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요약

우리는 H 2O2로망막 색소 상피 세포를 치료하여 세포 형태, 생존가능성, 밀도, 글루타티온 및 UCP-2 수준의 개발 및 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 신경망 변성을 치료하기 위해 트랜스포슨-감염된 세포에 의해 분비되는 단백질의 항산화 효과를 조사하는 데 유용한 모델이다.

초록

산화 스트레스는 전 세계적으로 3천만 명의 환자에게 영향을 미치는 병리학인 노화 관련 황반 변성(AMD)을 포함한 여러 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 망막 색소 상피(RPE)-합성 신경보호인자, 예를 들어, 안료 상피 유래 인자(PEDF) 및 과립세포-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF)의 감소로 이어지며, 결국 광수용체 및 망막 갱셀(RGC)의 손실로 이어진다. 우리는 PEDF와 GM-CSF를 과발현하는 과발뇌형 RPE 세포의 감속 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성이 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하며 세포 생존을 지원함으로써 망막 변성을 예방할 수 있는 잠재력을 가지고 있다고 가설합니다. 수면미트랜스포손 시스템(SB100X)을이용하여 인간 RPE 세포는 PEDF 및 GM-CSF 유전자에 감염되어 qPCR, 서부 블롯, ELISA 및 면역불률을 이용한 안정적인 유전자 통합, 장기 유전자 발현 및 단백질 분비를 보였다. 전감염된 RPE 세포에 의해 분비된 PEDF 및 GM-CSF의 기능성 및 효능을 확인하기 위해, 배양시 RPE 세포에 대한H2O2-유도산화 스트레스의 감소를 정량화하기 위한 시험관 내 분석서를 개발하였다. 세포 보호는 세포 형태학, 밀도, 글루타티온의 세포 내 수준, UCP2 유전자 발현 및 세포 생존가능성을 분석하여 평가하였다. 둘 다, PEDF 및/또는 GM-CSF 및 세포를 과도하게 발현하는 전감염된 RPE 세포는 비감염되었지만 PEDF 및/또는 GM-CSF(소판 또는 전감염된 세포로부터 정수)로 전처리된 비처리 대조군과 비교하여 상당한 항산화 세포 보호를 보였다. 본H2O2-모델은AMD 또는 이와 유사한 신경퇴행성 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있는 요인의 항산화 효과를 평가하는 간단하고 효과적인 접근법이다.

서문

여기에 설명된 모델은 세포의 산화 스트레스를 줄이기 위한 바이오 의약품 제제의 효율성을 평가하는 유용한 접근법을 제공합니다. 우리는 H2O2-매개산화 용 안료 상피 세포에 대한 PEDF 및 GM-CSF의 보호 효과를 조사하기 위해 모델을 사용했으며, 이는 높은 수준의 O2에노출되며, 가시광선, 광수용체 외부 세그먼트 멤브레인의 phagocytosis를 통해 반응성 산소 종(ROS)1, 1, 1, 1 2. 그(것)들은 혈관 나이 관련 황반 변성의 병인에 중요한 기여자로 간주됩니다 (aAMD)3,4,5,6,7,8. 게다가, RPE 합성 신경 보호 인자, 특히 안료 상피 유래 인자 (PEDF), 인슐린 과같은 성장 인자 (IGFs), 및 과립구 대식세포 -콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 RPE 세포의 기능 장애 및 손실로 이어지는후, 광수용체 및 망막 갱셀(R) 세포3,4GC세포(RGC) . AMD는 대사, 기능성, 유전적 및 환경적 요인4사이의 상호 작용에서 발생하는 복잡한 질환이다. aAMD에 대한 치료의 부족은 선진국9,10에서60 세 이상의 환자에서 실명의 주요 원인입니다. PEDF및 GM-CSF를 과도하게 발현하는 유전자 변형 RPE 세포의 피하 이식에 의한 신경보호 및 신경성 망막 환경의 재구성은 산화 스트레스의 효과를 완화하고 염증을 억제하고 세포생존11,12,13, 14,14, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15, 15,15,1 . 세포에 유전자를 전달하는 몇 가지 방법론이 있지만, 우리는 그 안전 프로필, 숙주 세포의 게놈에 유전자의 통합, 그리고 우리가이전에보여 준 바와 같이 비 전사 활성 사이트에 전달 된 유전자를 통합하는 성향 때문에 RPE 세포에 PEDF 및 GM-CSF 유전자를 제공하기 위해 비 바이러스 성 활동적인 수면 뷰티 트랜스포슨 시스템을선택했습니다. 18,19.

