אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ושימוש במודל סטרס חמצוני על ידי טיפול בתאי אפיתל פיגמנט רשתית עם H₂O₂, ניתוח מורפולוגיה של תאים, כדאיות, צפיפות, גלוטתיון, ורמת UCP-2. זהו מודל שימושי לחקור את ההשפעה נוגדת החמצון של חלבונים המופרשים על ידי תאים transposon-transfected לטיפול ניוון neuroretinal.

Abstract

סטרס חמצוני ממלא תפקיד קריטי במספר מחלות ניווניות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), פתולוגיה המשפיעה על כ -30 מיליון חולים ברחבי העולם. זה מוביל לירידה אפיתל פיגמנט רשתית (RPE)-מסונתז גורמים neuroprotective, למשל, גורם פיגמנט נגזר אפיתל (PEDF) ו granulocyte-מקרופאג מושבה מגרה גורם (GM-CSF), ואחריו אובדן של תאי RPE, ובסופו של דבר פוטורצפטור ותא גנגליון רשתית (RGC) מוות. אנו משערים כי שחזור של סביבת הרשתית neuroprotective ו neurogenic על ידי השתלה תת-רינטלית של תאי RPE transfected overexpressing PEDF ו- GM-CSF יש פוטנציאל למנוע ניוון רשתית על ידי הקלה על ההשפעות של עקה חמצונית, עיכוב דלקת, ותמיכה בהישרדות התא. באמצעות מערכת טרנספוסון היפהפייה הנרדמת (SB100X) תאי RPE אנושיים הועברו עם הגנים PEDF ו- GM-CSF והראו שילוב גנים יציב, ביטוי גנים לטווח ארוך והפרשת חלבונים באמצעות qPCR, כתם מערבי, ELISA ואימונופלואורסצנטיות. כדי לאשר את הפונקציונליות ואת העוצמה של PEDF ו- GM-CSF המופרשים על ידי תאי RPE שהודבקו, פיתחנו מבחנה כדי לכמת את ההפחתה של H₂O₂- סטרס חמצוני המושרה על תאי RPE בתרבית. הגנה על התא הוערכת על ידי ניתוח מורפולוגיה של תאים, צפיפות, רמה תאית של גלוטתיון, ביטוי גן UCP2, ואת הכדאיות התא. שניהם, תאי RPE שהודבקו ב-PEDF ו/או GM-CSF ותאים שאינם מועברים אך מטופלים מראש עם PEDF ו/או GM-CSF (זמין או מטוהר באופן מסחרי מתאים שהודבקו) הראו הגנה משמעותית על תאים נוגדי חמצון בהשוואה לבקרות שאינן מטופלות. מודל H₂O₂הנוכחי הוא גישה פשוטה ויעילה להערכת ההשפעה נוגדת החמצון של גורמים שעשויים להיות יעילים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות דומות.

Introduction

המודל המתואר כאן, מציע גישה שימושית כדי להעריך את היעילות של סוכניםbiopharmaceutical להפחתת עקה חמצונית בתאים. השתמשנו במודל כדי לחקור את ההשפעות המגנות של PEDF ו- GM-CSF על H₂O₂- מתח חמצוני מתווך על תאי אפיתל פיגמנט רשתית, אשר נחשפים לרמות גבוהות של O₂, ואור גלוי, ואת phagocytosis של קרומי המגזר החיצוני photoreceptor, יצירת רמות משמעותיות של מינים חמצן תגובתי (ROS)^{1, 2.} הם נחשבים לתורם מרכזי לפתוגנזה של ניוון מקולרי הקשור לגיל כלי דם (aAMD)^3,4,5,6,7,8. חוץ מזה, יש ירידה בגורמים neuroprotective מסונתז RPE, במיוחד את הפיגמנט נגזר אפיתל גורם (PEDF), גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGFs), ו granulocyte מקרופאג-מושבה מגרה גורם (GM-CSF) המוביל לתפקוד לקוי ואובדן של תאי RPE, ואחריו פוטורצפטור ותא גנגליון רשתית (RGC) מוות^3,4,5 . AMD היא מחלה מורכבת הנובעת מהאינטראקציה בין גורמים מטבוליים, פונקציונליים, גנטיים וסביבתיים⁴. היעדר טיפולים עבור AAMD הוא הגורם העיקרי לעיוורון בחולים מעל גיל 60 במדינות מתועשות^9,10. לחזרת הסביבה הנוירו-הגנתית והנוירוגנית ברשתית על ידי השתלה תת-רינטלית של תאי RPE מהונדסים גנטית המדחיקים יתר על המידה PEDF ו- GM-CSF יש פוטנציאל למנוע ניוון רשתית על ידי הקלה על ההשפעות של סטרס חמצוני, עיכוב דלקת ותמיכה בהישרדות תאים^{11,12,13,14,15,16} . למרות שיש מספר מתודולוגיות להעברת גנים לתאים, בחרנו במערכת הטרנספוסון ההיפראקטיבית של היפהפייה הנרדמת הלא ויראלית כדי להעביר את הגנים PEDF ו- GM-CSF לתאי RPE בגלל פרופיל הבטיחות שלה, שילוב הגנים בגנום של התאים המארחים, ונטייתו לשלב את הגנים המועברים באתרים פעילים שאינם תמלול כפי שהראינו בעבר^{17, 18,19.}

