דוגמנות ההשפעות של לחץ המודינמי על תאים סרטניים במחזור באמצעות מזרק ומחט

Summary

כאן אנו מדגימים שיטה להחיל מתח גיסת נוזלים על תאים סרטניים בהשעיה כדי לדגמן את ההשפעות של לחץ המודינמי על תאים סרטניים במחזור.

Abstract

במהלך גרורות, תאים סרטניים מרקמות מוצקות, כולל אפיתליה, מקבלים גישה למחזור הלימפה וההמטוגני שם הם חשופים ללחץ מכני עקב זרימה המודינמית. אחד הלחצים הללו כי תאים סרטניים במחזור (CTCs) ניסיון הוא מתח גיסת נוזלים (FSS). בעוד תאים סרטניים עלולים לחוות רמות נמוכות של FSS בתוך הגידול עקב זרימה ביניים, CTCs נחשפים, ללא התקשרות מטריצה חוץ תאית, לרמות הרבה יותר גבוהות של FSS. מבחינה פיזיולוגית, FSS נע על פני 3-4 סדרי גודל, עם רמות נמוכות הקיימות בלימפטיקה (<1 דיין / ס"מ²) והרמות הגבוהות ביותר המוצגות בקצרה כאשר תאים עוברים דרך הלב וסביב שסתומי הלב (>500 dynes / cm²). ישנם כמה מודלים במבחנה שנועדו לדגמן טווחים שונים של לחץ גיזמה פיזיולוגית על פני מסגרות זמן שונות. מאמר זה מתאר מודל לחקור את ההשלכות של פולסים קצרים (אלפיות השנייה) של FSS ברמה גבוהה על ביולוגיה של תאים סרטניים באמצעות מזרק פשוט ומערכת מחט.

Introduction

גרורות, או התפשטות הסרטן מעבר לאתר הגידול הראשוני, הוא גורם מרכזי בבסיס התמותה מסרטן¹. במהלך גרורות, תאים סרטניים לנצל את מערכת הדם ככביש כדי להפיץ לאתרים רחוקים בכל הגוף^2,3. בעוד בדרך לאתרים אלה, תאים סרטניים במחזור (CTCs) קיימים בתוך microenvironment נוזל דינמי שלא כמו זה של הגידול העיקרי המקורי שלהם^3,4,5. הוצע כי מיקרו-סביבה נוזלית זו היא אחד מחסומים רבים לגרורות⁴. יש הסכמה רחבה במושג של חוסר יעילות גרורתית, כלומר, שרוב CTCs הנכנסים למחזור או לגווע או לא ליצור מושבות גרורתיות^{פרודוקטיביות 6,7,8}. עם זאת, מדוע גרורות אינו יעיל מנקודת המבט של CTC בודדים הוא פחות בטוח ונשאר תחום פעיל של חקירה. CTCs מנותקים מטריצה חוץ תאית, משוללים גורמי גדילה הישרדות מסיסים שעשויים להיות נוכחים בגידול העיקרי, ונחשפו למערכת החיסון ולכוחות המודינמיים באופן שונה בהרבה מאשר בגידול הראשי⁴. כל אחד מהגורמים הללו עשוי לתרום להישרדותם הלקויה של CTCs, אך תרומתם היחסית אינה ברורה. מאמר זה עוסק בשאלה כיצד כוחות המונמיים משפיעים על CTCs.

לימוד ההשפעות של כוחות המודינמיים על CTCs הוא די מאתגר. נכון לעכשיו, אין מערכות במבחנה מהונדסות שיכולות לשכפל את כל הדינמיקה spatiotemporal (לב נימים) ואת המאפיינים הרולוגיים של מערכת כלי הדם האנושית. יתר על כן, האופן שבו CTCs לחוות את מערכת הדם אינו ברור לחלוטין. ראיות ניסיוניות מצביעות על כך שרוב התאים הסרטניים אינם מסתובבים ברציפות כמו תאי דם. במקום זאת, בשל גודלם הגדול יחסית (קוטר 10-20 מיקרומטר), רוב CTCs להיות לכודים במיטות נימיות (6-8 מיקרומטר קוטר) עבור אורכים משתנים של זמן (s עד ימים) שבו הם עלולים למות, extravasate, או להיות עקורים למיטה נימי הבא^8,9,10,11. עם זאת, יש כמה ראיות כי גודל CTC עשוי להיות הטרוגניים יותר ויו, וכי CTCs קטנים יותר ניתנים לזיהוי¹². לכן, בהתבסס על מרחק ומהירות זרימת הדם, CTCs עשויים להסתובב בחופשיות רק למשך שניות בין תקופות אלה של מלכוד, אם כי תיאור כמותי של התנהגות זו חסר¹³.

