איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לדמיין דגימות ביולוגיות שנשמרו על ידי קריו באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנו מדגימים את המתודולוגיה על ידי הדמיית הציטוסקלטון של תאי U2OS.

Abstract

מיקרוסקופיית תאורה מובנית תלת מימדית (SIM) מאפשרת הדמיה של מבנים תאיים מתויגים פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה יותר ממיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונבנציונלית. טכניקה זו של רזולוציית-על (SR) מאפשרת הדמיה של תהליכים מולקולריים בתאים שלמים ויש לה פוטנציאל לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה אלקטרונית וטומוגרפיה של קרני רנטגן כדי לתאם מידע מבני ותפקודי. מיקרוסקופ SIM עבור דגימות שהשתמרו קריוגנית (cryoSIM) הוזמן לאחרונה בקו הקרן המתאם להדמיית קריו B24 בסינכרוטרון בבריטניה.

הוא תוכנן במיוחד עבור הדמיה תלת ממדית של דגימות ביולוגיות בטמפרטורות קריוגניות באופן התואם להדמיה עוקבת של אותן דגימות בשיטות מיקרוסקופיה של קרני רנטגן כגון טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות. מאמר וידאו זה מספק שיטות ופרוטוקולים מפורטים להדמיה מוצלחת באמצעות cryoSIM. בנוסף להוראות על פעולת המיקרוסקופ cryoSIM, נכללו המלצות לגבי בחירת דגימות, פלואורופורים והגדרות פרמטר. הפרוטוקול מוצג בדגימות תא U2OS שהמיטוכונדריה והטובולין שלהם תויגו באופן פלואורסצנטי.

Introduction

טכניקות הדמיה SR הפכו נגישות באופן נרחב לביולוגים בעשור האחרון¹. הם מאפשרים הדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות מתויגות פלואורסצנטיות מעבר למגבלת עקיפה. עם זאת, זה כבר מאתגר להתאים שיטות מיקרוסקופיה SR לעבוד עם דגימות בטמפרטורות קריוגניות². זה יהיה יתרון עבור הדמיה מתאם בשילוב עם אלקטרון או טומוגרפיה רנטגן. לאחרונה, SIM הותאם לשימוש עם דגימות קריוגניות והוכח בהצלחה כדי לאפשר מחקרים מתאם של תאים ביולוגיים בשילוב עם טומוגרפיה^{רנטגן רכה} (SXT) 3 בקו הקרן קריו-הדמיה קורלטיבי B24 ב סינכרוטרון מקור אור היהלום (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM יכול להכפיל את הרזולוציה של מיקרוסקופיה רחבת שדה קונבנציונלית על ידי הארת המדגם עם דפוסי אור מפוספסים (שולי Moiré) בשלוש זוויות ובחמשה שלבים. ההפרעה בין דפוסי אור אלה לבין פלואורסצנטיות מדגם ניתן להשתמש כדי לחשוף באופן חישובי מידע נוסף על מבנים תת עקיפה^4,5.

ישנם מספר יתרונות של SIM על פני טכניקות SR אחרות עבור יישומים קריוגניים. ראשית, זה יכול לעבוד ללא פלואורופורים מהבהבים שתוכננו במיוחד; פלואורופורים קונבנציונליים ניתן להשתמש, נותן גישה למגוון רחב יותר של סוכני תיוג פלואורסצנטי פוטנציאלי⁶. בנוסף, הוא דורש רק 15 תמונות לכל פרוסת z (בתלת-ממד; 9 תמונות ל-2D), בעוד ששיטות SR אחרות לוקחות כ-1,000 תמונות לפרוסה, מה שמגדיל את הסיכוי שהדגימה תחומם ולכן מגביר את הסיכון להיווצרות גבישי קרח, מה שעלול לגרום לחפצים. לבסוף, טכניקה זו יכולה לדמיין דגימות ביולוגיות עבות יותר של מעל 10 מיקרומטר, ומאפשרת לתאים שלמים להיקרא במצבם הכמעט ילידי⁶. CryoSIM נבנה באמצעות רכיבים אופטיים סטנדרטיים ועם תוכנה לגישה פתוחה להדמיה, מה שמקל על תיעוד ושכפול אם תרצה⁶. CryoSIM יש 100x/ 0.9 מטרה צמצם מספרי (ראה טבלת החומרים); מידע נוסף על הרכיבים האופטיים, פרמטרי העיצוב והביצועים שלו תואר על ידי פיליפס ואח^{'. 6} הנה, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש במיקרוסקופ cryoSIM כולל כיצד לטעון ולפרוק דגימות בשלב הקריוגני, כיצד לאסוף נתונים על המיקרוסקופ וכיצד לשחזר את תמונות ה- SIM.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה נוגע לדגימות המכילות תאים הגדלים או מופקדים על שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM) 3 מ"מ רשתות זהב שטוחות עם סרט תמיכה בפחמן חורי כי כבר vitrifiedו על ידי הקפאת צלילה או הקפאה בלחץ גבוה. פרוטוקול זה מניח כי דגימות כבר התמונה באמצעות אפיפלואורסצנטיות קונבנציונלית ומיקרוסקופ Brightfield כדי למפות מיקומים של עניין עבור הדמיה cryoSIM. ראה איור 1 לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול כולו.

