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Resumo

Apresentamos um protocolo para o desenvolvimento e uso de um modelo de estresse oxidativo, tratando células epiteliais de pigmento da retina com H2O2, analisando morfologia celular, viabilidade, densidade, glutationa e nível UCP-2. É um modelo útil para investigar o efeito antioxidante de proteínas secretadas por células transfeminadas transposon para tratar a degeneração neuroretinal.

Resumo

O estresse oxidativo desempenha um papel crítico em várias doenças degenerativas, incluindo a degeneração macular relacionada à idade (AMD), uma patologia que afeta ~30 milhões de pacientes em todo o mundo. Leva a uma diminuição no epitélio do pigmento da retina (RPE)-fatores neuroprotetores sintetizados, por exemplo, fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e fator estimulante da colônia granutócito-macrófago (GM-CSF), seguido pela perda de células RPE, e eventualmente fotorreceptor e morte de células gânglios de retina (RGC). Temos a hipótese de que a reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE transfecidas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular. Usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB100X)as células RPE humanas foram transfectadas com os genes PEDF e GM-CSF e mostraram integração genética estável, expressão genética de longo prazo e secreção de proteínas usando qPCR, mancha ocidental, ELISA e imunofluorescência. Para confirmar a funcionalidade e a potência do PEDF e gm-CSF secretados pelas células RPE transfeinadas, desenvolvemos um ensaio in vitro para quantificar a redução do estresse oxidativo induzido por H2O2em células RPE na cultura. A proteção celular foi avaliada pela análise da morfologia celular, densidade, nível intracelular de glutationa, expressão genética UCP2 e viabilidade celular. Ambas as células RPE transfectadas que expressam o FPE e/ou GM-CSF e as células não transfetizadas, mas pré-tratadas com PEDF e/ou GM-CSF (comercialmente disponíveis ou purificadas de células transfetizadas) apresentaram proteção celular antioxidante significativa em comparação com controles não tratados. O atual modelo H2O2é uma abordagem simples e eficaz para avaliar o efeito antioxidante de fatores que podem ser eficazes para tratar a AMD ou doenças neurodegenerativas similares.

Introdução

O modelo descrito aqui, oferece uma abordagem útil para avaliar a eficiência dos agentes biofarmacêuticos para reduzir o estresse oxidativo nas células. Utilizamos o modelo para investigar os efeitos protetores do PEDF e do GM-CSF no estresse oxidativo mediado H2O2nas células epiteliais do pigmento retinal, que estão expostas a altos níveis de O2, luz visível, e a fagocitose das membranas do segmento externo fotoreceptor, gerando níveis significativos de espécies reativas de oxigênio (ROS)1, 2. São considerados um dos principais contribuintes para a patogênese da degeneração macular avascular relacionada à idade (aAMD)3,4,5,6,7,8. Além disso, há uma diminuição nos fatores neuroprotetores sintetizados por RPE, especificamente o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF), fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs) e fator estimulante da colônia-colônia granucyte (GM-CSF) levando à disfunção e perda de células RPE, seguidos pela morte de células fotorreceptoras e gânglios da retina (RGC)3,4,5 . A AMD é uma doença complexa que resulta da interação entre fatores metabólicos, funcionais, genéticos e ambientais4. A falta de tratamentos para a AAMD é a principal causa de cegueira em pacientes com mais de 60 anos de idade em países industrializados9,10. A reconstituição do ambiente neuroprotetor e neurogênico da retina pelo transplante subretinal de células RPE geneticamente modificadas que superexpressam PEDF e GM-CSF tem o potencial de prevenir a degeneração da retina, mitigando os efeitos do estresse oxidativo, inibindo inflamação e apoiando a sobrevivência celular11,12,13,14,15,16 . Embora existam várias metodologias para entregar genes às células, escolhemos o sistema transposon da Bela Adormecida hiperativo não viral para entregar os genes PEDF e GM-CSF às células RPE por causa de seu perfil de segurança, a integração dos genes no genoma das células hospedeiras e sua propensão a integrar os genes entregues em locais não transcricionalmente, como mostramos anteriormente17, 18,19.