יתר על כן, בהתאם למקום שבו CTCs להיכנס למחזור הדם, הם עשויים לעבור דרך מיטות נימים מרובים בריאה ואתרים היקפיים אחרים ודרך הלב הימני והשמאלי לפני שהגיע ליעד הסופי שלהם. לאורך הדרך, CTCs חשופים ללחצים המודינמיים שונים כולל לחץ גיסת נוזלים (FSS), כוחות דחיסה במהלך ההשתלטות שלהם במיקרו-סירקולציה, ופוטנציאל, כוחות המתיחה בנסיבות שבהן הם עשויים להפגין לויקוציטים דמויי גלגול לאורך קירות כלי הדם¹⁴. לכן, הן את היכולת לדגמן את זרימת הדם ואת ההבנה של התנהגות CTC להיות מודל מוגבל. בגלל אי הוודאות הזו, כל ממצא ממערכות מודל במבחנה צריך להיות מאומת באורגניזם בעל חוליות ניסיוני ובסופו של דבר, בחולי סרטן.

עם האזהרות הנ"ל, מאמר זה מדגים מודל פשוט יחסית להחיל FSS על תאים בהשעיה כדי לחקור את ההשפעות של FSS על CTCs שתואר לראשונה בשנת 2012¹⁵. FSS נובע חיכוך של זרימת הדם על קיר כלי הדם, אשר מייצר שיפוע מהירות פרבולית בתנאים של זרימת למינאר בכלי גדול יותר. תאים חווים רמות גבוהות יותר של FSS ליד קירות כלי דם ורמות נמוכות יותר ליד מרכז כלי הדם. צמיגות נוזלים, קצב זרימה וממדים של הצינור שדרכו מתרחשת הזרימה משפיעים על FSS, כפי שתואר על ידי משוואת האגן-פויזאויל. זה חל על זרמי דם מתנהג כמו נוזלים ניוטוניים, אבל לא מחזיק עבור microcirculation. FSS פיזיולוגי נע על פני מספר סדרי גודל עם הרמות הנמוכות ביותר בלימפטיקה (<1^דיין/ ס"מ 2 ) ואת הגבוה ביותר באזורים סביב שסתומי לב ולוחות טרשת עורקים (>500 דיין / ס"מ²)⁵. לחץ גיסת קיר ממוצע בעורקים הוא 10-70 צביעה / ס"מ² ו 1-6 גוסן / ס"מ² בוורידים^16,17.

בלב, תאים עשויים להיות חשופים לזרימות סוערות סביב עלוני שסתום שבהם ברמה גבוהה מאוד, אבל FSS לטווח קצר מאוד עשוי להיות מנוסה^18,19. למרות שתחום עיבוד ביולוגי חקר זה מכבר את ההשפעות של FSS על תאי יונקים בהשעיה, מידע זה עשוי להיות בעל ערך מוגבל להבנת ההשפעות של FSS על CTCs כפי שהוא מתמקד בדרך כלל ברמות נמוכות בהרבה של FSS מיושם על משך זמן ארוך²⁰. כפי שתואר להלן, באמצעות מזרק ומחט, ניתן להחיל גבוה יחסית^(עשרותעד אלפי דיסים / ס"מ 2 ) FSS למשך קצר יחסית (אלפיות שניה) להשעיית תא. מאז התיאור הראשוני של מודל^{זה 15}, אחרים השתמשו בו כדי לחקור את ההשפעות של FSS על תאים סרטניים^21,22,23. "פולסים" מרובים של FSS ניתן להחיל על השעיות תאים בפרק זמן קצר כדי להקל על ניתוחים ניסיוניים במורד הזרם. לדוגמה, מודל זה יכול לשמש כדי למדוד את היכולת של תאים להתנגד הרס מכני על ידי FSS על ידי מדידת הכדאיות התא כפונקציה של מספר הפולסים מוחל. לחלופין, ניתן לחקור את ההשפעות של חשיפה ל- FSS על הביולוגיה של תאים סרטניים על ידי איסוף תאים למגוון ניתוחים במורד הזרם. חשוב לציין, חלק מההשעיה של התא שמור כפקד סטטי כדי להשוות את ההשפעות של FSS מאלה שעשויות להיות משויכות לניתוק תאים וזמן המוחזק בהשעיה.