סטרס חמצוני תאי יכול להיגרם בתאים בתרבית במבחנה על ידי מספר גורמים חמצוניים, כולל מי חמצן (H₂O₂), 4-הידרוינונאל (HNE), טרבוטיל הידופרוקסיד (tBH), מתחי חמצן גבוהים ואור גלוי (ספקטרום מלא או הקרנת UV)^20,21. מתחי חמצן גבוהים ואור דורשים ציוד ותנאים מיוחדים, המגבילים את יכולת ההעברה למערכות אחרות. סוכנים כגון H₂O₂, HNE, ו- tBH גורמים לשינויים מולקולריים ותאיים חופפים של עקה חמצונית. בחרנו H₂O₂ כדי לבדוק את הפעילות נוגדת החמצון של PEDF ו- GM-CSF כי זה נוח ורלוונטי ביולוגית שכן הוא מיוצר על ידי תאי RPE כמו ביניים חמצן תגובתי במהלך פוטורצפטור קטע חוץ phagocytosis²² והוא נמצא ברקמות עינית vivo²³. מאז חמצון גלוטתיון עשוי להיות אחראי חלקית על הייצור של H₂O₂ בעין, ניתחנו את רמות GSH / גלוטתיון במחקרים שלנו, אשר קשורים H₂O₂- סטרס חמצוני המושרה ואת היכולת ההתחדשותית של תאים^21,22. הניתוח של רמות גלוטתיון רלוונטי במיוחד שכן הוא משתתף במנגנוני ההגנה נוגדי חמצון בעין²⁴. _חשיפהל- H 2 O₂ משמשת לעתים קרובות כמודל לבחינת רגישות מתח חמצוני ופעילות נוגדת חמצון של תאי RPE^{1,25,26,27,28,29,30}, ובנוסף, הוא מראה דמיון לנזק ללחץ חמצוני שנגרם לאור, מקור "פיזיולוגי" של סטרס חמצוני²¹.

כדי להעריך את הפונקציונליות ואת האפקטיביות של גורמים neuroprotective, פיתחנו מודל במבחנה המאפשר לניתוח לכמת את ההשפעה נוגד חמצונית של גורמי גדילה לידי ביטוי על ידי תאים מהונדסים גנטית כדי להגזים PEDF ו- GM-CSF. כאן, אנו מראים כי תאי RPE שהודבקו בגנים עבור PEDF ו- GM-CSF עמידים יותר להשפעות המזיקות של H₂O₂ מאשר תאי בקרה שאינם מודבקים, כפי שמעידים מורפולוגיה של תאים, צפיפות, כדאיות, רמה תאית של גלוטתיון, וביטוי של גן UCP2, אשר מקודדים לחלבון המיטוכונדריאלי 2 שהוכח כמפחית מינים חמצן תגובתי (ROS)³¹.

Protocol

נהלי איסוף ושימוש בעיניים אנושיות אושרו על ידי הוועדה האתית הקטורונלית למחקר (מס' 2016-01726).

1. בידוד תאים ותנאי תרבות

1. קו תאים ARPE-19 אנושי
   1. תרבות 5 x 10⁵ תאי ARPE-19, קו תאי RPE אנושי, בתערובת בינונית/תזונתית של Dulbecco F-12 חזיר (F-12 של DMEM / Ham) בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS), 80 פניצילין U / mL, 80 מיקרוגרם / mL סטרפטומיצין, ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B (בינוני מלא) ב 37 °C (5 °F) באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ו 95% אוויר בבקבוק T75 (עבור צפיפות תאים אחרים לראות טבלה 1).
   2. שנה את המדיום שלוש פעמים בשבוע.
   3. לאחר שהתאים גדלים לכ -90% מפגש (מוערך באיכות), שואפים למדיום ולשטוף את התאים עם PBS סטרילי 1x.
   4. לדגור על התאים עם פתרון EDTA EDTA 5% טריפסין-2% למשך 7-10 דקות ב 37 °C (עבור אמצעי אחסון ראה טבלה 1). נטר ניתוק באופן חזותי.
   5. הפסק טריפסיניזציה על-ידי הוספת מדיום מלא המכיל 10% FBS (עבור אמצעי אחסון ראה טבלה 1).
   6. בצע שינוי התאים (ראה שלב 2. של הפרוטוקול), לטפח את התאים ביחס של 1:10 (פעם בשבוע), או לזרוע בלוח 96-well המפורט להלן (ראה שלבים 3.3 ו- 3.4 של הפרוטוקול).