세포 산화 스트레스는 과산화수소(H2O2),4-하이드로이네날(HNE), 테르부틸하이드로산화물(tBH), 높은 산소 장력, 가시광선(전체 스펙트럼 또는 UV 조사)20,21을포함한 여러 산화제에 의해 시험관내에서 배양되는 세포에서 유도될 수 있다. 높은 산소 장력과 빛은 다른 시스템으로의 전송 가능성을 제한하는 특수 장비 와 조건이 필요합니다. H2O2,HNE 및 tBH와 같은 제제는 겹치는 산화 스트레스 분자 및 세포 변화를 유도한다. 우리는 포토수용체 외부 세그먼트 phagocytosis(22)에서 반응성 산소 중간체로서 RPE 세포에 의해 생성되기 때문에 편리하고 생물학적으로 관련성이 있기 때문에 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 활성을테스트하기 위해 H2O2를 선택했으며 생체내안구 조직에서 발견된다. 글루타티온의 산화는 눈에 H2O2의 생산에 부분적으로 책임이 있을 수 있기 때문에, 우리는 H2 O2-유도산화스트레스및세포의 재생 능력에 연결되는 우리의 연구에서 GSH/글루타티온의 수준을 분석하였다21,22. 글루타티온 수준의 분석은 눈24의산화 방지 메커니즘에 참여하기 때문에 특히 관련이 있다. H2O2에노출되는 것은 RPE 세포의 산화 스트레스 감수성 및 항산화활성을검사하기 위한 모델로 자주 사용되며, 또한, 광유발 산화 스트레스 손상, 산화 스트레스21의"생리적" 원인과 유사성을 나타낸다.

신경 보호 요인의 기능성과 효과를 평가하기 위해, 우리는 분석이 PEDF와 GM-CSF를 과발현하기 위하여 유전자 변형된 세포에 의해 표현된 성장 인자의 산화 효과를 정량화하는 분석을 허용하는 시험관 내 모형을 개발했습니다. 여기서, 우리는 PEDF및 GM-CSF에 대한 유전자와 함께 전염된 RPE 세포가 세포 형태, 밀도, 생존성, 글루타티온의 세포내 수준 및 UCP2 유전자의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 비과감염 대조구 세포보다 H2O2의 유해한 영향에 더 저항력이 있음을 보여주며, 이는 미토콘드리아 분리 단백질(ROS31)에 대한 코드로 인해31종의산소를 감소시키는 것으로 나타났다.

프로토콜

인간의 눈의 수집 및 사용에 대한 절차는 연구를위한 주 윤리위원회에 의해 승인되었다 (아니. 2016-01726).

1. 세포 격리 및 배양 조건

  1. 인간 ARPE-19 세포주
    1. 문화 5 x 105 ARPE-19 세포, 인간 RPE 세포주, 덜벡코의 수정 된 독수리의 중간 / 영양 혼합물 F-12 햄 (DMEM / 햄의 F-12)은 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 80 U / mL 페니실린, 80 U / mL 페니실린으로 보충 80 μg/mL 연쇄상 구균, 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B(전체 매체)에서 37°C에서 T75 플라스크에서 5% CO2 및 95%의 공기가 가습된 대기시(다른 세포 밀도는 표 1참조).
    2. 일주일에 세 번 매체를 변경합니다.
    3. 일단 세포가 약 90%의 합류(질적으로 평가됨)로 성장하면, 배지를 흡기하고 멸균 1x PBS로 세포를 세척한다.
    4. 37°C에서 7-10분 동안 5% 트립신-2% EDTA 용액으로 세포를 배양한다(볼륨의 경우 표 1참조). 분리를 시각적으로 모니터링합니다.
    5. 10% FBS를 포함하는 완전한 매체를 추가하여 트립시닝을 중지합니다(볼륨의 경우 표 1참조).
    6. 세포를 트랜스펙트(프로토콜의 단계 2. 참조), 1:10(주당 1회) 비율로 세포를 서브배양하거나 아래에 자세히 설명된 96웰 플레이트의 종자(프로토콜의 단계 3.3 및 3.4를 참조).
중간(mL)
면적(cm²)ARPE-19 세포에 대한 파종 밀도(세포/웰)신청세포 배양용트립신을 중지하려면트립신의 부피 (mL)
플라스크 T75755,00,000ARPE-19 세포 성장1073
6 웰 플레이트9.61,00,000감염된 ARPE-19 세포의 파종310.5
24 웰 플레이트250,000전감염된 hRPE 세포의 파종10.80.2
96 웰 플레이트0.325,000 전염 된 세포를 가진 산화 스트레스 실험에 대 한 (도 1)산화 스트레스 실험0.2
3,000 비 전염 된 세포 플러스 단백질을 가진 산화 스트레스 실험에 대 한 (도 1)