Protocol

1. הכנת תאים

1. לשחרר תאים מצלחת תרבית רקמות כאשר 70-90% מפגש על ידי ביצוע ההנחיות המומלצות עבור קו התא בשימוש.
   1. לדוגמה, לשאוף את מדיום הצמיחה עבור תאי PC-3, ולשטוף את צלחת 10 ס"מ של תאים עם 5 מ"ל של סידן ומגנזיום ללא מגנזיום תמיסת מלח ללא פוספט (PBS).
   2. שאף את ה- PBS לפני הוספת 1 מ"ל של טריפסין של 0.25% באמצעות פרוטוקול היצרן.
   3. לאחר התבוננות בניתוק התאים תחת מיקרוסקופ הפוך, הוסף 5 מ"ל של DMEM:F12 בינוני המכיל סרום בקר עוברי 10% כדי לעכב את טריפסין.
2. מניחים את התלוי של התא לתוך צינור חרוטי.
3. קבע את ריכוז התא ואת מספר התא הכולל.
4. תאי גלולה לפי צנטריפוגה (300 × גרם למשך 3 דקות), שואפים את supernatant, ותאים resuspend בתרבית רקמות ללא סרום בינוני עד 5 × 10⁵ תאים / מ"ל.
   הערה: זה קריטי כי מדיום לבדיקה מכיל לפחות 1.17 mM Ca⁺⁺ כמו Ca⁺⁺ חוץ תאי הוכח להיות נדרש עבור התנגדות סלולרית FSS¹⁵.

2. חשיפה ללחץ גזל

1. לפני חשיפת תאים ל- FSS, לחתוך צינור פוליסטירן 14 מ"ל עגול בקו 7 מ"ל. מערבבים את ההשעיה של התא, מניחים 5 מ"ל של המתלה לתוך הצינור החתוך, ולאסוף דגימות שליטה סטטית.
   הערה: אמצעי האחסון הדרוש לאיסוף עבור המדגם הסטטי תלוי במבחן הכדאיות המשמש (ראה שלב 3).
2. צייר את השעיית התא למזרק 5 מ"ל, ולחבר מחט 30 G 1/2 ". לפרוק את המחט, למקם את המזרק על משאבת מזרק, לאבטח את המזרק, ולהגדיר את קצב הזרימה כדי להשיג את הרמה הרצויה של FSS.
   הערה: טבלה 1 מציגה את הלחץ המרבי של הטיית הקיר עבור מחטים וקצבי זרימה שונים, כמו גם את הרמה המינימלית של FSS בהתאם לגודל התא (10, 15 ו -20 מיקרומטר). בדוק את המחט לפני השימוש כדי להבטיח כי הוא לא כפוף; אם לא בטוח, להחליף את המחט עם אחד חדש. שלמות המחט יכולה להיות השפעה משמעותית על רמת FSS מיושם.
3. הפעל את משאבת המזרק, ולאסוף את המדגם גיה בצינור לחתוך בזווית של 45 ° כ כדי להפחית קצף. לאסוף מדגם בהתאם לסוג של קיימא assay או במורד הזרם assay הצרכים.
   1. הסר בזהירות את המזרק והמחט ממשאבת המזרק, והשתמש בצבת כדי להסיר את המחט מהמזרק, תוך הקפדה לא לגעת במחט.
      הערה: ניתן להשתמש במחטים שאינן משופעות לסירוגין עם מחטים משופעות כאמצעי בטיחות נוסף.
4. משכו את ההשעיה הנמרצת בחזרה למזרק, חיברו מחדש בזהירות את המחט באמצעות צבת, והחזירו אותה למשאבת המזרק.
5. חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4 עד להשעיית התא נחשף למספר הפולסים הרצוי של FSS.
   הערה: כדי להעריך את היכולת של תאים להתנגד הרס מכני מחשיפה FSS ההשעיה התא בדרך כלל נתון 10 פולסים של FSS. עם זאת, הוכח כי תאים מתחילים לעבור התאמות ביולוגיות בתגובה FSS לאחר 2 פולסים²⁴.

3. מדידת כדאיות

הערה: הכדאיות ניתן להעריך באמצעות בדיקות אנזימטיות (לוציפראז, resazurin, ו WST-1), ספירת תאים שלמים, ציטומטריית זרימה, או על ידי בדיקות קלונוגניות.