				בינוני (מ"ל)
	שטח (ס"מ רבוע)	צפיפות זריעה עבור תאי ARPE-19 (תאים/באר)	יישום	עבור תרבית תאים	כדי לעצור טריפסין	נפח טריפסין (mL)
בקבוקון T75	75	5,00,000	צמיחת תאי ARPE-19	10	7	3
6 צלחת באר	9.6	1,00,000	זריעה של תאי ARPE-19 שהודבקו	3	1	0.5
24 צלחת ובכן	2	50,000	זריעה של תאי hRPE שהודבקו	1	0.8	0.2
96 צלחת באר	0.32	5,000 לניסויי עקה חמצונית עם תאים שהודבקו (איור 1)	ניסויי עקה חמצונית	0.2
		3,000 לניסויי עקה חמצונית עם תאים שאינם מודבקים בתוספת חלבונים (איור 1)

טבלה 1: כרכים של תרביות תאים. אמצעי אחסון מדיה מומלצים עבור לוחות תרבית תאים ובקבוקונים עבור התרבות של ARPE-19 ותאי RPE אנושיים ראשוניים.

2. תאי RPE אנושיים ראשוניים
   1. לבודד תאי RPE אנושיים ראשוניים כפי שתואר על ידי Thumann et al.¹⁷, ותאי תרבות במדיום מלא בתוספת 20% FBS.
   2. שנה את המדיום פעמיים בשבוע. ברגע שהתאים מגיעים למפגש (מנוטר חזותית), הפחיתו את FBS ל-1% כדי להימנע מצפיפות יתר.
   3. בצע את התאים (ראה שלב 2 של הפרוטוקול), או זרע בלוח 96-well כמפורט להלן (ראה שלבים 3.3 ו- 3.4 של הפרוטוקול).
      הערה: נתונים שהוצגו כאן נאספו מתרבות תאי RPE שהתקבלו מעיניהם של ארבעה תורמים אנושיים. טבלה 2 מפרטת את הדמוגרפיה של התורמים מבנק עין מתנת האריות (סנט פול, MN). העיניים היו enleed 12.7 ± 5.7 שעות (ממוצע ± SD) לאחר קבלת הסכמה מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי.

	לא	גיל	מין	מוות לשימור (שעות)	מוות לבידוד	טיפוח	טיפוח	סימן בגרף
					(ימים)	לפני טרנספקט (ימים)	לאחר טרנספקט (ימים)
	2	80	M	20.7	8	140	36
	3	86	F	12.8	8	85	45
	4	86	F	8.5	5	26	133
	8	83	F	8.9	6	18	27
התכוון		83.8		12.7	6.8	67.3	60.3
SD		2.9		5.7	1.5	57.0	49.1

טבלה 2: דמוגרפיה של תורמים אנושיים לתאי אפיתל פיגמנט רשתית.