표 1: 세포 배양물. ARPE-19 및 1차 인간 RPE 세포의 배양을 위한 세포 배양 판 및 플라스크에 대한 권장되는 미디어 볼륨.

  1. 1차 인간 RPE 세포
    1. Thumann 외17에의해 기술된 바와 같이 1차 인간 RPE 세포를 분리하고, 20% FBS로 보충된 완전한 배지에서 배양 세포를 분리한다.
    2. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 세포가 수렴성에 도달하면(시각적으로 모니터링됨) FBS를 1%로 줄여 과성장을 방지합니다.
    3. 셀을 변형 (프로토콜의 단계 2 참조), 또는 아래에 자세히 설명된 대로 96 웰 플레이트에서 종자 (프로토콜의 단계 3.3 및 3.4 참조).
      참고: 여기에 제시된 데이터는 4명의 인간 기증자의 눈에서 얻은 RPE 세포의 배양에서 수집되었습니다. 표 2는 시력 눈 은행 (세인트 폴, MN)의 라이온스 선물에서 기증자의 인구 통계를 자세히 설명합니다. 헬싱키 선언에 따라 통보된 동의를 얻은 후 12.7± 5.7h(평균 ± SD) 사후 평가에서 눈이 흘러내렸다.
아니요연령성별보존에 죽음 (시간)고립으로 의 죽음경작경작그래프의 기호
(일)일시 전(일)전환 후(일)
280M20.7814036figure-protocol-3495
386F12.888545figure-protocol-3701
486F8.5526133figure-protocol-3907
883F8.961827figure-protocol-4112
의미하다83.812.76.867.360.3
SD2.95.71.557.049.1

표 2: 망막 색소 상피 세포를 위한 인간 기증자의 인구 통계.

2. ARPE-19 및 1 차 인간 RPE 세포의 전기화

  1. 시험분석 ARPE-19 세포 또는 프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5에 설명된 바와 같이 1차 인간 RPE 세포.
  2. 시판되는 트랜스페션 키트(재료표참조)로 전기포공을 수행합니다.
    1. ARPE-19 세포의 형질전환은 Johnen외. 32 및 Thumann 외17에대한 1 차 hRPE를 지칭한다. 간략하게, R 버퍼의 11 μL에 1 x 105 ARPE-19 세포 또는 5 x 104 1차 hRPE 세포를 다시 중단하고 0.03 μg pSB100을 포함하는 플라스미드 혼합물 2 μL을 추가합니다 X 트랜스포세아제33 및 0.47 μg pT2-CMV-PEDF-그의 또는 pT2-CMV-GMCSF-그의 트랜스포슨 (비반포세:트랜스포슨 1:16). PEDF 및 GM-CSF 이중 전형 전지의 경우 1:16:16(0.03 μg pSB100X,0.47 μg pT2-CMV-PEDF-HIS, 0.47 μg pT2-CMV-GMCSF-His)의 비율을 사용한다. 다음과 같은 전기기 파라미터를 사용하십시오: ARPE-19 세포에 대해 20ms(펄스 폭)에 대해 1,350V의 두 펄스; 1 차 세포에 대 한 20 ms에 대 한 1,100 V의 두 펄스.
  3. 종자 1 x105 전속 ARPE-19 또는 5 x 104 6-well 및 24-well 플레이트에 각각 1차 hRPE 세포를 감염시켰으며, 항생제 나 항마이코틱스없이 10 % FBS로 보충된 중간 체. 페니실린(80 U/mL), 연쇄상 구균(80 μg/mL), 암포테리신 B(2.5 μg/mL)를 첫 번째 중간 교환3일 후에 추가한다.
  4. 세포의 주간 현미경 모니터링에 의해 세포 성장을 결정합니다. 트랜스포션 효율은 RT-PCR에 의한 유전자 발현 의 분석에 의해 모니터링되며, ELISA 및 WB에 의한 단백질 분비(보충 물질에서설명된 방법).
    참고: 세포가 합류에 도달하면 최초로 경질 효율을 평가할 수 있다, 즉 ARPE-19 세포 및 1차 hRPE 세포에 대한 ~7일 및 4주 후 형질 전환에서 각각.
  5. 아래에 자세히 설명된 대로 96웰 플레이트의 종자 세포(프로토콜의 3.5단계 참조).