1. הכנת שלב ההקפאה

1. הכן חנקן נוזלי ללא קרח (LN₂) על ידי העברת LN₂ דרך משפך מרופד בכל מגבוני נייר יבשים מדעיים סטנדרטיים.
   הערה: כמו LN₂ גורם לכוויות, ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות מגן קריו ומשקפי מגן, בעת טיפול בו. נוזלים כאלה עלולים לעקור חמצן ולגרום לחנק מהיר ויש לטפל בהם באזור מאוורר כראוי.
2. הסר אבק פני השטח משלב ההקפאה עם אוויר בלחץ. יש לגרש נוזל ממיכל האוויר בלחץ לפני השימוש בו.
3. ודאו שמחסנית הטעינה לדוגמה נמצאת במקום עם מחזיק הדגימה התאית המתאים (בדקו שלא נותרה רשת במחזיק המדגם מניסוי קודם)(איור 2).
4. הסר את המכסה מן dewar החיצוני של שלב ההקפאה, ויוצקים LN מסונן₂ עד כ 1/4^th מלא. המתן עד שהרתיחה הראשונית תשכך לפני ההשפכה נוספת; מלאו את כלי השיט לכ-2/3. החליפו את המכסה בזהירות, והצביעו על הזרבובית הרחק מהמפעיל ועל הבמה/אופטיקה בעוד LN₂ רותח מהשקע.
5. לאחר LN₂ הפסיק לצאת מהשקע, מניחים את צינור השקע מעל הבמה dewar על הבמה cryo.
6. חבר-התוסף למקור החשמל של הבמה וחבר את כבל ה-USB לשלב ההקפאה. ודא שמכסה תא הדגימה המחומם מחובר לחשמל. חבר את ההמתה החיצונית לשלב.
   הערה: אין לחבר את dewar החיצוני עד צינור השקע כבר ממוקם מעל dewar הבמה על הבמה cryo. אם LN₂ גולש (או כדי למנוע ממנו לעלות על גדותיו), שלף את כבל ה- USB למשך כ- ~ 10 s, אפשר לו להתיישב וחבר מחדש את כבל ה- USB כדי להפעיל מחדש את החיישן.
7. לאחר LN₂ נמסר לתוך dewar הבמה, לחץ על כפתור השחרור על שלב ההקפאה כדי לאפשר LN₂ להיכנס לתא המדגם.
   הערה: אין להשאיר את המערכת ללא השגחה בזמן ש- LN₂ ממלא את החדר.
8. המתן ~ 30-45 דקות כדי לאפשר למערכת להתקרר ולייצב לפני תחילת רכישת התמונה. בדוק מעת לעת את dewar החיצוני, ולמעלה עם LN₂ מסונן אם הוא פחות מרבע מלא (בערך בכל שעה).

2. העברת תיבת האחסון לדוגמה לשלב ההקפאה

הערה: לטבול את תיבת האחסון לדוגמה, המחזיק ואת קצות כל המכשירים (למשל, מלקחיים) בתוך LN_{מסונן 2} כדי לקרר אותם לפני נגיעה כל משטחים קרים כגון המדגם או כל אובייקטים בתוך תא המדגם. ללבוש מעיל מעבדה וכפפות בעת טיפול בדגימות ביולוגיות.

