Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per lo sviluppo e l'uso di un modello di stress ossidativo trattando le cellule epiteliali pigmentate retiniche con H₂O₂, analizzando la morfologia cellulare, la vitalità, la densità, il glutatione e il livello di UCP-2. È un modello utile per studiare l'effetto antiossidante delle proteine secrete dalle cellule trasfettate con trasposone per trattare la degenerazione neuroretinica.

Abstract

Lo stress ossidativo svolge un ruolo fondamentale in diverse malattie degenerative, tra cui la degenerazione maculare legata all'età (AMD), una patologia che colpisce circa 30 milioni di pazienti in tutto il mondo. Porta ad una diminuzione dei fattori neuroprotettivi sintetizzati dall'epitelio pigmentato retinico (RPE), ad esempio il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), seguiti dalla perdita di cellule RPE e infine dalla morte dei fotorecettori e delle cellule gangliari retiniche (RGC). Ipotizziamo che la ricostituzione dell'ambiente retinico neuroprotettivo e neurogenico mediante trapianto subretinico di cellule RPE trasfettate sovraesprimendo PEDF e GM-CSF abbia il potenziale per prevenire la degenerazione retinica mitigando gli effetti dello stress ossidativo, inibendo l'infiammazione e sostenendo la sopravvivenza cellulare. Utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata nel Bosco(SB100X)le cellule RPE umane sono state trasfettate con i geni PEDF e GM-CSF e hanno mostrato un'integrazione genica stabile, un'espressione genica a lungo termine e una secrezione proteica utilizzando qPCR, western blot, ELISA e immunofluorescenza. Per confermare la funzionalità e la potenza del PEDF e del GM-CSF secreti dalle cellule RPE trasfettate, abbiamo sviluppato un test in vitro per quantificare la riduzione dello stress ossidativo indotto da H₂O₂sulle cellule RPE in coltura. La protezione cellulare è stata valutata analizzando la morfologia cellulare, la densità, il livello intracellulare di glutatione, l'espressione genica UCP2 e la vitalità cellulare. Sia le cellule RPE trasfettate che sovraesprimono PEDF e/o GM-CSF che le cellule non trasfettate ma pretrattate con PEDF e/o GM-CSF (disponibili in commercio o purificate da cellule trasfettate) hanno mostrato una significativa protezione delle cellule antiossidanti rispetto ai controlli non trattati. L'attuale modello H₂O₂è un approccio semplice ed efficace per valutare l'effetto antiossidante di fattori che possono essere efficaci per il trattamento di AMD o malattie neurodegenerative simili.

Introduzione

Il modello qui descritto, offre un approccio utile per valutare l'efficienza degli agenti biofarmaceutici per ridurre lo stress ossidativo nelle cellule. Abbiamo utilizzato il modello per studiare gli effetti protettivi di PEDF e GM-CSF sullo stress ossidativo mediato da H₂O₂sulle cellule epiteliali pigmentate retiniche, che sono esposte ad alti livelli di O₂e luce visibile, e la fagocitosi delle membrane del segmento esterno dei fotorecettori, generando livelli significativi di specie reattive dell'ossigeno (ROS)^{1, 2}. Sono considerati un importante contributo alla patogenesi ....

Protocollo

Le procedure per la raccolta e l'uso degli occhi umani sono state approvate dalla Commissione etica cantonale per la ricerca (n. 2016-01726).

1. Isolamento cellulare e condizioni di coltura

1. Linea cellulare umana ARPE-19
   1. Coltura 5 x 10⁵ cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana, nella miscela media/nutritiva F-12 di Dulbecco Modified Eagle (DMEM/Ham's F-12) integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U/mL di penicillina, 80 μg/mL di streptomicina e 2,5 μg/mL di amfotericina B (mezzo completo) a 37 °C in un'atmosfera umidificata di 5% DI CO₂ e 95% di aria in un matraccio T75 (per altre de....

Risultati

Induzione dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane
ARPE-19 e cellule hRPE primarie sono state trattate con concentrazioni variabili di H₂O₂ per 24 ore ed è stato quantificato il livello intracellulare del glutatione antiossidante (Figura 2A,B). H₂O₂ a 50 μM e 100 μM non ha influenzato la produzione di glutatione, mentre a 350 μM c'è stata u.......

Discussione

Il protocollo qui presentato offre un approccio per analizzare la funzione antiossidante e protettiva di PEDF e GM-CSF prodotti da cellule trasfettate, che possono essere applicate a cellule trasfettate con qualsiasi gene benefico putativo. Nelle strategie terapeutiche geniche che hanno l'obiettivo di fornire proteine ai tessuti trapiantando cellule geneticamente modificate, è fondamentale ottenere informazioni sul livello di espressione proteica, sulla longevità dell'espressione e sull'efficacia della proteina espress.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning	353047
6-well plates	Greiner	7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom	Costar	3610	Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates	Corning	353072
Acrylamid 40%	Biorad	161-0144
Amphotericin B	AMIMED	4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF	ThermoFisher Scientific	PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM	Agilent	P0260
Antibody anti-PEDF	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-390172
Antibody anti-penta-His	Qiagen	34660
Antibody anti-phospho-Akt	Cell Signaling Technology	9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP	Abcam	ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488	ThermoFisher Scientific	A-11029
ARPE-19 cell line	ATCC	CRL-2302
BSA	Sigma-Aldrich	A9418-500G
chamber culture glass slides	Corning	354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Duo Set ELISA kit	R&D Systems	DY215-05
EDTA	ThermoFisher Scientific	78440
ELISAquant kit	BioProducts MD	PED613-10-Human
Eyes (human)	Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS	Brunschwig	P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0)	GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay	Promega	V6912
hydrogen peroxide (H2O2)	Merck	107209
ImageJ software (image processing program)	W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol	Axonlab	A1378.0010
Leica DMI4000B microscope	Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II	Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software	Roche Molecular Systems
NaCl	Sigma-Aldrich	71376-1000
NaH2PO4	Axonlab	3468.1000
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Ni-NTA superflow	Qiagen	30410
Nitrocellulose	VWR	732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System	Aplegen Life Science
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix	Quantabio	95072-012
PFA	Sigma-Aldrich	158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Primers	Invitrogen		See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51304
recombinant hGM-CSF	Peprotech	100-11
recombinant hPEDF	BioProductsMD	004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System	Promega	Z6011
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase-free DNase Set	QIAGEN	79254
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74204
SDS	Applichem	A2572
Semi-dry transfer system for WB	Bio-Rad
SuperMix qScript	Quantabio	95048-025
Tris-buffered saline (TBS)	ThermoFisher Scientific	15504020
Triton X-100	AppliChem	A4975
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
Tween	AppliChem	A1390
Urea	ThermoFisher Scientific	29700
WesternBright ECL HRP substrate	Advansta	K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane	Chemie Brunschwig	MNSC04530301