2. אלקטרופורציה של ARPE-19 ותאי RPE אנושיים ראשוניים

1. Trypsinize ARPE-19 תאים או תאי RPE אנושיים ראשוניים כמתואר בשלבים 1.1.3-1.1.5 של הפרוטוקול.
2. בצע אלקטרופורציה עם ערכת transfection זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים).
   1. עבור transfection של ARPE-19 תאים מתייחס יוחנן ואח^'32 ועל hRPE ראשי לתאומן ואח^'17. בקצרה, resuspend 1 x 10⁵ תאי ARPE-19 או 5 x 10⁴ תאי hRPE ראשיים ב 11 μL של חוצץ R ולהוסיף 2 μL של תערובת plasmid המכיל 0.03 מיקרוגרם pSB100X transposase³³ ו 0.47 μg pT2-CMV-PEDF- שלו או pT2-CMV-GMCSF-טרנספוסון שלו (טרנספוסאז יחס:transposon 1:16). עבור תאי PEDF ו- GM-CSF כפולים, השתמש ביחס של 1:16:16 (0.03 מיקרוגרם pSB100X, 0.47 מיקרוגרם pT2-CMV-PEDF-His, ו- 0.47 מיקרוגרם pT2-CMV-GMCSF-שלו). השתמש בפרמטרים הבאים electroporation: שתי פעימות של 1,350 V עבור 20 ms (רוחב דופק) עבור תאי ARPE-19; שני פולסים של 1,100 V עבור 20 אלפיות השנייה לתאים ראשוניים.
3. זרע 1 x 10⁵ ARPE-19 או 5 x 10⁴ תאי hRPE ראשוניים שהודבקו בצלחות 6-well ו-24-well, בהתאמה, ב-10% FBS ללא אנטיביוטיקה או תרופות אנטי-מיקוטיות. הוסף פניצילין (80 U/mL), סטרפטומיצין (80 מיקרוגרם /מ"ל) ואמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) עם החילוף הבינוני הראשון 3 ימים לאחר טרנספקטו.
4. לקבוע את צמיחת התא על ידי ניטור מיקרוסקופי שבועי של התאים. יעילות טרנספקטיון מנוטרת על ידי ניתוח ביטוי גנים על ידי RT-PCR, והפרשת חלבונים על ידי ELISA ו- WB (שיטות המוסברות בחומר משלים).
   הערה: יעילות טרנספקטו ניתן להעריך בפעם הראשונה ברגע התאים להגיע למפגש, כלומר, ב ~ 7 ימים ו 4 שבועות לאחר transfection עבור תאי ARPE-19 ותאי hRPE ראשיים, בהתאמה.
5. תאי זרעים בלוח של 96 באר ומפורט להלן (ראה שלב 3.5 של הפרוטוקול).

3. אינדוקציה של סטרס חמצוני (טיפול H₂O₂₎ והגנה עצבית (PEDF ו/או טיפול GM-CSF)