1. ודא שדגימות מנוססות נמצאות במיכל תואם קריו, והבא אותן למיקרוסקופ. לחץ על הכפתור המתאים בשלב ההקפאה כדי להדליק את האור בתא הדגימה.
2. השתמש במקש ההקס בכלי הקלטת כדי לפתוח את שתי הלוחות של קלטת ההעברה לדוגמה. פתח את הלוחות רחבים מספיק כדי להפיל את הרשת בין שני הלוחות, אבל להימנע מפתיחה למיקום הפתוח המרבי כדי למנוע את הרשת נופלת דרך הצד השני.
3. השתמש במלקחיים ארוכים כדי להרים את תיבת הרשת לדוגמה מתוך LN 2 ,_להפוךאותו שבו החרץ מיישר עם המיקום של מיקום האחסון בתוך הבמה, ומניח אותו על הבמה. השתמש בהתקן המתאים (לדוגמה, מברג) כדי לפתוח את מכסה תיבת האחסון למיקום המדגם הנכון.
4. באמצעות מלקחיים הפוכים (או כל מלקחיים כירורגיים עדינים), הסר את רשת TEM ממחזיק המדגם, טבול אותה בתוך LN₂, ושחרר אותה למיקום בקלטת ההעברה לדוגמה, תוך שמירה קרובה ל- LN 2 במהלך_תהליך ההעברה. ודא שהצד של סרט הפחמן ממוקם כך שבסופו של דבר הוא יעמוד מול המטרה על הגשר לדוגמה.
5. סגור את המחסנית לדוגמה באמצעות מקש הכיוה בכלי הקלטת. סגור והסר את תיבת האחסון יחד עם כל הדוגמאות הנותרות.
6. השתמש בנקודת המגנט בכלי הקלטת כדי להרים ולהרכיב את המחסנית המכילה את הרשת על הגשר לדוגמה. שמור אותו שקוע / קרוב LN 2 במהלך_תהליך ההעברה. ודא שהכיוון מתאים לגשר (שני המגנטים ייצרו קשר עם המגנטים על הגשר). מניחים את הקלטת שטוחה בתוך סיכות המיקום של הגשר, ודחוף בעדינות כדי להבטיח שהיא קבועה.
   הערה: קלטת לדוגמה עבור רשתות חתוכות שהוכנו לטחינה ממוקדת של קרן יונים זמינה גם במתקן CryoSIM בקו הקרן B24.

3. עגינה ומיקוד במה

1. הזז את פתח המכסה בשלב ההקפאה לתנוחת ההדמיה, וכבה את אור תא הדגימה. החלק את הבמה לכיוון האופטיקה כדי ליישר אותה מתחת לעדשה האובייקטיבית. שחרר בעדינות את המטרה למיקום באמצעות הידית, והבטח שהיא מונחת בתוך המכסה של שלב ההקפאה, אך אינה נוגעת בה.
   הערה: ודאו שצינור השקע החיצוני של דיואר לא נוגע בהפיכת הבמה בשלב ההקפאה בשום שלב במהלך איסוף הנתונים.
2. מכסים את הבמה ואת האופטיקה עם וילון שחור אטום. הפעל את תוכנת הבקרה תא הטייס במחשב cryoSIM(איור 3 ואיור 4).
3. לחץ על לחצן מצב הקריאה עבור כל מצלמה, והגדר אותו ל- CONV 3 MHz. בדוק כי הטמפרטורה של כל מצלמה היא -80 °C (80 °F), ומאוורר המצלמה כבויה.
4. הפעל את המצלמה המוחקפת. תחת אורות, בחר סביבה (חשיפה 20 ms), ותחת linkam, לחץ על מחזק. לחץ על לחצן מצב וידאו.
5. בחלון תצוגת פסיפס, הקטן את התצוגה (גלילת עכבר) כדי לראות את חלוקה לרמות של הרשת. לחץ על חפש את הבמה אם לא ניתן לראות אותה. מרכז את הרשת על-ידי לחיצה כפולה שמאלה באמצע העיגול.
6. מקד את המדגם עד שסרט התמיכה ברשת (או כל תכונה רלוונטית אחרת) נמצא במוקד, תוך שימוש במקשים למעלה ולמטה כדי להזיז את שלב ההקפאה למעלה ולמטה, ושימוש במקשים 9 ו-3 בלוח המספרי כדי לשנות את שלב z (הגדר אותו ל- 20 מיקרומטר למיקוד ראשוני).
   הערה: אם למשתמש נגמרת הנסיעה ב- z, ניתן להזיז את הבמה באופן ידני למעלה או למטה באמצעות הגלגל מתחת לשלב ההקפאה. סובב אותו במכה אחת בכל פעם, ובדוק אם המדגם נמצא בטווח הראייה. לשנות את הכיוון שוב אם המיקוד מחמיר.

4. רכישת פסיפס ברייטפילד

1. לאחר שהבמה ממורכזת, כבה את מצב הווידאוואסוף פסיפס אור נראה לעין (לחץ על פסיפס Run בתצוגת Mosaic כדי לייצר אריחים של תמונות אור גלויות המתפתלות כלפי חוץ מהמרכז). אם הרשת כפופה, נסה מיקומים שונים ברשת (לחיצה כפולה שמאלה בתצוגת Mosaic), התמקד מחדש ולחץ שוב על הפעל פסיפס כדי לאסוף פסיפסים חלקיים. לחלופין, ירידה בתמונה ממוקדת מעל הפסיפס (איור 3).
2. שמור את התצוגה על ידי לחיצה על שמור פסיפס. תן לו שם קובץ קצר המכיל מידע על תיבת האחסון ומספר הרשת המתאים (חותמת זמן יצורף באופן אוטומטי לשם הקובץ).