O estresse oxidativo celular pode ser induzido em células cultivadas in vitro por vários agentes oxidativos, incluindo peróxido de hidrogênio (H2O2),4-hidroynonenal (HNE), tertbutylhydroperoxide (tBH), altas tensões de oxigênio e luz visível (espectro completo ou irradiação UV)20,21. Altas tensões de oxigênio e luz requerem equipamentos e condições especiais, o que limita a transferência para outros sistemas. Agentes como H2O2,HNE e tBH induzem alterações moleculares e celulares por estresse oxidativo. Escolhemos H2O2 para testar a atividade antioxidante do PEDF e GM-CSF porque é conveniente e biologicamente relevante, pois é produzido por células RPE como um intermediário de oxigênio reativo durante a fagocitose do segmento externo fotoreceptor22 e é encontrado em tecidos oculares in vivo23. Como a oxidação da glutationa pode ser parcialmente responsável pela produção de H2O2 no olho, analisamos os níveis de GSH/glutationa em nossos estudos, que estão ligados ao estresse oxidativo induzido por H2O2e à capacidade regenerativa das células21,22. A análise dos níveis de glutationa é especialmente relevante, pois participa dos mecanismos de proteção antioxidantes no olho24. A exposição a H2O2 é utilizada com frequência como modelo para examinar a suscetibilidade ao estresse oxidativo e a atividade antioxidante das células RPE1,25,26,27,28,29,30, e, além disso, apresenta semelhanças com danos oxidativos induzidos pela luz, fonte "fisiológica" de estresse oxidativo21.

Para avaliar a funcionalidade e a eficácia dos fatores neuroprotetores, desenvolvemos um modelo in vitro que permite que a análise quantifique o efeito antioxidante dos fatores de crescimento expressos por células geneticamente modificadas para superexpressar o PEDF e o GM-CSF. Aqui, mostramos que as células RPE transfeminadas com os genes para PEDF e GM-CSF são mais resistentes aos efeitos nocivos de H2O2 do que são células de controle não transfectadas, como evidenciado pela morfologia celular, densidade, viabilidade, nível intracelular de glutationa e expressão do gene UCP2, que codifica a proteína mitocondrial de desacoplamento 2 que tem sido demonstrada para reduzir espécies reativas de oxigênio (ROS)31.

Protocolo

Os procedimentos de coleta e uso de olhos humanos foram aprovados pela Comissão de Ética Cantonnal de Pesquisa (nº 2016-01726).

1. Condições de isolamento celular e cultura

  1. Linha celular HUMANA ARPE-19
    1. Cultura 5 x 105 células ARPE-19, uma linha celular RPE humana, na mistura de médio/nutrientes da Águia Modificada de Dulbecco F-12 Ham (DMEM/Ham's F-12) suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina U/mL de 80 U/mL, Estreptomicina de 80 μg/mL, e 2,5 μg/mL de anfotericina B (meio completo) a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar em um frasco T75 (para outras densidades ver tabela 1).
    2. Troque o meio três vezes por semana.
    3. Uma vez que as células são cultivadas para aproximadamente 90% de confluência (avaliada qualitativamente), aspirar o meio e lavar as células com 1x PBS estérei.
    4. Incubar as células com uma solução EDTA de 5% de Trypsin-2% para 7-10 min a 37 °C (para volumes ver Tabela 1). Monitore o desprendimento visualmente.
    5. Pare de tentarpsinização adicionando meio completo contendo 10% de FBS (para volumes ver Tabela 1).
    6. Transfeito as células (ver etapa 2. do protocolo), subsulo as células a uma razão de 1:10 (uma vez por semana), ou sementes em uma placa de 96 poços como detalhado abaixo (ver etapas 3.3 e 3.4 do protocolo).
Médio (mL)
Área (cm²)Densidade de semeadura para células ARPE-19 (células/bem)AplicaçãoPara a cultura celularPara parar a trippsinaVolume de trippsina (mL)
Frasco T75755,00,000Crescimento celular ARPE-191073
6 Placa de poço9.61,00,000Semeadura de células ARPE-19 transfeinadas310.5
24 Placa de poço250,000Semeadura de células hRPE transfectadas10.80.2
96 Placa de poço0.325.000 para experimentos de estresse oxidativo com células transfeinadas (Fig. 1)Experimentos de estresse oxidativo0.2
3.000 para experimentos de estresse oxidativo com células não transfectadas mais proteínas (Fig. 1)