1. הכנת מדיום מותנה של תאי ARPE-19 שהודבקו
   1. השתמש בתאי ARPE-19 שהודבקו בגנים PEDF, GM-CSF, או שניהם (ראה שלב 2 של הפרוטוקול); תאי תרבות במשך 28 ימים כמתואר בשלב 1.1 של הפרוטוקול.
   2. ב 28 ימים לאחר transfection, תאי טריפסין (ראה שלבים 1.1.3-1.1.5 של הפרוטוקול), לספור תאים באמצעות תא Neubauer^34,35, וזרע 5 x 10⁵ תאים בבקבוקי T75 במדיום מלא כמתואר בשלב 1.1.1 של הפרוטוקול. החלף את המדיום כאשר תרבית התא היא כ 80% confluent (כ לאחר שבוע; מאומת איכות). לאסוף את המדיום לאחר 24 שעות.
   3. יש לאחסן את המדיום ב-20 °C (70 °F) עד לשימוש.
      הערה: ריכוז מספיק של PEDF רקומביננטי ו- GM-CSF במדיום המותנה אומת על ידי WB וכימת על ידי ELISA כמתואר בחומר משלים.
2. טיהור PEDF ו- GM-CSF מאמצעי מותנה של תאי ARPE-19 שהודבקו
   1. צנטריפוגות המדיום שנאסף מ שלב 3.1.2 ב 10,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
   2. השתמש בזרימת העל של Ni-NTA (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקולי היצרן כדי לטהר חלבונים מתויגים שלו כמתואר להלן.
      1. Pipette 30 μL של תערובת Ni-NTA לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה ב 2,600 x g עבור 30 s ולהשליך את הזרימה דרך. לשטוף את הכדור פעמיים עם 200 μL של חוצץ הדגירה 1x.
      2. צנטריפוגה ב 2,600 x g עבור 30 s ולהשליך את הזרימה דרך. הוסף 40 μL של 4x חוצץ דגירה ו resuspend.
      3. הוסף 900 μL של בינוני מותנה צנטריפוגות ודגורה ב 70 סל"ד (שייקר מסלולית) עבור 1 שעה ב RT. צנטריפוגה ב 2,600 x גרם במשך 1 דקות ואת זרימה להשליך דרך.
      4. לשטוף את הכדור פעמיים עם 175 μL של חוצץ הדגירה 1x. צנטריפוגה ב 2,600 x g עבור 30 s ולהשליך את הזרימה דרך.
      5. כדי לחמוק מחלבוני PEDF ו-GM-CSF מתויגים שלו, הוסיפו 20 מיקרו-אל של חיץ אלוטיון ודגרה ב-70 סל"ד (שייקר מסלולי) למשך 20 דקות ב-RT. צנטריפוגה ב-2,600 x גרם ל-30 מעלות. שמור על סופר-טבעי המכיל PEDF רקומביננטי או GM-CSF.
   3. לכמת את סך החלבון באמצעות ערכת החלבון BCA הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
   4. יש לאחסן את תמיסה חלבון ב-20 °C (70 °F) עד לשימוש.
      הערה: מאגר הדגירה (4x) מכיל 200 מ"מ NaH₂PO_4,1.2 M NaCl, ו 40 mM Imidazol; מאגר Elution מכיל 50 מ"מ NaH₂PO_4,300 מ"מ NaCl, ו 250 mM Imidazol.
3. טיפול בתאי ARPE-19/hRPE לא מודבקים עם מדיום מותנה בתוספת H₂O₂ (איור 1A)
   1. זרע 3,000 ARPE-19 שאינם מודבקים (מהשלב 1.1.6 של הפרוטוקול) או hRPE ראשי (מהשלב 1.2.3 של הפרוטוקול) תאים לבאר בצלחת ובתרבית של 96 טוב ב- 200 μL של מדיום מותנה מתאי ARPE-19 שהודבקו.
   2. תרבית התאים במשך 10 ימים ב 37 °C (5 °F) באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ו 95% אוויר. שנה את המדיום המותנה כל יום. לחשוף את התאים 350 μM H₂O₂ עבור 24 שעות.
   3. להעריך נזק סטרס חמצוני ולקבוע את ההשפעה נוגדת החמצון של PEDF ו- GM-CSF על ידי כימות של רמות גלוטתיון (ראה שלב 4.1 של הפרוטוקול), מיקרוסקופיה (ראה שלב 4.2 של הפרוטוקול) ובוחן ציטוטוקסיות (ראה שלב 4.2 של הפרוטוקול).
      הערה: משך הניסוי הוא 12 ימים. לוחות מיקרווול שטוחים ברורים משמשים להערכת זוהר כמו גם מורפולוגיה של תאים. כדי לבצע בו זמנית את הציטוקסיות ואת ההבחנה גלוטתיון, שתי צלחות חייבות להיות זרע עם תאים באותו יום.
4. טיפול בתאי ARPE-19/hRPE לא מהודבקים עם גורמי גדילה של PEDF ו- GM-CSF בתוספת H₂O₂ (איור 1B)
   1. זרע 3,000 ARPE-19 שאינם מודבקים (החל מהשלב 1.1.6 של הפרוטוקול) או hRPE ראשי (מהשלב 1.2.3 של הפרוטוקול) תאים לבאר (לוחות 96-well עם תחתית שטוחה ברורה) ב-200 μL של מדיום תרבית מלא המכיל 500 ננוגרם/מ"ל רקומביננטי PEDF ו/או 50 ng/mL רקומביננטי GM-CSF, מטוהרים מהמדיום של תאי ARPE-19 שהודבקו או זמינים מסחרית. תאי תרבות עבור 48 שעות ב 37 °C (5 °F) באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ו 95% אוויר. לחדש את המדיום כולל גורמי גדילה PEDF ו- GM-CSF מדי יום.
      הערה: הוסף את גורמי הצמיחה טריים למדיום.
   2. לאחר 48 שעות של טיפול בתאים עם גורמי גדילה, להסיר את המדיום ולהוסיף מדיום מלא המכיל 350 μM H₂O₂ בתוספת 500 ng / mL PEDF ו / או 50 ng / mL GM-CSF.
   3. להעריך נזק סטרס חמצוני ולקבוע את ההשפעה נוגדת החמצון של PEDF ו- GM-CSF על ידי כימות של רמות גלוטתיון (ראה שלב 4.1 של הפרוטוקול), מיקרוסקופיה (ראה שלב 4.2 של הפרוטוקול) ובוחן ציטוטוקסיות (ראה שלב 4.2 של הפרוטוקול).
      הערה: משך הניסוי הוא 3 ימים.
5. טיפול בתאי ARPE-19/hRPE ראשוניים עם H₂O₂ (איור 1C)
   1. אמת ביטוי גנים מספיק והפרשת חלבונים של תאים שהודבקו על ידי WB ו- ELISA כמתואר בחומר המשלים.
   2. הסר את המדיום מהבארות המכילות את התאים שהודבקו (ראה שלב 2 בפרוטוקול).
   3. Trypsinize תאים כמתואר בשלבים 1.1.3-1.1.5 של הפרוטוקול. לספור את התאים באמצעות תא Neubauer^34,35.
   4. זרע 5,000 תאים שהודבקו / באר בצלחת 96-well ב 200 μL של מדיום מלא. תאי תרבות עבור 24 שעות ב 37 °C (5 °F) באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ו 95% אוויר. לאחר 24 שעות, לחשוף את התאים 350 μM H₂O₂ עבור 24 שעות.
   5. להעריך נזק סטרס חמצוני ולקבוע את ההשפעה נוגדת החמצון של PEDF ו- GM-CSF על ידי כימות של רמות גלוטתיון (ראה שלב 4.1 של הפרוטוקול), מיקרוסקופיה (ראה שלב 4.2 של הפרוטוקול), בדיקת ציטוטוקסיות (ראה שלב 4.2 של הפרוטוקול) וקביעת ביטוי גנים UCP2 (ראה שלב 4.3 של הפרוטוקול).
      הערה: משך הניסוי הוא יומיים.