3. 산화 스트레스 유도 (H2O2 치료) 및 신경 보호 (PEDF 및 / 또는 GM-CSF 치료)

  1. 감염된 ARPE-19 세포의 조건된 배지 의 준비
    1. 유전자 PEDF, GM-CSF 또는 둘 다와 함께 전관된 ARPE-19 세포를 사용하십시오(프로토콜의 2단계 참조); 프로토콜의 단계 1.1에 기재된 바와 같이 28일 동안 배양 세포.
    2. 28일 에서, 트립시화 세포(프로토콜의 단계 1.1.3-1.5 참조), Neubauer 챔버 를 사용하여 세포를 카운트34,35,및 T75 플라스크에서 종자 5 x 105 세포는 프로토콜의 1.1.1 단계에서 설명된 바와 같이 완전한 매체로 한다. 세포 배양이 약 80% 컨실수(약 1주일 후, 질적으로 검증됨)이 있을 때 배지를 교환한다. 24 시간 후에 매체를 수집합니다.
    3. 사용 전까지 -20°C에 매체를 저장합니다.
      참고: 조건화된 배지에서 재조합 PEDF 및 GM-CSF의 충분한 농도는 WB에 의해 검증되고 보충 물질에설명된 바와 같이 ELISA에 의해 정량화되었다.
  2. 감염된 ARPE-19 세포의 조건된 배지에서 PEDF 및 GM-CSF의 정화
    1. 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 10,000 x g에서 3.1.2 단계에서 수집된 배지를 수집하였다.
    2. 제조업체의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 슈퍼플로우(재료 표참조)를 사용하여 아래에 설명된 대로 태그가 지정된 단백질을 정화합니다.
      1. 파이펫 30 μL 의 Ni-NTA 혼합물은 1.5mL 튜브와 원심분리기의 2,600 x g에서 30초동안 유동을 폐기한다. 1x 인큐베이션 버퍼의 200 μL로 펠릿을 두 번 씻으십시오.
      2. 30s용 2,600 x g의 원심분리기와 흐름스루를 폐기합니다. 4배 인큐베이션 버퍼의 40 μL을 추가하고 다시 일시 중지합니다.
      3. 원심분리형 배지의 900 μL을 추가하고 70rpm(궤도 셰이커)에서 1시간 동안 RT. 원심분리기에서 1분 동안 2,600 x g로 1회, 폐기된 흐름을 통해 첨가한다.
      4. 1x 인큐베이션 버퍼의 175 μL로 펠릿을 두 번 씻으십시오. 30s용 2,600 x g의 원심분리기와 흐름스루를 폐기합니다.
      5. 그의 태그된 PEDF 및 GM-CSF 단백질을 eute하려면 20 μL의 용출 버퍼를 추가하고 70 rpm(궤도 셰이커)에서 20분 동안 RT. 원심분리기에서 30초동안 2,600xg에 배양합니다. 재조합 PEDF 또는 GM-CSF를 포함하는 상체를 유지합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 BCA 단백질 분석 키트(재료표 참조)를사용하여 총 단백질을 정량화합니다.
    4. 단백질 용액을 -20°C에 보관하십시오.
      참고: 인큐베이션 버퍼(4x)에는 200mM NaH2PO4,1.2M NaCl 및 40mM Imidazol이 포함되어 있습니다. 용출 버퍼는 50mM NaH2PO4,300 mM NaCl 및 250 mM Imidazol을 포함합니다.
  3. 비트랜스감염 ARPE-19/1차 hRPE 세포의 조절 배지 플러스H2O2 (도1A)
    1. 종자 3,000 비-전염성 ARPE-19 (프로토콜의 단계 1.1.6에서) 또는 1 차 hRPE (프로토콜의 단계 1.2.3에서) 세포는 96-잘 플레이트 및 배양에서 잘 200 μL에서 감염된 ARPE-19 세포로부터 조건화 된 배지의.