Tabela 1: Volumes de cultura celular. Volumes de mídia recomendados para placas de cultura celular e frascos para a cultura de células ARPE-19 e RPE humanos primários.

  1. Células RPE humanas primárias
    1. Isole as células RPE humanas primárias, como descrito por Thumann et al.17, e as células de cultura em meio completo suplementadas com 20% de FBS.
    2. Troque o meio duas vezes por semana. Uma vez que as células atinjam a confluência (monitorada visualmente), reduza a FBS para 1% para evitar o crescimento excessivo.
    3. Transfeito as células (ver passo 2 do protocolo), ou semente em uma placa de 96 poços como detalhado abaixo (ver etapas 3.3 e 3.4 do protocolo).
      NOTA: Os dados aqui apresentados foram coletados a partir da cultura das células RPE obtidas a partir dos olhos de quatro doadores humanos. A Tabela 2 detalha a demografia dos doadores do Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Os olhos foram enucleados 12,7 ± 5,7 h (média ± SD) após a obtenção de consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque.
NãoidadeGêneromorte à preservação (horas)morte ao isolamentocultivocultivoSímbolo em gráfico
(dias)antes da transfecção (dias)após a transfecção (dias)
280M20.7814036figure-protocol-5011
386F12.888545figure-protocol-5217
486F8.5526133figure-protocol-5423
883F8.961827figure-protocol-5628
significar83.812.76.867.360.3
SD2.95.71.557.049.1

Tabela 2: Demografia dos doadores humanos para células epiteliais de pigmento retiniano.

2. Eletroporação de células ARPE-19 e RPE humanas primárias

  1. Trippsinize células ARPE-19 ou células RPE humanas primárias, conforme descrito nas etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo.
  2. Realizar eletroporação com o kit de transfecção comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
    1. Para transfecção de células ARPE-19 consulte Johnen et al.32 e para hRPE primário para Thumann et al.17. Resumidamente, resuspend 1 x 105 células ARPE-19 ou 5 x 104 células primárias hRPE em 11 μL de tampão R e adicionar 2 μL de mistura plasmida contendo 0,03 0μg pSB100X transposase33 e 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His ou pT2-CMV-GMCSF-Seu transposon (razão transposase:transposon 1:16). Para células transfetícias duplas PEDF e GM-CSF, utilize uma razão de 1:16:16 (0,03 μg pSB100X, 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His, e 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Utilize os seguintes parâmetros de eletroporação: dois pulsos de 1.350 V para 20 ms (largura de pulso) para células ARPE-19; dois pulsos de 1.100 V para 20 ms para células primárias.
  3. Seed 1 x 105 ARPE-19 ou 5 x 104 células hRPE transfectadas em placas de 6-well e 24-well, respectivamente, em médio suplementado com 10% de FBS sem antibióticos ou antimióticos. Adicione penicilina (80 U/mL), estreptomicina (80 μg/mL) e anfotericina B (2,5 μg/mL) com a primeira troca média 3 dias após a transfecção.
  4. Determinar o crescimento celular por monitoramento microscópico semanal das células. A eficiência da transfecção é monitorada pela análise da expressão genética por RT-PCR, e secreção de proteínas por ELISA e WB (métodos explicados em Material Suplementar).
    NOTA: A eficiência da transfecção pode ser avaliada pela primeira vez quando as células atingirem a confluência, ou seja, em ~7 dias e 4 semanas de pós-transfecção para células ARPE-19 e células hRPE primárias, respectivamente.
  5. Células de sementes em uma placa de 96 poços como detalhadas abaixo (ver o passo 3.5 do protocolo).