איור 1: לוחות זמנים של בדיקת H₂O₂ בשלוש הגישות הניסיוניות השונות. 3,000 תאים שאינם נגועים שטופלו בחלבונים בינוניים/רקומביננטיים מותנים או 5,000 תאים שהודבקו נזרעו ב-96 צלחות היטב לטיפול ב-H₂O₂. כדי לקבוע את ההשפעה של מדיום מותנה, התאים היו בתרבית של 100% בינוני בתרבית במשך 10 ימים רצופים, משתנים מדיום כל יום. כדי לקבוע את ההשפעה של גורמי גדילה רקומביננטיים, תאים היו בתרבית על ידי הוספת הכמות המתאימה של גורמי גדילה בכל יום במשך 3 ימים רצופים. שים לב כי תאים שאינם transfected נזרעו ב 3,000 תאים לבאר כדי למנוע גידול יתר במהלך זמן התרבות הארוך יותר בהשוואה לתאים transfected. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

4. ניתוח של רמת עקה חמצונית ויכולת נוגדת חמצון

1. גלוטתיון אסאי
   1. מדוד את רמות גלוטתיון (GSH) באמצעות הערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, להכין ונפח מתאים של תערובת ריאגנט 1x (100 μL ריאגנט / טוב): לוציפרין-NT מצע גלוטתיון S-Transferase מדולל 1:100 במאגר התגובה.
      הערה: צלחת 96-well דורש 10 מ"ל של 1x תערובת ריאגנט, אשר מוכן על ידי הוספת 100 μL של מצע לוציפרין-NT ו 100 μL של גלוטתיון S-Transferase ל 10 מ"ל של חוצץ תגובה. הכן את תערובת ריאגנט 1x מיד לפני השימוש. אין לאחסן תערובת ריאגנט מוכנה לשימוש עתידי.
   2. הכן את ריאגנט זיהוי לוציפרין על ידי העברת בקבוק אחד של חוצץ שחזור לריגנט זיהוי לוציפרין ליופילי.
   3. הכן עקומה סטנדרטית באמצעות פתרון סטנדרטי גלוטתיון (GSH) (5 מ"מ). לדלל 5 mM פתרון GSH 1:100 עם dH₂O (להוסיף 10 μL של פתרון GSH 5 mM ל 990 μL של dH₂O). בצע 7 דילול טורי 1:1 ב 500 μL של dH₂O. העבר 10 μL של כל תקן מדולל לבאר מתאימה כפול.
      הערה: הריכוז הסופי של גלוטתיון ינוע בין 0.039 מיקרומטר ל 5 מיקרומטר.
   4. הכן את ריק (1x תערובת ריאגנט) ולהעביר 10 μL (כפילויות) לבארות המתאימות.
   5. הסר את H₂O₂תאים שטופלו מן האינקובטור.
      הערה: תעד את המורפולוגיה של התאים H₂O₂שטופלו על ידי מיקרוסקופיה Brightfield (40x).
      כאשר התאים מחומצנים, הם נראים מעוגלים יותר ופחות מפוזרים.
   6. שאפו בזהירות את המדיום התרבותי. הוסיפו 100 מיקרו-אל של תערובת ריאגנט 1x מוכנה לכל באר. מערבבים את התאים עם ריאגנט עבור 15 s ב 500 סל"ד על שייקר מסלולית.
   7. לדגור על הצלחת ב RT במשך 30 דקות. הוסף 100 μL של ריאגנט זיהוי לוציפרין מחדש לכל באר.
   8. מערבבים את התמיסה ל-15 s ב-500 סל"ד בשייקר מסלולי. לדגור על הצלחת במשך 15 דקות ב RT.
   9. קבע את ההארה באמצעות קורא לוחות באמצעות תוכנית מותקנת מראש ADP-Glo.
      הערה: שים את הצלחת בתוך קורא הלוחות ללא המכסה.
      1. לחץ על שינוי פריסה ובחר את ההגדרות הבאות בפרמטרים בסיסיים: צלחת Costar 96-well; אופטיקה עליונה; השהיית מיקום: 0.1; שעת התחלה של מדידה: 0.0; זמן מרווח מדידה: 1.0; זמן לנרמל את התוצאות: 0.0; הרווח מותאם באופן אוטומטי על-ידי ההתקן. הגדר ריקים, תקנים ודוגמאות. לחץ על התחל מדידה.
      2. יצא את הנתונים כקובץ Excel. חשב את הריכוז של GSH בכל מדגם על ידי אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית.
2. ציטוקסיה וניתוח מיקרוסקופי
   1. שאפו את המדיום מהתאים והוסיפו 100 μL של מדיום מלא המכיל 1% FBS לכל באר. תחזיר את התאים לאינקובטור.
      הערה: 1% FBS משמש מכיוון שאחוזים גבוהים יותר של FBS יכולים להפריע למדידת הערך, ולכן נעשה שימוש ב- 1% FBS במקרה זה.