5. זיהוי תחומי עניין

1. בדוק את פסיפס brightfield לצד כל תמונות "מפה" פלואורסצנטיות קודמות עבור שבו תאים או תכונות ביולוגיות של עניין היו ממוקמים בעבר. בדוק אם אזורים אלה מייצרים פלואורסצנטיות מתאימה.
   1. כבה את נורית הסביבה ואת המחזק, כמו גם את מצב הווידאו אם הוא פעיל. הפעל את לייזר העירור הנדרש (405, 488, 561 או 647), ובחר את המצלמה והמסנןהמתאימים , בתחילה ב 50 mW, לזמן חשיפה של 50 ms.
      הערה: הגדל/הקטן הגדרות מצלמה וסינון אלה בהתאם לאות הפלואורסצנטיות.
   2. הקש 0 כדי להצמיד תמונה ו- * כדי ליצור ניגודיות אוטומטית. לחלופין, כווננו ידנית את הניגודיות באמצעות המחוון בתחתית התמונה.
      הערה: הדליקו את שלט הלייזר לחדר.
   3. לאחר שנמצאו תאים מעניינים ביולוגית עם פלואורסצנטיות מתאימה, סמנו את מיקומם באמצעות לחצן אתר מארק בתצוגת Mosaic.
      הערה: אתרים מסומנים אלה יופיעו ברשימה המצורפת וניתן לגשת אליהם על-ידי לחיצה כפולה על הקואורדינטות. בעת חזרה לאתר מסומן, הגדל את התצוגה לאזור לפני לחיצה כפולה.
   4. המשך לסמן את כל האתרים הפוטנציאליים לפני תחילת רכישת התמונות. שמור מחדש את הפסיפס עם האתרים המסומנים; לחץ על שמור אתרים בקובץ.
      1. כדי לתפור את תמונות הפסיפס יחד באמצעות תוכנת StitchM (שפותחה בבית ב- beamline B24), גרור ושחרר את קובץ הפסיפס .txt לקובץ StitchM עם .bat סיומת ולשמור את תמונת ה- tiff המשולבת של אריחי הפסיפס באותה תיקיה. לשמירת תמונה עם האתרים המסומנים, גרור ושחרר את קובץ הפסיפס.txt והסמנים.txt את הקובץ לסמל בו-זמנית.
         הערה: איזון איסוף נתונים מול צרכי הפרויקט (לדוגמה, אם ייעשה הדמיה קורלטיבית, בדוק כמה תמונות ניתן לקחת עם מודל ההדמיה של השותף ובחר את המספר המתאים של אתרים להדמיית cryoSIM). בנוסף, אם dewar החיצוני דורש מילוי מחדש עם LN₂ , מערכת קריו-שלב תשנה מיקום, ואתרים מסומנים סביר להניח לא יחזור לאותם מיקומים; לכן שקול זאת בעת בחירת מספר האתרים להתמונה.

6. אסטרטגיית איסוף נתונים

1. הגדר את זמן החשיפה ללייזר בהתבסס על הספירות בטווח הדינמי בתמונת הפלואורסצנטיות (בתחתית חלון התצוגות של המצלמה). בחר איזה מסנן להחיל, ולמטב הגדרות אלה עבור כל אורך גל של אור עירור לשמש, הפעלת כל לייזר בנפרד.
   הערה: למרות שספירות של 10,000-20,000 הן אופטימליות, ספירות נמוכות יותר מקובלות אם יש ניגודיות טובה. באופן אידיאלי, בדוק את הגדרות המסנן לפני שרכישת כל מחסנית תמונה מכיוון שתאים באזורים שונים של הרשת עשויים להיות בעלי רמות פלואורסצנטיות משתנות.