3. Indução de estresse oxidativo (tratamento H2O2) e neuroproteção (tratamento PEDF e/ou GM-CSF)

  1. Preparação do meio condicionado de células ARPE-19 transfectadas
    1. Use células ARPE-19 transfeinadas com os genes PEDF, GM-CSF ou ambas (ver o passo 2 do protocolo); células de cultura por 28 dias como descrito na etapa 1.1 do protocolo.
    2. Aos 28 dias após a transfecção, células de trypsinize (ver passos 1.1.3-1.1.5 do protocolo), contam células usando uma câmara neubauer34,35, e sementes 5 x 105 células em frascos T75 em meio completo, conforme descrito na etapa 1.1.1 do protocolo. Troque o meio quando a cultura celular estiver aproximadamente 80% confluente (aproximadamente após 1 semana; verificada qualitativamente). Colete o meio depois das 24h.
    3. Armazene o meio a -20 °C até usar.
      NOTA: A concentração suficiente do PEDF recombinante e do GM-CSF no meio condicionado foi verificada pela WB e quantificada por ELISA conforme descrito em Material Suplementar.
  2. Purificação de PEDF e GM-CSF a partir de meio condicionado de células ARPE-19 transfectadas
    1. Centrifugar o meio coletado da etapa 3.1.2 a 10.000 x g para 15 min a 4 °C.
    2. Use o superfluxo Ni-NTA (ver Tabela de Materiais) de acordo com os protocolos do fabricante para purificar proteínas marcadas por Sua, conforme descrito abaixo.
      1. Pipeta 30 μL de mistura Ni-NTA em um tubo de 1,5 mL e centrífuga a 2.600 x g para 30 s e descartar o fluxo-through. Lave a pelota duas vezes com 200 μL de tampão de incubação de 1x.
      2. Centrifugar a 2.600 x g para 30 s e descartar o fluxo. Adicione 40 μL de tampão de incubação 4x e resuspend.
      3. Adicione 900 μL de meio condicionado centrifusado e incubar a 70 rpm (agitador orbital) por 1 h na RT. Centrífuga a 2.600 x g por 1 min e o fluxo de descarte.
      4. Lave a pelota duas vezes com 175 μL de tampão de incubação de 1x. Centrifugar a 2.600 x g para 30 s e descartar o fluxo.
      5. Para eluto Suas proteínas PEDF e GM-CSF, adicione 20 μL de tampão de elução e incubar a 70 rpm (agitador orbital) por 20 min na RT. Centrífuga a 2.600 x g por 30 s. Mantenha o supernatante contendo PEDF recombinante ou GM-CSF.
    3. Quantifique a proteína total utilizando o kit de ensaio de proteína BCA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Armazene a solução de proteína a -20 °C até usar.
      NOTA: O buffer de incubação (4x) contém 200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl e 40 mM Imidazol; O buffer de elução contém 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl e 250 mM Imidazol.
  3. Tratamento de células ARPE-19/hRPE não transfectadas com meio condicionado mais H2O2 (Figura1A)
    1. Semente 3.000 células ARPE-19 não transfectadas (a partir da etapa 1.1.6 do protocolo) ou hRPE primário (a partir da etapa 1.2.3 do protocolo) células por poço em placa e cultura de 96 poços em 200 μL de meio condicionado de células ARPE-19 transfectadas.
    2. Cultura as células por 10 dias a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Mude o meio condicionado todos os dias. Exponha as células a 350 μM H2O2 por 24 h.
    3. Avalie os danos oxidativos do estresse e determine o efeito antioxidante do PEDF e do GM-CSF por quantificação dos níveis de glutationa (ver etapa 4.1 do protocolo), microscopia (ver etapa 4.2 do protocolo) e ensaio de citotoxicidade (ver etapa 4.2 do protocolo).