    2. 5% CO2 및 95% 공기의 가습 된 대기에서 37 °C에서 10 일 동안 세포를 배양한다. 매일 조건된 배지를 변경합니다. 세포를 350 μM H2O2O 2에 24h로 노출시다.
    3. 산화 스트레스 손상을 평가하고 글루타티온 수준의 정량화에 의해 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 결정합니다(프로토콜의 4.1 단계 참조), 현미경 검사법(프로토콜의 4.2단계 참조), 및 세포 독성 분석(프로토콜의 4.2단계 참조).
      참고: 실험 기간은 12일입니다. 명확한 평평한 바닥 마이크로웰 플레이트는 세포 형태뿐만 아니라 발광을 평가하는 데 사용됩니다. 세포 독성과 글루타티온 분석기를 동시에 수행하려면 두 개의 플레이트를 같은 날 세포로 시드해야합니다.
  4. PEDF 및 GM-CSF 성장 인자와 H2O 2 (도 1B)를 가진 비감염 된 ARPE-19/1 차 hRPE 세포의 치료
    1. 종자 3,000 비형 감염 ARPE-19 (프로토콜의 단계 1.1.6에서) 또는 1 차 hRPE (프로토콜의 단계 1.2.3에서) 우물 당 세포 (명확한 평평한 바닥96 웰 플레이트) 200 μL에서 500 ng/mL 재조합 PEDF 및 / 또는 50 ng/mL 재조합 전감염된 ARPE-19 세포의 배지로부터 정제되거나 상업적으로 이용 가능. 배양 세포는 37°C에서 37°C에서 5% CO2 및 95%의 공기의 가습된 대기에 대한 배양 세포. 매일 PEDF 및 GM-CSF 성장 요인을 포함한 매체를 갱신하십시오.
      참고: 성장 인자를 매체에 새로 추가합니다.
    2. 48h의 성장 인자를 가진 세포를 치료한 후, 배지를 제거하고 350 μM H2O2 + 500 ng/mL PEDF 및/또는 50 ng/mL GM-CSF를 포함하는 완전한 배지를 추가한다.
    3. 산화 스트레스 손상을 평가하고 글루타티온 수준의 정량화에 의해 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 결정합니다(프로토콜의 4.1 단계 참조), 현미경 검사법(프로토콜의 4.2단계 참조), 및 세포 독성 분석(프로토콜의 4.2단계 참조).
      참고: 실험 기간은 3일입니다.
  5. H 2 O2(도 1C)를 가진 전이 된 ARPE-19/1차 hRPE 세포의 치료
    1. 보충 물질에 설명된 바와 같이 WB 및 ELISA에 의해 전감염된 세포의 충분한 유전자 발현 및 단백질 분비를 확인한다.
    2. 감염된 세포를 포함하는 우물에서 배지를 제거합니다(프로토콜의 2단계 참조).
    3. 프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5에 설명된 바와 같이 세포를 트립시인화한다. 노이바우어챔버(34),35를사용하여 세포를 계산한다.
    4. 종자 5,000 완전한 매체의 200 μL에서 96 웰 플레이트에 5,000 개의 전동 세포 / 잘. 배양 세포는 37°C에서 37°C에서 5% CO2 및 95%의 공기의 가습된 대기에 대한 배양 세포. 24시간 후, 세포를 350 μM H2O2에 24h로 노출한다.
    5. 글루타티온 수준의 정량화에 의해 PEDF 및 GM-CSF의 항산화 효과를 평가하고(프로토콜의 4.1 단계 참조), 현미경 검사법(프로토콜의 4.2단계 참조), 세포 독성 분석(프로토콜의 4.2단계 참조), UCP2 유전자 발현의 결정(프로토콜의 4.3단계 참조).
      참고: 실험 기간은 2일입니다.