7. איסוף נתונים

1. לחץ על שתי המצלמות כדי להפעיל אותן. חזור לאחד האתרים המסומנים, והתמקד שוב בעומק הרצוי. לאחר התמקדות באזור מעניין, התרחקו מהמוקד כלפי מעלה(↑ מפתח) בחלון XY בשלב המאקרו כדי לבחור את הגובה של מחסנית z לרכישה ולחצו על שמור למעלה. צא מהמוקד כלפי מטה (↓ key), לחץ על שמור למטה ולאחר מכן עבור למרכזובדוק שהתמונה עדיין במוקד.
   הערה: גובה הדגימה יוצג בחלון.
2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על slm (אפנון אור מרחבי) בחלון תא הטייס, וודא שהזווית מוגדרת על 0.41. בחלון תא הטייס, בחר ניסוי של אתר יחיד.
   הערה: אל תלחץ על ה- slm; תא הטייס ידליק אותו באופן אוטומטי במהלך רכישת תמונה.
   1. מהרשימה הנפתחת , בחר תאורה מובנית. שנה את גובה הערימה כך שיהיה שווה לגובה z + 1 מיקרומטר.
      הערה: התוספת של 1 מיקרומטר מבטיחה את לכידת המדגם כולו ב- z וממזערת את חפצי השחזור.
   2. הזן את זמני החשיפה (ms) עבור הלייזרים 405 ננומטר ו- 488 ננומטר בשורה העליונה (עבור המצלמה המשתקפת) ואת זמני החשיפה ללייזרים של 561 ננומטר ו- 647 ננומטר בשורה התחתונה (עבור המצלמה המשודרת).
      הערה: הערכים עבור זמן חשיפה צריכים להתאים לערכים שעליהם הוחלט קודם לכן ומוצגים בחלון הראשי של תא הטייס.
   3. הזן שם קובץ (מוסכמה למתן שמות: תיבה number_grid area_filters_FL) (FL (פלואורסצנטיות) או BF (brightfield) בהתאם לסוג ההדמיה המתבצעת). לחץ על עדכן כדי להפיק קובץ חדש המכיל את התאריך והשעה מבלי לבצע קבצים קודמים. לאחר מכן, לחץ על התחל.
3. בדוק את תצוגת המצלמה בעת איסוף הנתונים. קח מחדש את התמונות אם יש תזוזת xy. אם דג LN₂ dewar ממלא מחדש את שלב ההקפאה במהלך רכישת תמונה, בטל את התהליך על-ידי לחיצה על לחצן ביטול בתוכנת תא הטייס.
   1. לאחר שהערך החיצוני סיים למלא מחדש את פירוק הבמה, חזור על הניסוי מכיוון שהמילוי מחדש מזיז את המדגם אנכית. מקד מחדש את התמונה כדי למרכז אותה מחדש ב-z, ולחזור על הניסוי של אתר יחיד . חזור על הניסוי באתר יחיד עבור כל השילובים של לייזרים ומסננים הדרושים.
      הערה: לוקח בערך 30 s-1 דקות כדי לסיים מילוי מחדש. במהלך ההדמיה של רשת אחת, מילוי מחדש יקרה ~ 4-8x.
4. בכל מיקום, אסוף מחסנית z באמצעות אור גלוי.
   1. כבה את הלייזרים, והפעל את אור הסביבה ואת המרוכז. תחת ניסוי של אתר יחיד, בחר Z-stack, הגדר את נורית הסביבה לחשיפה של 20 ms ושמור על גובה z כנ"ל.
5. חזור על שלבים 7.2 עד 7.4 עבור כל האתרים המסומנים ברשת.
6. לפני המעבר לדוגמה אחרת, מחק את הפסיפס על-ידי לחיצה על מחק אריחים.
   1. צייר ריבוע סביב כל האריחים כדי למחוק אותם. מחק גם את הסמנים על-ידי בחירת כולם ברשימה ולאחר מכן לחיצה על מחק אתרים נבחרים.
7. כבה את נורית הסביבה ואת המעיבות לפני שתמשיך לשנות את הרשת. בצע את השלבים בסעיף 4 כדי לבטל את עגינה של הבמה מתחת למטרה ולשנות את הרשת.

8. לאחר הדמיה

1. לאחר סיום ההדמיה, בטל את עגינה של הבמה והסר את כל הדגימות. כבה את האור של תא הדגימה. נתק את ההפיכת ההקלה החיצונית, וקבע כל LN₂ הנותרים לתוך מיכל אחר תואם קריו, המאפשר dewar לחזור בבטחה לטמפרטורה נורמלית.
2. שים את תקע המכסה על במת ההקפאה. המתינו עד שהאפשרות לאפות את תצוגת קריו-בימת הופכת לזמינה לאחר שלא יישאר יותר LN₂ בהפוגת הבמה. לחץ על כפתור האפייה כדי להיכנס למצב החימום, והסר כל לחות משלב ההקפאה כדי למנוע היווצרות קרח.

