주사기와 바늘을 사용하여 순환 종양 세포에 혈역학 적 스트레스의 효과 모델링

요약

여기서 우리는 순환 종양 세포에 대한 혈역학 적 스트레스의 효과를 모델링하기 위해 현탁액의 암세포에 유체 전단 스트레스를 적용하는 방법을 시연한다.

초록

전이 도중, epithelia를 포함하여 고체 조직에서 암세포는, 혈역학 적인 흐름 때문에 기계적인 긴장에 드러나는 림프및 조혈 순환에 접근을 얻습니다. 순환 종양 세포 (CtC) 경험 이러한 스트레스 중 하나는 유체 전단 스트레스 (FSS)입니다. 암세포는 간질 적인 흐름 때문에 종양 내의 FSS의 낮은 수준을 경험할 수 있는 동안, CTC는, 세포외 매트릭스 부착 없이, FSS의 훨씬 더 중대한 수준에, 드러냅니다. 생리학적으로, 금감원은 3~4배 이상의 크기로 림프제(<1dyne/cm2)에 존재하는 낮은수준과 세포가 심장을 통과하고 심장 판막(>500dynes/cm^2)을통과할 때 가장 높은 수준이 간략하게 존재한다. 다양한 시간 프레임에 걸쳐 다양한 범위의 생리 전단 응력을 모델링하도록 설계된 몇 가지 체외 모델이 있습니다. 이 논문은 간단한 주사기 및 바늘 시스템을 사용하여 암 세포 생물학에 대한 높은 수준의 FSS의 짧은 (밀리초) 펄스의 결과를 조사하는 모델을 설명합니다.

서문

전이, 또는 초기 종양 부위를 넘어 암의 확산은 암 사망률^1의근본적인 주요 인자이다. 전이 중, 암세포는 순환 계통을 고속도로로서 활용하여 몸 전체에 먼 부위로 전파한다^2,3. 이러한 사이트로 가는 도중에, 순환 종양 세포(CtC)는 그들의 원래 1차종양^3,4,5와는 달리 동적 유체 미세 환경 내에 존재한다. 이 유체 미세 환경은 전이^4에많은 장벽 중 하나입니다 제안되었습니다. 전이성 비효율성의 개념, 즉, 순환을 입력하는 대부분의 CtC가 멸망하거나 생산적인 전이성 콜로니^6,7,8을형성하지 않는다는^개념에대한 광범위한 합의가 있다. 그러나, 왜 전이개별 CTC의 관점에서 비효율적이다는 것은 덜 확실하고 조사의 적극적인 영역으로 남아 있습니다. CTC는 세포외 매트릭스로부터 분리되고, 1차 종양에 존재할 수 있는 수용성 성장 및 생존 인자를 박탈하고, 1차 종양^4와는 훨씬 다른 방식으로 면역 계통 및 혈역학력에 노출된다. 이러한 요인의 각각은 CtC의 가난한 생존에 기여할 수 있습니다,하지만 그들의 상대적 기여는 불분명하다. 이 백서는 혈역학적 힘이 CTC에 미치는 영향에 대한 문제를 다룹니다.

CTC에 대한 혈역학적 힘의 영향을 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 현재, 전체 현부종 역학 (모세 혈관에 심장) 및 인간 혈관 시스템의 유변학적 특성을 복제 할 수있는 체외 시스템에 엔지니어링 된 이 없습니다. 또한 CtC가 순환 시스템을 어떻게 경험하는지 완전히 명확하지는 않습니다. 실험적인 기록은 대부분의 암세포가 혈액 세포 같이 연속해서 순환하지 않는다는 것을 표시합니다. 오히려, 비교적 큰 크기(직경 10-20 μm)로 인해 대부분의 CTC는 모세관 침대(직경 6-8 μm)에 갇혀 가변 길이(들에서 일)에 대해 죽거나 사치스라우거나 다음 모세혈관 침대^8,9,10,11로변위된다. 그러나 CTC 크기가 생체 내에서 더 이질적일 수 있으며 더 작은 CTC가^12를검출할 수 있다는 몇 가지 증거가 있습니다. 따라서 거리 및 혈류 속도에 따라 CTC는 이러한 함정 기간 사이에 몇 초 동안만 자유롭게 순환할 수 있지만 이러한 행동에 대한 정량적 설명은^13이부족합니다.

또한, CtC가 혈액 순환을 입력하는 위치에 따라, 그들은 폐 및 기타 주변 부위의 여러 모세관 침대를 통과하고 최종 목적지에 도달하기 전에 오른쪽과 왼쪽 심장을 통과 할 수 있습니다. 길을 따라, CTC는 유체 전단 응력 (FSS), 마이크로 순환에 자신의 함정 동안 압축 력, 잠재적으로, 그들은 혈관 벽을 따라 백혈구와 같은 롤링을 나타낼 수있는 상황에서 견인 력을 포함하여 다양한 혈역학 적 스트레스에^{노출된다 14.} 따라서, 모델링할 CTC 동작의 순환 및 이해를 모델링하는 능력은 모두 제한적이다. 이 불확실성 때문에, 체외 모형 시스템에서 어떤 사실 인정든지 실험적인 척추동물 유기체에서 그리고 궁극적으로, 암 환자에서 확인되어야 합니다.