   2. מדוד את הכדאיות של התא באמצעות ערכת ה- Assay של ציטוקסיה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, להכין את תערובת ריאגנט הוספת חוצץ אסאי למצע ליופילי. הכן את ריאגנט ליסיס על ידי הוספת 33 μL Digitonin למאגר 5 מ"ל אסאי (עבור צלחת אחת 96-well). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להבטיח הומוגניות.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש בתערובת ריאגנט טרייה. יש להשתמש בתוך 12 שעות אם מאוחסן ב- RT. תערובת ריאגנט ניתן לאחסן ב 4 °C (7 ימים) וניתן לאחסן אותו ב aliquots לשימוש יחיד עד 4 חודשים ב -70 °C (70 °F). יש להימנע מהקפאה והפשרה. ליסיס ריאגנט ניתן לאחסן ב 4 °C (7 ימים).
   3. הכן עקומה סטנדרטית עם תאי ARPE-19 לא מטופלים.
      1. Trypsinize התאים כמתואר בשלבים 1.1.3-1.1.5 של הפרוטוקול ולספור את התאים באמצעות תא Neubauer^34,35. צנטריפוגות התאים ב 120 גרם במשך 10 דקות ב RT. לשאוף supernatant ול resuspend גלולה התא במדיום F12 של DMEM / Ham המכיל 1% FBS לריכוז סופי של 1 x 10⁵ תאים / מ"ל.
      2. הכן 7 דילול טורי 1:1 ב 200 μL בינוני המכיל 1% FBS. העבר 100 μL של כל תקן לבארות המתאימות (כפילויות). מוסיפים 50 μL של תערובת ריאגנט לכל בארות.
   4. מערבבים את התאים עם ריאגנט עבור 15 s ב 500 סל"ד על שייקר מסלולית. לדגור על הצלחת במשך 15 דקות ב RT. למדוד את אור באמצעות קורא הלוחות כמתואר בשלב 4.1.9 של הפרוטוקול. מוסיפים 50 μL של ריאגנט תמוגה ודגרה במשך 15 דקות. מדוד את אור ההשתנות באמצעות קורא הלוחות כמתואר בשלב 4.1.9 של הפרוטוקול.
   5. חשב את אחוז התאים בני קיימא: (100 - % תאים מתים) ואת אחוז התאים המתים = [מדידת אור 1 ((תאים מתים במדגם))/ מדידת אור שנייה (כל התאים מתים לאחר טיפול דיגיטונין)] x 100.
3. ניתוח ביטוי UCP2 על-ידי RT-qPCR
   1. Trypsinize תאים transfected כמתואר לעיל (שלבים 1.1.3-1.1.5 של הפרוטוקול).
   2. לספור את התאים באמצעות תא Neubauer^34,35.
   3. זרע 5,000 תאי ARPE-19 מודבקים / באר בלוחות 96-well.
   4. לאחר 24 שעות של תרבית, לטפל בתאים עם 350 μM H₂O₂ עבור 24 שעות.
   5. בודד את ה- RNA הכולל באמצעות ערכה מסחרית לבידוד RNA ממספר נמוך של תאים (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראת היצרן.
   6. בצע PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR) כמתואר בחומר משלים. בקצרה, ליצור cDNA על ידי retrotranscription באמצעות תערובת זמינה מסחרית המכיל M-MLV הפוך Transcriptase ממוטב (ראה טבלת חומרים).
   7. עבור qPCR, השתמש בקוקטייל תגובה מוכן לשימוש המכיל את כל הרכיבים (כולל SYBR Green) למעט פריימרים (ראה טבלה S1 של חומר משלים)ותבנית DNA. השתמש בתנאי thermocycling הבאים: denaturation הראשוני ב 95 °C (75 °F) במשך 10 דקות, 40 מחזורים עם denaturation ב 95 °C (75 °F) עבור 15 °C (60 °F) עבור 30 °C ,והארכות ב 72 °C (72 °F) עבור 32 מעלות צלזיוס.
   8. השתמש בשיטת 2^(-ΔΔCT) לניתוח³⁶.
4. הכנת lysate תא עבור SDS-PAGE ו- WB ניתוח של pAkt (Ser473)
   1. זרע 3 x 10⁵ GM-CSF-transfected ARPE-19 תאים / באר בלוחות 6-בארות (≥21 ימים לאחר transfection) כדי לקבוע אם GM-CSF מגן על תאי RPE מפני נזק על ידי H₂O₂ באמצעות הפעלת מסלול ההישרדות Akt¹⁵.
   2. לאחר 24 שעות של תאי תרבות נחשפים 350 μM H₂O₂ עבור 24 שעות.
   3. לערבב 1 מ"ל של חיץ RIPA עם 10 μL של קוקטייל מעכבי פוספטאז פרוטאז, 10 μL של 0.5 M EDTA, ו 25 μL של 8 M אוריאה (כרכים המשמשים באר אחת).
   4. שאפו בזהירות בינוני ולשטוף את התאים עם 1x PBS.
   5. הוסף את כל אמצעי האחסון של תערובת מאגר RIPA לתאים.
   6. פיפטה למעלה ולמטה.
   7. לאסוף את lysate בצינורות 1.5 מ"ל.
   8. צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
   9. העבר את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל.
   10. לקבוע את רמות pAkt ב 15 μL של lysate תא לא דולל על ידי WB כמתואר בחומר משלים.