9. שחזור

1. העבר קבצי נתוני SIM גולמיים לתחנת העבודה המתאימה לשחזור. הפעל עיבוד בקבוצות דרך החלון בונה משימות עיבוד באמצעות פונקציות העברה אופטיות ספציפיות לערוץ (OTFS) (מחושב מפונקציות פריסה של נקודות חרוזים מרובות פלואורסצנטיות) וזוויות K₀ (0.29278, -1.8028, 2.3786) עם מסנן וינר קבוע עבור כל הערוצים של 0.004 והיסט הטיה של 200.
2. בחלונית 'אפשרויות נוספות', ודאו שעוצמות שליליות נמחקות על-ידי השארת אפשרויות אחרות לא מסומנות. שמור את תמונות SIR בתיקיה בשם "מעובד".
   הערה: תוכנה מסחרית לשחזור SIM מייצרת בדרך כלל נתוני SIM משוחזרים ושומרת על שם הקובץ, אך מוסיפה את SIR.dv בסוף. נוצר גם קובץ יומן רישום המכיל את פרוטוקול העיבוד, השלבים והמידע הסטטיסטי אודות הצלחת השחזור.

10. תיקון משמרת כרומטית

1. הורד את התוכנה Chromagnon 7 כדי^לתקן את השינוי הכרומטי.
2. השתמש במטריצת הייחוס של המשמרת הכרומטית המתאימה לאורכי הגל הפלואורסצנטיים של הנתונים שנאספו (המסופקים על ידי קו הקרן).
   הערה: קובץ ההפניות הוא קובץ 'chromagnon.csv', המכיל את פרמטרי היישור והושגו מתמונות כיול באמצעות חלקיקים פלואורסצנטיים מרובים. ניתן להשתמש בו כדי לעבד אצווה ערכות נתונים מרובות בו-זמנית.
   1. בחר את קובץ ההפניות המתאים התואם לאורכי הגל והמסנן של הלייזר המשמשים להדמיית המדגם והוסף אותו לשדה ההפניה. הוסף את נתוני SIR המשוחזרים כדי להיות מיושרים בשדה המקור ולחץ על הפעל.
   2. בדוק שאות הפלואורסצנטיות מיושר כעת בתמונות. לעיבוד אצווה, מקם את כל תמונות SIR כך שיושדרו בשדה המקור ובקובץ ההפניה בשדה ההפניה והקש הפעל את הכל.

תוצאות

מדגם המכיל תאי U2OS היה מוכתם בתערובת של צבע ציטוסקופי מיקרוטובול ירוק וצבע מיטוכונדריה אדום, וכתוצאה מכך הכתים את רכיב המיקרוטובול של הציטוסקלטון (ירוק) והמיטוכונדריה (אדום). ההדמיה שלאחר מכן הראתה לוקליזציה של המיטוכונדריה בתוך התא, כמו גם את הסידור של microtubules, הדגשת המסגרת המבנית שהם מספקים לתא ואת ההרכבה של ציטוסקלטון סביב אברונים כגון הגרעין. הרזולוציה ב-cryoSIM גבוהה משמעותית מזו שבמיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית סטנדרטית (איור 5). איור 6 מדגים כיצד ניתן להשתמש ב"מפה" הפלואורסצנטית ממיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לאתר אזורי עניין להדמיה ולתמונה המשוחזרת של cryoSIM ממיקום ברשת.

איור 1: תרשים זרימה המציג את שלבי פרוטוקול ההדמיה cryoSIM. קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2:שלב ההקפאה. (B)רשת מדגם המוצגת המוחזקת על-ידי מלקחיים הפוכים. (ג)מרכיבי שלב ההקפאה. יציאות החיבור מסומנות, עם הצבעים המתאימים לכתום: ספק כוח, צהוב: מכסה במה מחומם, כחול: dewar חיצוני, ירוק: חיבור למחשב. קיצורים: מחשב = מחשב אישי; LN₂ = חנקן נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תצוגות של לוחות התוכנה של תא הטייס. (A) החלונית הראשית, (B) תצוגת פסיפס של שלב המאקרו XY (C) (D). קיצור: SLM = אפנון אור מרחבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תצוגות של לוחות התוכנה של תא הטייס. (A) Z מחסנית ניסוי באתר יחיד. (B)ניסוי אתר יחיד SI. (C)קיצורי מקשים עבור תוכנת תא הטייס המשמשת במהלך רכישת תמונה. (D)מיקרוסקופ cryoSIM נמצא באתר ב- B24 ב- Synchrotron מקור אור היהלום. קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: רזולוציית קריו-אסים. (א)מבט פסיפס על רשת הנבדקת. (B)תמונת ברייטפילד של אזור עניין (AOI). (C)תמונת שדה מדומה בהשוואה לתמונת ה- SIM(D)שלה המציגה את העלייה ברזולוציה. החץ הלבן מציין חפצים לשחזור SIM. (E)מפת ניגודיות אפנון המשלבת את מידע עוצמת הפיקסלים של התמונה המשוחזרת עם מידע הצבע של ערכי יחס הניגודיות לרעש (MCNR) של הנתונים הגולמיים שנוצרו על-ידי SIMCheck². האזורים הבהירים והכהים מראים ניגודיות גבוהה ונמוכה, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. הגדרות הדמיית CryoSIM: אורכי גל עירור/פליטה: 488/525 ננומטר, כוח לייזר של 50 מגה-ואט, זמן חשיפה של 50 ms ו-647/655 ננומטר, כוח לייזר של 20 מגה-ואט, זמן חשיפה של 5 מילישניות. קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: שחזור תמונה בקריו-אסים ממיקום על הרשת במפת פלואורסצנטיות ממפת אפיפלואורסצנטיות קונבנציונלית. (A,B)שכבת-על של מפות תמונה של ברייטפילד ופלואורסצנטיות שנוצרו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי. מפה זו משמשת לאיתור אזורים מעניינים לתמונה לאחר מכן ב- cryoSIM. (C)תמונת cryoSIM המשוחזרת המתקבלת במיקום המוצג ב- (B). קיצור: cryoSIM = מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