1. עבור כל מדדי הכדאיות, לאסוף מדגם לפני חשיפת תאים FSS.
   1. לבדיקות אנזימטיות, יש לקחת 100 עליקוטים כפולים של μL ולהכניס אותם לצלחת של 96 בארות.
   2. עבור ציטומטריית זרימה, לקחת aliquot אחד 500 μL ולהניח אותו לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   3. לבדיקה קלוגוגנית, לאסוף aliquot 100 μL.
2. אסיימטי
   1. לאסוף 100 דגימות μL לאחר 1, 2, 4, 6, 8, ו 10 פולסים של חשיפה FSS למקם אותם בצלחת 96-well.
   2. הוסף את המצע הרצוי, ופעל לפי הפרוטוקול עבור ההסתה שבה נעשה שימוש:
      1. עבור resazurin, להוסיף 20 μL של פתרון 0.15 מ"ג / מ"ל לכל באר. הוסף 20 μL של 0.15 מ"ג / מ"ל resazurin פתרון לבארות המכילות 100 μL של בינוני לבד. דגירה במשך 2 שעות באינקובטור תרבית רקמות 37 °C.C. מדוד את הספיגה באמצעות קורא לוחות המסוגל לקרוא פלואורסצנטיות (579 עירור / 584 פליטה).
      2. עבור תאים מבטאים לוציפראז, להוסיף 100 μL של 15 מ"ג / מ"ל D-לוציפרין ל 5 מ"ל של בינוני. הוסף 100 μL של פתרון זה לכל תאים המכילים היטב. המתן 5 דקות ולאחר מכן קרא את הצלחת באמצעות קורא התואם לאור.
      3. עבור WST-1, הוסף 10 μL של WST-1 לכל באר, כולל בארות המכילות בינוני בלבד. דגירה במשך 4 שעות, ולאחר מכן לקרוא את הספיגה בין 420 ל 480 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
   3. השווה את האות הממוצע מכל אחת מהדגימות שנחשפו ל- FSS לדגימת הבקרה הסטטית הממוצעת כדי להשיג את אחוז התאים הנים.
3. ציטומטריית^{זרימה 24}
   1. לאסוף 500 דגימות μL ולהניח אותם לתוך צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל לאחר 1, 2, 5, ו 10 פולסים של FSS.
   2. דגימות צנטריפוגות (500 × גרם למשך 3 דקות), ומשליכים את דגימות העל.
   3. יש להזרים את הכדורים עם 1 מ"ל של PBS נטול סידן ומגנזיום, ולצבוע את הדגימות (300 × גרם למשך 3 דקות).
   4. השהה את הכדורים עם 500 μL של חיץ מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (PBS עם אלבומין סרום בקר 0.5% ו 0.1% נתרן אזיד) עם ספירת חרוזים וצבעים בלתי חדירים או קיימא כגון פרופיליום יודיד (1.75 מיקרוגרם / מ"ל).
   5. לקבוע את הכדאיות על ידי השוואת היחס של תאים קיימא, מנורמל לספור חרוזים, בדגימות גיזום לזה של המדגם הסטטי.
4. צ'ק קלונוגני
   1. קח 100 μL של המדגם הסטטי, ולהוסיף 900 μL של בינוני צמיחה כדי להפוך דילול 1:10.
   2. קח 100 μL של המדגם מדולל 1:10, ולהוסיף 900 μL של בינוני צמיחה כדי להפוך את דילול הסופי 1:100.
   3. הוסף 100 μL של מדגם דילול 1:100 לתוך כל אחת מ 3 בארות של צלחת 6-well המכיל 2 מ"ל של מדיום צמיחה.
   4. חזור על שלבים 3.4.1-3.4.3 עם דגימות שהיו כפופות ל -10 פולסים של FSS.
   5. תן לתאים לגדול במשך 7-10 ימים מבלי לשנות את המדיום, ולבדוק היווצרות המושבה. לאחר מושבות של ≥50 תאים נוצרו, לשאוף את מדיום הצמיחה, לשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של PBS, לשאוף PBS, ולתקן במשך 5 דקות באמצעות 1 מ"ל של קר כקרח 70% אתנול (EtOH). חשוב לציין, לתקן הן דגימות גיהה וסטטי באותו זמן
   6. לאחר תיקון הדגימות, לשאוף EtOH, ולהוסיף 1 עד 2 מ"ל של פתרון סגול קריסטל (0.1% סגול קריסטל ב 90% H₂O, 10% EtOH) במשך 5 דקות.
   7. לשטוף עם עודף מים, ולתת את הצלחת יבשה
   8. ספירת המושבות (אשכולות של ≥50 תאים) עבור הדגימות הסטטיות והן עבור הדגימות הגוזבות. השווה את היחס בין המספר הממוצע של מושבות מהדגימה הנמרצת למספר הממוצע של מושבות מהדגימה הסטטית כדי לקבוע את הכדאיות.

תוצאות

עמידות מוגברת להרס מכני שנגרם על ידי FSS הוכח בעבר פנוטיפ שמור על פני קווי תאים סרטניים מרובים ותאים סרטניים מבודדים טריים מגידולים ביחס משווים תאי אפיתל שלא השתנו^15,24. כאן, שורות תאים סרטניים נוספים ממגוון מקורות רקמות (טבלה 2) נבדקו כדי להוכיח כי רוב...

Discussion

מאמר זה מדגים את היישום של FSS לתאים סרטניים בהשעיה באמצעות מזרק ומחט. באמצעות מודל זה, תאים סרטניים הוכחו עמידים יותר לפולסים קצרים של FSS ברמה גבוהה ביחס לתאי אפיתל שאינם שעברו טרנספורמציה^15,22,24. יתר על כן, חשיפה FSS באמצעות מודל זה גורמת לעלי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005