      NOTA: A duração do experimento é de 12 dias. Placas de microwell de fundo plano claro são usadas para avaliar a luminescência, bem como a morfologia celular. Para realizar simultaneamente o ensaio de citotoxicidade e glutationa, duas placas devem ser semeadas com células no mesmo dia.
  4. Tratamento de células ARPE-19/hRPE não transfectadas com fatores de crescimento PEDF e GM-CSF mais H2O2 (Figura 1B)
    1. Semente 3.000 células ARPE-19 não transfectadas (a partir da etapa 1.1.6 do protocolo) ou hRPE primário (a partir da etapa 1.2.3 do protocolo) células por poço (placas de 96 poços com fundo plano claro) em 200 μL de cultura completa contendo PEDF recombinante de 500 ng/mL e/ou 50 ng/mL recombinantes GM-CSF, purificados a partir do meio de células ARPE-19 transfectadas ou comercialmente disponíveis. Células de cultura para 48 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Renove diariamente os fatores de crescimento do PEDF e do GM-CSF.
      NOTA: Adicione os fatores de crescimento frescos ao meio.
    2. Após 48h de tratamento das células com os fatores de crescimento, remova o meio médio e adicione o meio completo contendo 350 μM H2O2 mais 500 ng/mL PEDF e/ou 50 ng/mL GM-CSF.
    3. Avalie os danos oxidativos do estresse e determine o efeito antioxidante do PEDF e do GM-CSF por quantificação dos níveis de glutationa (ver etapa 4.1 do protocolo), microscopia (ver etapa 4.2 do protocolo) e ensaio de citotoxicidade (ver etapa 4.2 do protocolo).
      NOTA: A duração do experimento é de 3 dias.
  5. Tratamento de células ARPE-19/hRPE primárias transfeinadas com H2O2 (Figura 1C)
    1. Verifique a expressão genética suficiente e a secreção proteica das células transfeinadas por WB e ELISA, conforme descrito no Material Suplementar.
    2. Remova o meio dos poços que contêm as células transfeinadas (ver o passo 2 do protocolo).
    3. Células de trypsinize, conforme descrito nas etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo. Conte as células usando uma câmara de Neubauer34,35.
    4. Semente 5.000 células transfectadas/bem em placa de 96 poços em 200 μL de meio completo. Células de cultura por 24 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar. Após 24 horas, exponha as células a 350 μM H2O2 por 24 h.
    5. Avalie os danos oxidativos do estresse e determine o efeito antioxidante do PEDF e gm-CSF por quantificação dos níveis de glutationa (ver etapa 4.1 do protocolo), microscopia (ver etapa 4.2 do protocolo), ensaio de citotoxicidade (ver etapa 4.2 do protocolo) e determinação da expressão genética UCP2 (ver etapa 4.3 do protocolo).
      NOTA: A duração do experimento é de 2 dias.

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Figura 1: Cronogramas do ensaio H2O2 nas três diferentes abordagens experimentais. 3.000 células não transfectadas tratadas com as proteínas médias/recombinantes condicionadas ou 5.000 células transfeinadas foram semeadas em 96 placas de poço para tratamento com H2O2. Para determinar o efeito do meio condicionado, as células foram cultivadas em meio 100% cultivado por 10 dias consecutivos, mudando de meio a cada dia. Para determinar o efeito dos fatores de crescimento recombinantes, as células foram cultivadas adicionando a quantidade adequada de fatores de crescimento todos os dias por 3 dias consecutivos. Observe que as células não transfectadas foram semeadas a 3.000 células por poço para evitar o crescimento excessivo durante a maior duração da cultura em comparação com as células transfeinadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise do nível de estresse oxidativo e capacidade antioxidante