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그림 1: 세 가지 실험 적 접근 방식에서 H2O2 분석의 타임 라인. 3,000개의 비형감염 세포는 조건부 배지/재조합 단백질 또는 5,000개의 전감염된 세포로 H 2 O2를가진 처리를 위해 96웰 플레이트에서 종자하였다. 조건부 배지의 효과를 결정하기 위해, 세포는 10일 연속 배지100% 배양배지로 배양되어 매일 배지를 변화시켰다. 재조합 성장 인자의 효과를 결정하기 위해 세포는 3일 연속으로 매일 적절한 양의 성장인자를 첨가하여 배양하였다. 비트랜스감염 된 세포는 전균 세포에 비해 더 긴 배양 기간 동안 자라난 것을 피하기 위해 웰 당 3,000 세포에서 시드되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 산화 스트레스 수준 및 항산화 용량 분석

  1. 글루타티온 분석
    1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트(재료 표참조)를 사용하여 글루타티온(GSH) 수준을 측정합니다. 간략하게, 준비 및 1x 시약 믹스의 적절한 부피 (100 μL 시약 / 잘): 루시페린 NT 기판 과 글루타티온 S-Transferase 희석 1:100 반응 버퍼.
      참고: 96웰 플레이트는 10mL의 1x 시약 믹스가 필요하며, 루시페린-NT 기판 100 μL과 글루타티온 S-Transferase 100 μL을 10mL의 반응 버퍼에 추가하여 제조합니다. 사용하기 직전에 1x 시약 믹스를 준비합니다. 향후 사용을 위해 준비된 시약 믹스를 보관하지 마십시오.
    2. 리오필링 루시프레린 검출 시약으로 재헌법 버퍼 1병을 이송하여 루시피린 검출 시약을 준비한다.
    3. 글루타티온(GSH) 표준 용액(5mM)을 사용하여 표준 곡선을 준비합니다. dH2O로 5mM GSH 용액 1:100을 희석하십시오(dH2O의990 μL에 5mM GSH 용액의 10 μL을 추가). dH2O. 희석된 각 표준의 10 μL을 복제하여 500 μL에서 7개의 직렬 1:1 희석을 수행합니다.
      참고: 글루타티온의 최종 농도는 0.039 μM에서 5μM까지 다양합니다.
    4. 빈(1x 시약 믹스)을 준비하고 10 μL(중복)을 적절한 우물로 옮기습니다.
    5. 인큐베이터에서 H2O2-처리된 세포를 제거합니다.
      참고: H2O2-처리된세포의 형태는 브라이트필드 현미경검사(40x)에 의해 문서화합니다.
      세포가 산화될 때, 그(것)들은 더 둥글게 하고 더 적은 퍼짐을 보입니다.
    6. 문화 매체를 주의 깊게 흡인합니다. 각 웰에 준비된 1x 시약 믹스100 μL을 추가합니다. 궤도 셰이커에 500 rpm에서 15 s에 대한 시약과 세포를 혼합합니다.
    7. 30 분 동안 RT에서 접시를 배양. 재구성된 루시피린 검출 시약 100μL를 각 웰에 추가합니다.
    8. 궤도 셰이커에 500 rpm에서 15 s용액을 혼합합니다. RT에서 15분 동안 접시를 배양합니다.
    9. 사전 설치된 프로그램 ADP-Glo를 사용하여 플레이트 리더를 사용하여 발광을 결정합니다.
      참고 : 뚜껑없이 플레이트 판독기 안에 접시를 넣습니다.
      1. 레이아웃 변경을 클릭하고 기본 매개 변수에서다음 설정을 선택 : 코스타 96 웰 플레이트; 최고 광학; 위치 처리 지연: 0.1; 측정 시작 시간: 0.0; 측정 간격 시간: 1.0; 결과를 정상화하는 시간: 0.0; 게인은 장치에 의해 자동으로 조정됩니다. 공백, 표준 및 샘플을 정의합니다. 시작 측정을클릭합니다.
      2. 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다. 표준 곡선의 보간을 통해 각 샘플의 GSH 농도를 계산합니다.
  2. 세포 독성 분석 및 현미경 분석
    1. 세포에서 배지를 흡인하고 각 웰에 1% FBS를 포함하는 완전한 배지의 100 μL을 추가합니다. 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
      참고: 1% FBS는 FBS의 높은 비율이 발광의 측정을 방해할 수 있기 때문에 사용됩니다, 따라서 1% FBS는 이 경우에 이용됩니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 세포 독성 분석 키트(재료 표참조)를 사용하여 세포 생존 가능성을 측정합니다. 간단히, 리오필기 기판에 분석 버퍼를 추가하는 시약 믹스를 준비한다. 33 μL 디지토닌을 5mL 분석 버퍼(96웰 플레이트 1개)에 추가하여 리시스 시약을 준비합니다. 균일성을 보장하기 위해 위아래로 파이프를 사용하여 잘 섞습니다.