앞서 언급한 주의 사항으로, 이 논문은 2012년^15년에처음 설명된 CTC에 대한 FSS의 효과를 조사하기 위해 현탁액의 세포에 FSS를 적용하는 비교적 간단한 모델을 보여 준다. 금감원은 혈관 벽에 대한 혈류의 마찰로 인해 더 큰 혈관의 라미나르 흐름 조건에서 포물선 속도 그라데이션을 생성합니다. 세포는 혈관 벽 근처 FSS의 상부를 경험하고 혈관의 중심 근처 낮은 수준. 하겐-포수유 방정식에 의해 설명된 바와 같이, 흐름이 발생하는 도관의 유체 점도, 유량 및 치수는 FSS에 영향을 미친다. 이것은 뉴턴 액체로 행동하는 혈액 흐름에 적용되지만 미세 순환을 위해 보유하지 않습니다. 생리적 금감원은 림프계(<1dyn/cm^2)에서가장 낮은 수준과 심장 판막 및 죽상 경화성 플라크(>500 dyn/cm^2)5에서가장 높은 수준으로 여러 수주 이상의 크기를 다양하게 다양하게 다수 범위로 한다. 동맥의 평균 벽 전단 응력은 10-70 dyn/cm² 및 1-6 dyn/cm² in 정맥^16,17이다.

심장에서, 세포는 매우 높은 수준의 밸브 전단지 주위의 난류 흐름에 노출될 수 있지만, 매우 짧은 기간 FSS는^18,19를경험할 수 있다. 바이오프로시전은 오랫동안 FSS가 현탁액의 포유류 세포에 미치는 영향을 연구해 왔지만, 이 정보는 일반적으로^{장기간 20에}걸쳐 적용되는 FSS의 훨씬 낮은 수준에 초점을 맞추고 있기 때문에 CtC에 대한 FSS의 효과를 이해하기 위한 제한된 가치일 수 있다. 아래에 설명된 바와 같이, 주사기와 바늘을 사용하여, 세포 현탁액에 상대적으로 짧은 (밀리초) 기간 동안 상대적으로 높은 (수만 ~ 수천 개의 다인/cm²⁾FSS를 적용할 수 있다. 이^{모델(15)의}초기 설명 이후, 다른 사람들은^{암세포(21,22,23)에}대한 FSS의 효과를 연구하기 위해 이를^{채택하였다.} FSS의 여러 "펄스"는 다운스트림 실험 분석을 용이하게하기 위해 짧은 기간 동안 세포 현탁액에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 모델은 적용된 펄스 수의 함수로서 세포 생존가능성을 측정하여 FSS에 의한 기계적 파괴에 저항하는 세포의 능력을 측정하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, FSS 노출이 암세포의 생물학에 미치는 영향은 다양한 다운스트림 분석을 위해 세포를 수집하여 탐구할 수 있다. 중요한 것은, 셀 서스펜션의 일부는 정지에 보관된 세포 분리 및 시간과 연관될 수 있는 것과 FSS의 효력을 비교하기 위하여 정적 제어로 예약됩니다.

프로토콜

1. 셀 준비

1. 사용 중 세포주에 대한 권장 지침을 준수하여 70-90% 컨실업할 때 조직 배양 접시에서 세포를 방출한다.
   1. 예를 들어, PC-3 세포의 성장 배지를 흡인시키고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 식염수(PBS)의 5mL로 세포의 10cm 접시를 세척한다.
   2. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 0.25 %의 트립신1 mL을 추가하기 전에 PBS를 흡입하십시오.
   3. 반전 된 현미경하에서 세포의 분리를 관찰 한 후, 트립신을 억제하기 위해 10 % 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM: F12 배지의 5 mL을 추가합니다.
2. 세포 현탁액을 원문 튜브에 넣습니다.
3. 세포 농도 와 총 세포 수를 결정합니다.
4. 펠릿 세포는 원심분리(3분 × g)에 의해, 수퍼나탄을 흡인시키고, 혈청이 없는 조직 배양 배지에서 세포를 5×¹⁰⁵ 세포/mL로 재분리한다.
   참고: 분석 매체는 세포외 Ca^++가 FSS^15에대한 세포 저항에 필요한 것으로 입증되었기 때문에 적어도 1.17 mM Ca^++를 포함하는 것이 중요합니다.