  1. Ensaio de glutationa
    1. Meça os níveis de Glutationa (GSH) utilizando o kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, prepare e desemuente o volume da mistura de reagente 1x (100 reagente/bem): substrato de luciferina-NT e Glutathione S-Transferase diluídos 1:100 no Buffer de Reação.
      NOTA: Uma placa de 96 poços requer 10 mL de mistura de reagente 1x, que é preparada adicionando 100 μL de substrato luciferina-NT e 100 μL de Glutathione S-Transferase a 10 mL de tampão de reação. Prepare a mistura de reagente 1x imediatamente antes de usar. Não armazene o mix de Reagente preparado para uso futuro.
    2. Prepare o Reagente de Detecção de Luciferina transferindo uma garrafa de tampão de reconstituição para o Reagente de Detecção de Lúciferina liofilizada.
    3. Prepare uma curva padrão usando uma solução padrão glutathione (GSH) (5 mM). Diluir solução GSH de 5 mM 1:100 com dH2O (adicione 10 μL de solução GSH de 5 mM a 990 μL de dH2O). Realize 7 diluição serial 1:1 em 500 μL de dH2O. Transfira 10 μL de cada padrão diluído para um poço apropriado em duplicata.
      NOTA: A concentração final de glutationa varia de 0,039 μM a 5 μM.
    4. Prepare o branco (mistura de reagente 1x) e transfira 10 μL (duplicatas) para os poços apropriados.
    5. Remova as células tratadas H2O2da incubadora.
      NOTA: Documente a morfologia das células tratadas H2O2por microscopia de campo brilhante (40x).
      Quando as células são oxidadas, elas parecem mais arredondadas e menos espalhadas.
    6. Aspire cuidadosamente o meio de cultura. Adicione 100 μL de mistura de reagente 1x preparada a cada poço. Misture as células com o reagente por 15 s a 500 rpm em um agitador orbital.
    7. Incubar a placa em RT por 30 minutos. Adicione 100 μL de reagente de detecção de lúciferina reconstituído a cada poço.
    8. Misture a solução por 15 s a 500 rpm em um agitador orbital. Incubar a placa por 15 min na RT.
    9. Determine a luminescência usando um leitor de placas usando um programa pré-instalado ADP-Glo.
      NOTA: Coloque a placa dentro do leitor de placas sem a tampa.
      1. Clique em Alterar layout e escolha as seguintes configurações em Parâmetros Básicos: Placa costar de 96 poços; alta óptica; atraso de posicionamento: 0.1; tempo de início da medição: 0.0; tempo de intervalo de medição: 1.0; tempo para normalizar os resultados: 0.0; o ganho é ajustado automaticamente pelo dispositivo. Defina espaços em branco, padrões e amostras. Clique em Iniciar a medição.
      2. Exporte os dados como um arquivo Excel. Calcule a concentração de GSH em cada amostra por interpolação da curva padrão.
  2. Ensaio de citotoxicidade e análise microscópica
    1. Aspire o meio das células e adicione 100 μL de meio completo contendo 1% de FBS a cada poço. Devolva as células para a incubadora.
      NOTA: 1% de FBS é utilizado porque percentuais mais elevados de FBS podem interferir na medição da luminescência, portanto 1% de FBS é utilizado neste caso.
    2. Medir a viabilidade celular usando o kit de ensaio de citotoxicidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, prepare a mistura reagente adicionando o tampão de ensaio ao substrato liofilizado. Prepare o Reagente de Lysis adicionando 33 μL Digitonin a 5 mL Assay buffer (para uma placa de 96 poços). Misture bem por pipetting para cima e para baixo para garantir a homogeneidade.
      NOTA: Para obter resultados ótimos, use a mistura de reagente recém-preparada. Use em até 12 horas se armazenado no RT. A mistura de reagente pode ser armazenada a 4 °C por até 7 dias e pode ser armazenada em alíquotas de uso único por até 4 meses a -70 °C. O congelamento e o descongelamento devem ser evitados. O Reagente de Lise pode ser armazenado a 4 °C por até 7 dias.