      참고: 최적의 결과를 얻으려면 갓 준비한 시약 믹스를 사용하십시오. RT. 시약 믹스에 저장하면 12 시간 이내에 사용하면 최대 7 일 동안 4 ° C에 저장 될 수 있으며 -70 ° C에서 최대 4 개월 동안 일회용 알리코트에 저장 될 수 있습니다. 동결 및 해빙은 피해야 합니다. 리시스 시약은 최대 7일 동안 4°C에 보관할 수 있습니다.
    3. 치료되지 않은 ARPE-19 셀로 표준 곡선을 준비합니다.
      1. 프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5 단계에 설명된 바와 같이 세포를 트립시화하고 노이바우어챔버(34,35)를사용하여 세포를 계산한다. RT에서 120g에서 120g의 세포를 원심분리하고 1% FBS를 함유하는 DMEM/Ham의 F12 배지에서 셀 펠릿을 1 x 105 세포/mL의 최종 농도로 재보선합니다.
      2. 1% FBS를 포함하는 200 μL 배지에 7개의 직렬 1:1 희석을 준비합니다. 각 표준의 100 μL을 적절한 우물(중복)으로 옮기습니다. 모든 우물에 시약 믹스 50 μL을 추가합니다.
    4. 궤도 셰이커에 500 rpm에서 15 s에 대한 시약과 세포를 혼합합니다. RT에서 플레이트를 15분 동안 배양한다. 용해 시약의 50 μL을 추가하고 15 분 동안 배양합니다. 프로토콜의 4.1.9 단계에서 설명된 바와 같이 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 측정합니다.
    5. 실행 가능한 세포의 백분율을 계산합니다 : (100 - % 죽은 세포) 및 죽은 세포의 백분율 = [1 차 발광 측정 ((샘플의 죽은 세포)) / 2 차 발광 측정 (digitonin 치료 후 죽은 모든 세포)] x 100.
  3. RT-qPCR에 의한 UCP2 발현 분석
    1. 전술한 바와 같이 감염된 세포를 트립시니화한다(프로토콜의 단계 1.1.3-1.1.5).
    2. 노이바우어챔버(34),35를사용하여 세포를 계산한다.
    3. 종자 5,000 96 웰 플레이트에서 ARPE-19 세포 / 잘 감염.
    4. 배양 24시간 후, 세포를 24시간 동안 350 μM H2O2로 치료한다.
    5. 제조 업체의 지시에 따라 세포의 낮은 수에서 RNA의 절연을 위한 상용 키트를 사용 하 여 총 RNA를 분리 (재료의 표참조) 제조 업체의 지시에 따라.
    6. 보충 재료에설명된 대로 실시간 정량PCR(RT-qPCR)을 수행한다. 간단히, 최적화된 M-MLV 역전사를 포함하는 시판 가능한 혼합을 사용하여 레트로전사에 의해 cDNA를 생성합니다(재료표참조).
    7. qPCR의 경우 프라이머(보충 재료의 표 S1 참조) 및 DNA 템플릿을 제외한 모든 구성 요소(SYBR 그린 포함)가 포함된 즉시 사용 가능한 반응 칵테일을 사용합니다. 다음 열순환 조건을 사용하십시오: 초기 내성 95°C에서 10분 동안, 15초에 95°C에서 40사이클, 60°C에서 32s에 대해 72°C에서 연신.
    8. 분석(36)을위해 2^(-ΔΔCT) 방법을 사용합니다.
  4. SDS-PAGE및 pAkt의 WB 분석을 위한 세포 용액 제제 (Ser473)
    1. 종자 3 x 105 GM-CSF-19 세포/6웰 플레이트(≥21일 사후 트랜스페션)에서 GM-CSF가 Akt 생존경로(15)의활성화를 통해 H2 O2의손상으로부터 RPE 세포를 보호하는지 여부를 판단한다.
    2. 배양 세포의 24시간 후 24h에 대해 350 μM H2O2에 노출된다.
    3. RIPA 버퍼 1mL과 프로테아제 인스파아제 억제제 칵테일 10μL, 0.5M EDTA10 μL, 8M 우레아 25μL(1m 에 사용되는 부피)를 혼합합니다.
    4. 조심스럽게 매체를 흡인하고 1x PBS로 세포를 씻으세요.
    5. RIPA 버퍼 믹스의 전체 볼륨을 셀에 추가합니다.
    6. 파이펫을 위아래로.
    7. 1.5 mL 튜브에서 lysate를 수집합니다.
    8. 4°C에서 30분 동안 20,000 x g의 원심분리기.
    9. 새로운 1.5 mL 튜브로 상체를 전송합니다.
    10. 보충 물질에 설명 된 바와 같이 WB에 의해 희석되지 않은 세포 용액의 15 μL에서 pAkt의 수준을 결정한다.