3D SIM בטמפרטורות קריוגניות יש יתרונות רבים על פני טכניקות הדמיה SR אחרות עבור הדמיה חומר ביולוגי מנוצל. זה דורש באופן משמעותי פחות תמונות לכל פרוסת z בהשוואה לשיטות SR אחרות, וכתוצאה מכך פחות הקרנה וסיכוי נמוך יותר של היווצרות גבישי קרח עבור דגימות מרוסנות. הוא גם מסוגל לדמיין תאים שלמים וניתן לתאם אותו עם טומוגרפיה של קרני רנטגן כדי להתאים את המבנה לתפקוד. מעניין, רוב פלואורופור זמין מסחרית ותגי פלואורסצנטיות להלבין פחות בתנאים קריוגניים מאשר בטמפרטורת החדר. עם זאת, בהתחשב בתשואה הקוונטית הגבוהה של הפלורופורים הנפוצים ביותר בטמפרטורת החדר (יותר מ -80% במקרים מסוימים), הרווח המוחלט שזוהה בפוטונים אינו נובע משינויים בתפוקה הקוונטית, אלא מירידה בתהליכי ההלבנה המורכבים. מידע נוסף על התשואה של פלואורופור בטמפרטורות קריוגניות ניתן למצוא ב ⁸.

זה קריטי כי דגימות המגיעות cryoSIM כבר ממופה מראש באמצעות מיקרוסקופ cryofluorescence קונבנציונאלי עם יכולת brightfield לייצר רשת "מפה" הכוללת הדגשת כל AOIs פוטנציאליים להדמיה נוספת (איור 5). זמן הגישה ב cryoSIM מוקצה באמצעות הליך תחרותי הכולל הגשת הצעה, אשר לאחר מכן מוערך עבור היתכנות טכניקה והשפעה ביו-רפואית. הזמן בציוד, אם כן, הוא תמיד "בפרמיה", ורשתות ממופות מראש מאפשרות את השימוש היעיל ביותר בהקצאה. זה גם חיוני כי המדגם נשמר vitrified, במיוחד במהלך העברת מדגם מבעל המדגם לפלטפורמת ההדמיה, כדי למזער את היווצרות גבישי קרח ונזק מדגם לאחר מכן. המדגם צריך להיות באיכות טובה כדי לייצר את תמונות ה- SIM הטובות ביותר. מדגם מוכן היטב יתאפיין בתכונות הבאות: (א) לא יהיה לה זיהום בגביש קרח, (ב) הרשת המשמשת תהיה רשת איתור, (ג) המוביל יהיה שטוח, (ד) רשת הרשת ומשטח המצע לא יהיו פלואורסצנטיים אוטומטיים, ו- (ה) לא יהיו שברים בקרום התמיכה. תנאים מוקדמים אלה יכולים להיות מושגים על ידי טיפול מדגם זהיר ולהבטיח כי דגימות תמיד להישאר vitrified.