תוצאות

אינדוקציה של עקה חמצונית בתאי אפיתל פיגמנט הרשתית האנושית
ARPE-19 ותאי hRPE ראשוניים טופלו בריכוזים משתנים של H₂O₂ למשך 24 שעות והרמה התארית של גלוטתיון נוגד חמצון כמתה (איור 2A,B). H₂O₂ ב 50 μM ו 100 μM לא השפיע על ייצור גלוטתיו...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מציע גישה לנתח את הפונקציה נוגד חמצונית ומגנה של PEDF ו- GM-CSF המיוצר על ידי תאים transfected, אשר ניתן להחיל על תאים transfected עם כל גן מועיל putative. באסטרטגיות טיפוליות גנטיות שמטרתן להעביר חלבונים לרקמה על ידי השתלת תאים מהונדסים גנטית, חשוב לקבל מידע על רמת ביטוי החלבון, תוחלת החיי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning	353047
6-well plates	Greiner	7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom	Costar	3610	Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates	Corning	353072
Acrylamid 40%	Biorad	161-0144
Amphotericin B	AMIMED	4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF	ThermoFisher Scientific	PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM	Agilent	P0260
Antibody anti-PEDF	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-390172
Antibody anti-penta-His	Qiagen	34660
Antibody anti-phospho-Akt	Cell Signaling Technology	9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP	Abcam	ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488	ThermoFisher Scientific	A-11029
ARPE-19 cell line	ATCC	CRL-2302
BSA	Sigma-Aldrich	A9418-500G
chamber culture glass slides	Corning	354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Duo Set ELISA kit	R&D Systems	DY215-05
EDTA	ThermoFisher Scientific	78440
ELISAquant kit	BioProducts MD	PED613-10-Human
Eyes (human)	Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS	Brunschwig	P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0)	GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay	Promega	V6912
hydrogen peroxide (H2O2)	Merck	107209
ImageJ software (image processing program)	W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol	Axonlab	A1378.0010
Leica DMI4000B microscope	Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II	Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software	Roche Molecular Systems
NaCl	Sigma-Aldrich	71376-1000
NaH2PO4	Axonlab	3468.1000
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Ni-NTA superflow	Qiagen	30410
Nitrocellulose	VWR	732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System	Aplegen Life Science
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix	Quantabio	95072-012
PFA	Sigma-Aldrich	158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Primers	Invitrogen		See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51304
recombinant hGM-CSF	Peprotech	100-11
recombinant hPEDF	BioProductsMD	004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System	Promega	Z6011
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase-free DNase Set	QIAGEN	79254
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74204
SDS	Applichem	A2572
Semi-dry transfer system for WB	Bio-Rad
SuperMix qScript	Quantabio	95048-025
Tris-buffered saline (TBS)	ThermoFisher Scientific	15504020
Triton X-100	AppliChem	A4975
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
Tween	AppliChem	A1390
Urea	ThermoFisher Scientific	29700
WesternBright ECL HRP substrate	Advansta	K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane	Chemie Brunschwig	MNSC04530301