535/50m	Chroma Technology
Etched Neubauer Hemacytometer	Hausser Scientific
Filter Cubes	Cairn Research
IX73 Inverted Microscope	Olympus
MonoLED	Cairn Research
Multiport Adaptors	Cairn Research
Myopacer Cell Stimulator	IonOptix
Optomask Shutter	Cairn Research
Optoscan System Controller	Cairn Research
PH-1 Temperature Controlled Platform	Warner Instruments
Photomultiplier Detector	Cairn Research
PMT Amplifier Insert	Cairn Research
PMT Supply Insert	Cairn Research
RC-26G Open Bath Chamber	Warner Instruments
SA-OLY/2AL Stage Adaptor	Olympus
T565lpxr Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
T660lpxr Dichroic Beamsplitter	Chroma Technology
TC-20 Dual Channel Temperature Controller	npi Electronic
UPLFLN 40X Objective	Olympus
USB 3.0 Colour Camera	Imaging Source
Software
Clampex 11.1	Molecular Devices
Clampfit 11.1	Molecular Devices
IC Capture 2.4	Imaging Source
Prism 8	Graphpad