    3. Prepare uma curva padrão com células ARPE-19 não tratadas.
      1. Trypsinize as células conforme descrito nas etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo e conte as células usando uma câmara de Neubauer34,35. Centrifugar as células a 120 g por 10 min na RT. Aspire o supernasce e resuspenha a pelota celular no meio F12 do DMEM/Ham contendo 1% de FBS a uma concentração final de 1 x 105 células/mL.
      2. Prepare 7 diluições de série 1:1 em 200 μL médio contendo 1% de FBS. Transfira 100 μL de cada padrão para os poços apropriados (duplicatas). Adicione 50 μL de mistura de reagente a todos os poços.
    4. Misture as células com o reagente por 15 s a 500 rpm em um agitador orbital. Incubar a placa por 15 min na RT. Medir a luminescência usando o leitor de placas conforme descrito na etapa 4.1.9 do protocolo. Adicione 50 μL do reagente de lise e incubar por 15 min. Medir a luminescência usando o leitor de placas conforme descrito na etapa 4.1.9 do protocolo.
    5. Calcule a porcentagem de células viáveis: (100 - % células mortas) e a porcentagem de células mortas = [1ª medição de luminescência ((células mortas na amostra)) / 2ª medida de luminescência (todas as células mortas após o tratamento de digitonina)] x 100.
  3. Análise de expressão UCP2 por RT-qPCR
    1. Tripular células transfetí infectadas conforme descrito acima (etapas 1.1.3-1.1.5 do protocolo).
    2. Conte as células usando uma câmara de Neubauer34,35.
    3. Sementes 5.000 células ARPE-19 transfectadas/bem em placas de 96 poços.
    4. Após 24 horas de cultura, trate as células com 350 μM H2O2 por 24 h.
    5. Isole o RNA total usando um kit comercial para isolamento do RNA de baixo número de células (ver Tabela de Materiais) seguindo a instrução do fabricante.
    6. Executar PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) conforme descrito em Material Suplementar. Brevemente, gere cDNA por retrotrancriação usando um mix comercialmente disponível contendo uma Transcriptase Reversa M-MLV otimizada (ver Tabela de Materiais).
    7. Para qPCR, utilize um coquetel de reação pronto para uso contendo todos os componentes (incluindo O Verde SYBR), exceto primers (ver Tabela S1 de Material Suplementar) e modelo de DNA. Use as seguintes condições de termociclismo: denaturação inicial a 95 °C para 10 min, 40 ciclos com denaturação a 95 °C para 15 s, ressarcimento a 60 °C para 30 s e alongamento a 72 °C para 32 s.
    8. Use o método 2^(-ΔΔCT) para análise36.
  4. Preparação de lise celular para análise de SDS-PAGE e WB de pAkt (Ser473)
    1. Seed 3 x 105 GM-CSF-transfectdam arpe-19 células/poço em placas de 6 poços (≥21 dias após transfecção) para determinar se o GM-CSF protege as células RPE contra danos por H2O2 através da ativação da via de sobrevivência Akt15.
    2. Após 24 h de células culturais são expostas a 350 μM H2O2 por 24 h.
    3. Misture 1 mL de tampão RIPA com 10 μL de coquetel inibidor de fosfatase protease, 10 μL de 0,5 M EDTA e 25 μL de 8 M de ureia (volumes usados para um poço).
    4. Aspire cuidadosamente o meio e lave as células com 1x PBS.
    5. Adicione todo o volume da mistura de buffer RIPA às células.
    6. Pipeta para cima e para baixo.
    7. Colete o lysate em tubos de 1,5 mL.
    8. Centrifugar a 20.000 x g por 30 min a 4 °C.
    9. Transfira o supernatante para um novo tubo de 1,5 mL.
    10. Determine os níveis de pAkt em 15 μL de lise celular não diluída por WB, conforme descrito em Material Suplementar.