결과

인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스유도
ARPE-19 및 1차 hRPE 세포는 24시간 동안H2 O2의다양한 농도로 처리되었고 항산화 글루타티온의 세포내 수준을 정량화하였다(도2A,B). H2O2 앳 50 μM 및 100 μM은 글루타티온 생산에 영향을 미치지 않았지만 350 μM에서는 ARPE-19 및 1차 hRPE 세포에서 글?...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 어떤 putative 유익한 유전자로 전염되는 세포에 적용될 수 있는 전감염된 세포에 의해 생성된 PEDF 및 GM-CSF의 산화 및 보호 기능을 분석하는 접근법을 제안합니다. 유전자 변형 세포를 이식하여 조직에 단백질을 전달하는 것을 목표로 하는 유전자 치료 전략에서, 단백질 발현의 수준, 발현의 장수 및 질병의 모델에서 발현 된 단백질의 효과에 대한 정보를 얻는 것이 중요하...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 훌륭한 기술 지원에 대한 그레그 실리와 알레인 콘티와 베를린의 맥스 델브뤼크 센터에서 교수 Zsuzsanna 이즈바크에게 감사하고 싶습니다 pSB100X 및 pT2-CAGGS-비너스 플라스미드를 친절하게 제공합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단과 유럽 위원회가 제7 프레임 워크 프로그램의 맥락에서 지원되었습니다. Z.I는 유럽 연구 위원회, ERC 고급 [ERC-2011-ADG 294742]에 의해 투자되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesCorning353047
6-well platesGreiner7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom Costar3610Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well platesCorning 353072
Acrylamid 40%Biorad161-0144
Amphotericin BAMIMED4-05F00-H
Antibody anti-GMCSFThermoFisher ScientificPA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM AgilentP0260
Antibody anti-PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
Antibody anti-penta-His Qiagen34660
Antibody anti-phospho-AktCell Signaling Technology9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRPAbcamab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488ThermoFisher ScientificA-11029
ARPE-19 cell lineATCCCRL-2302
BSA Sigma-AldrichA9418-500G
chamber culture glass slidesCorning354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay PromegaG9291
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
DMEM/Ham`s F12 Sigma-AldrichD8062
Duo Set ELISA kitR&D Systems DY215-05
EDTAThermoFisher Scientific78440
ELISAquant kitBioProducts MDPED613-10-Human
Eyes (human)Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS BrunschwigP40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting MediumSigma-AldrichF4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0)GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione AssayPromegaV6912
hydrogen peroxide (H2O2)Merck107209
ImageJ software (image processing program)W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol AxonlabA1378.0010
Leica DMI4000B microscope Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 softwareRoche Molecular Systems
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
Neon Transfection System ThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System 10 µL KitThermoFisher ScientificMPK1096
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Ni-NTA superflow Qiagen30410
Nitrocellulose VWR732-3197
Omega Lum G Gel Imaging SystemAplegen Life Science
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23227
Primers Invitrogen See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51304
recombinant hGM-CSF Peprotech100-11
recombinant hPEDF  BioProductsMD004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep SystemPromegaZ6011
RIPA bufferThermoFisher Scientific89901
RNase-free DNase SetQIAGEN79254
RNeasy Mini KitQIAGEN74204
SDSApplichemA2572
Semi-dry transfer system for WB Bio-Rad
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
Tris-buffered saline (TBS) ThermoFisher Scientific15504020
Triton X-100AppliChemA4975
Trypsin/EDTASigma-AldrichT4174
TweenAppliChem A1390
UreaThermoFisher Scientific29700
WesternBright ECL HRP substrateAdvanstaK-12045-D50
Whatman nitrocellulose membraneChemie BrunschwigMNSC04530301

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