חשוב לבדוק מראש אם פלואורופורים מדגם מוצע ייתן מספיק אות במיקרוסקופ cryoSIM. כלים כגון SPEKCheck⁹ יכולים לסייע בבחירת שילובי הפלורופור והסינון האופטימליים. אם יש בעיות באיסוף הנתונים הגולמיים או בתהליך השחזור, חפצים יכולים להופיע בתמונות לאחר השחזור. דוגמאות לחפצים שונים תועדו על ידי Demmerle et al.¹⁰ ניתן לסקור את הפרמטרים של שחזור התמונה בקובץ יומן הרישום SoftWoRx אם השחזור אינו אופטימלי על ידי פתיחת קובץ סיכום השחזור. צריך להיות מרווח קו עקבי על פני זוויות בערוץ נתון ומשכולת עקבית יחסית. וריאציה של יותר מ-30% וערכים מעל 1 (אם יוחל פיצוי גודל חרוז) צריכה להיחקר מקרוב יותר וסביר להניח שהיא תצביע על שחזורים כושלים. בנוסף, תוכנת SIMcheck² בפיג'י יכולה לשמש גם לביצוע בדיקות שונות על הנתונים הגולמיים והמשוחזרים כדי לאבחן את הגורם לשגיאות בהגדרות פרמטר ההדמיה או השחזור. בדיקת SIM ומפת הניגודיות של האפנון שלה יכולות גם לסייע בהערכת איכות הנתונים המשוחזרים על ידי פרשנות אילו אזורים בתמונה צפויים להיות מבנים אמיתיים לעומת חפצים.

ניגודיות אפנון נמוכה (המוצגת על ידי צבע כהה, באיור 5E) בתוך האזור הגרעיני פירושה שאזור זה יהיה רגיש יותר לשחזור חפצים, ולכן מרמז על כך שניתן לסווג את דפוסי החשיש המוצגים בגרעין (איור 5D) כחפץ. אזורי איתות פלואורסצנטיות חזקים נוטים יותר לשקף במדויק מבנים מקומיים בנתונים המעובדים. באזורים של אות חלש שבו פלואורופורים מופצים על פני אזורים רחבים יותר, כגון פני השטח הכוללים של נצנצים, סביר להניח כי איתות אמיתי מתקיימים עם חפצי עיבוד, ויש לנקוט בפרשנות של נתונים אלה. לאחר בדיקה של הנתונים המשוחזרים לטווח מלא כדי להבטיח שאין ממצאים מוזרים, וכי הרקע הוא בדרך כלל גאוסי ומרוכז קרוב לאפס, הנתונים נחתכים בדרך כלל באפס, או הערך המודאלי - שיא אות הרקע - צריך להיות קרוב מאוד לאפס. פעולה זו מבטיחה שהטווח הדינאמי של התמונה המוצגת לא ישלוט בממצאי רקע שליליים. כאשר אות חלש יותר צפוי, יש לנקוט משנה זהירות בניתוח התכונות ולהבטיח שהם מבנים אמיתיים ולא חפצים שחזור.

ישנן כמה מגבלות של מערכת ההדמיה. מכיוון שהשלב לדוגמה שטוח, דגימות עם עובי משתנה או רשתות שאינן שטוחות אינן נושאים אידיאליים להדמיה. בנוסף, אם הדמיה קורלטיבית תיעשה באמצעות טומוגרפיה רנטגן רכה, אין לדמיין תאים ליד גבולות הרשת מכיוון שאלה לא יהיו גלויים במיקרוסקופ קרני הרנטגן במהלך רכישת סדרת הטיה. לבסוף, כמות הנפיחות של המדגם לפני הקפאת הצלילה יש השפעה משמעותית על איכות ההדמיה; סופג קטן מדי גורם לדגימות עבות מדי, המעניקות תמונות SIM תת-אופטימליות עם רעשי רקע גבוהים, בעוד שיותר מדי כתמים עלולים לגרום לתאים להיות מעוותים ולכן רגישים יותר לנזקי חום מקרן הלייזר של האירוע. לסיכום, cryoSIM הוא כלי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי רב עוצמה להדמיית דגימות ביולוגיות בתלת-ממד בשלב כמעט מקורי ויש לו יישומים רחבים בתחומים רבים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auto grids	FEI
Autogrids	Thermo Fisher Scientific	1036173
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Sigma-Aldrich	SCT142
Cockpit Software	Oxford University		https://github.com/MicronOxford/cockpit
cryo compatible polyurethane container	Jena bioscience	CC-FD-800
Cryo TEM grid storage box	Thermo Fisher Scientific	Model#AutoGrid
cryo-SIM microscope	Custom made	N/A	Custom made, see following reference for the design:  Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.
Cryostage system	Linkam Scientific Instruments	CMS196
Fine tip surgical forceps	Ted Pella	38125
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426
Python Microscope Software	Oxford University		https://www.python-microscope.org/
Scientific dry paper wipes	Kimberly-Clark 7551	2
SIM Reconstruction Software	softWoRx, GE Healthcare	Version  6.5.2
StitchM Software	Diamond Light Source		https://github.com/DiamondLightSource/StitchM
TEM grids for samples	Quantifoil Micro Tools	G200F1