Resultados

Indução do estresse oxidativo nas células epiteliais do pigmento da retina humana
As células ARPE-19 e hRPE primária foram tratadas com concentrações variadas de H2O2 por 24 h e o nível intracelular da glutationa antioxidante foi quantificado(Figura 2A,B). H2O2 a 50 μM e 100 μM não afetaram a produção de glutationa, enquanto em 350 μM houve uma diminuição signific...

Discussão

O protocolo aqui apresentado oferece uma abordagem para analisar a função antioxidante e protetora do PEDF e GM-CSF produzido por células transfeinadas, que podem ser aplicadas a células transfeinadas com qualquer gene benéfico putativo. Em estratégias terapêuticas genéticas que têm o objetivo de fornecer proteínas ao tecido por meio do transplante de células geneticamente modificadas, é fundamental obter informações quanto ao nível de expressão proteica, à longevidade da expressão e à eficácia da pro...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Gregg Sealy e Alain Conti pela excelente assistência técnica e prof. Zsuzsanna Izsvák do Centro Max-Delbrück em Berlim por fornecer gentilmente os plasmídeos pSB100X e pT2-CAGGS-Venus. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências suíça e pela Comissão Europeia no contexto do Sétimo Programa-Quadro. Z.I foi financiado pelo European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesCorning353047
6-well platesGreiner7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom Costar3610Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well platesCorning 353072
Acrylamid 40%Biorad161-0144
Amphotericin BAMIMED4-05F00-H
Antibody anti-GMCSFThermoFisher ScientificPA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM AgilentP0260
Antibody anti-PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
Antibody anti-penta-His Qiagen34660
Antibody anti-phospho-AktCell Signaling Technology9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRPAbcamab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488ThermoFisher ScientificA-11029
ARPE-19 cell lineATCCCRL-2302
BSA Sigma-AldrichA9418-500G
chamber culture glass slidesCorning354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay PromegaG9291
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
DMEM/Ham`s F12 Sigma-AldrichD8062
Duo Set ELISA kitR&D Systems DY215-05
EDTAThermoFisher Scientific78440
ELISAquant kitBioProducts MDPED613-10-Human
Eyes (human)Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS BrunschwigP40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting MediumSigma-AldrichF4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0)GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione AssayPromegaV6912
hydrogen peroxide (H2O2)Merck107209
ImageJ software (image processing program)W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol AxonlabA1378.0010
Leica DMI4000B microscope Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 softwareRoche Molecular Systems
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
Neon Transfection System ThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System 10 µL KitThermoFisher ScientificMPK1096
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Ni-NTA superflow Qiagen30410
Nitrocellulose VWR732-3197
Omega Lum G Gel Imaging SystemAplegen Life Science
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23227
Primers Invitrogen See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51304
recombinant hGM-CSF Peprotech100-11
recombinant hPEDF  BioProductsMD004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep SystemPromegaZ6011
RIPA bufferThermoFisher Scientific89901
RNase-free DNase SetQIAGEN79254
RNeasy Mini KitQIAGEN74204
SDSApplichemA2572
Semi-dry transfer system for WB Bio-Rad
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
Tris-buffered saline (TBS) ThermoFisher Scientific15504020
Triton X-100AppliChemA4975
Trypsin/EDTASigma-AldrichT4174
TweenAppliChem A1390
UreaThermoFisher Scientific29700
WesternBright ECL HRP substrateAdvanstaK-12045-D50
Whatman nitrocellulose membraneChemie BrunschwigMNSC04530301

Referências

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