2. 유체 전단 응력 노출

1. FSS에 세포를 노출하기 전에, 7 mL 라인에서 라운드 하단 14 mL 폴리스티렌 튜브를 잘라. 셀 서스펜션을 혼합하고, 서스펜션의 5mL를 절단 튜브에 배치하고, 정적 제어 샘플을 수집합니다.
   참고: 정적 샘플에 대해 수집하는 데 필요한 볼륨은 사용된 실행 가능성 분석(3단계 참조)에 따라 달라집니다.
2. 셀 서스펜션을 5mL 주사기로 끌어넣고 30 G 1/2" 바늘을 부착합니다. 바늘을 풀고 주사기를 주사기 펌프에 놓고 주사기를 고정하고 유량을 설정하여 원하는 수준의 FSS를 달성합니다.
   참고: 표 1은 다른 바늘과 유량에 대한 최대 벽 전단 응력뿐만 아니라 세포 크기(10, 15 및 20 μm)에 따라 최소 수준의 FSS를 보여줍니다. 바늘이 구부러지지 않도록 사용하기 전에 바늘을 검사하십시오. 확실하지 않은 경우 바늘을 새 바늘로 교체하십시오. 바늘 무결성은 적용된 FSS 수준에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
3. 주사기 펌프를 실행하고, 발포를 줄이기 위해 약 45 ° 각도에서 절단 튜브에서 시어드 샘플을 수집합니다. 생존 가능성 분석 또는 다운스트림 분석 요구 유형에 따라 샘플을 수집합니다.
   1. 주사기 펌프에서 주사기와 바늘을 조심스럽게 제거하고 펜치를 사용하여 주사기에서 바늘을 제거하여 바늘을 만지지 않도록주의하십시오.
      참고: 비beveled 바늘추가 안전 측정으로 beveled 바늘과 상호 교환적으로 사용할 수 있습니다.
4. 시어드 서스펜션을 주사기에 다시 넣고 펜치를 사용하여 바늘을 조심스럽게 다시 부착하고 주사기 펌프에 다시 넣습니다.
5. 세포 현탁액이 원하는 수의 FSS에 노출될 때까지 2.3 및 2.4단계를 반복한다.
   참고: FSS 노출로부터 기계적 파괴에 저항하는 세포의 용량을 평가하기 위해 세포 현탁액은 전형적으로 FSS의 10 펄스를 받게 된다. 그러나, 세포가 2펄스²⁴후에 FSS에 반응하여 생물학적 적응을 시작하기 시작한다는 것이 입증되었다.

3. 생존력 측정

참고: 생존능력은 효소 분석(루시파아제, 레사쥐린 및 WST-1), 그대로 셀, 유동 세포측정, 또는 클로노제닉 분석으로 계산하여 평가될 수 있다.

1. 생존가능성의 모든 측정을 위해, FSS에 세포를 노출하기 전에 샘플을 수집합니다.
   1. 효소 적 인 에세이의 경우 중복 100 μL 알리코를 가져 와서 96 웰 플레이트에 넣습니다.
   2. 유동 세포측정을 위해 500 μL 알리쿼트 1개를 받아 1.5mL 튜브에 넣습니다.
   3. clonogenic 분석의 경우 100 μL 알리쿼트를 수집합니다.
2. 효소 분석
   1. 1, 2, 4, 6, 8 및 10 펄스 후 100 μL 샘플을 수집하고 96웰 플레이트에 넣습니다.
   2. 원하는 기판을 추가하고 사용된 분석서에 대한 프로토콜을 따릅니다.
      1. resazurin의 경우 각 웰에 0.15 mg/mL 용액의 20 μL을 추가합니다. 0.15 mg/mL resazurin 용액의 20 μL을 중간 100 μL만 포함하는 우물에 추가합니다. 37°C 조직 배양 인큐베이터에서 2h에 대한 인큐베이션을 한다. 형광을 판독할 수 있는 플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정합니다(579 엑아지션/584 배출).
      2. 루시파아제를 표현하는 세포의 경우, 15 mg/mL D-루시퍼린의 100 μL을 배지 5mL에 추가합니다. 해당 용액의 100 μL을 각 우물에 셀을 포함합니다. 5 분 기다린 다음 발광과 호환되는 판독기를 사용하여 접시를 읽으십시오.
      3. WST-1의 경우 배지만 함유된 우물을 포함하여 각 웰에 WST-1 1의 10 μL을 추가합니다. 4시간 동안 배양한 다음 플레이트 판독기를 사용하여 420~480nm 사이의 흡광도를 읽습니다.
   3. FSS에 노출된 각 샘플의 평균 신호를 평균 정적 제어 샘플과 비교하여 실행 가능한 셀의 백분율을 얻습니다.
3. 유동 세포측정제²⁴
   1. 500μL 샘플을 수집하고 FSS의 1, 2, 5 및 10 펄스 후 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 배치합니다.
   2. 원심분리기 샘플(500 × g 3분)을 제거하고 초월제를 폐기합니다.
   3. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS1mL로 펠릿을 회수하고 시료(3분 동안 300g ×)를 원심분리합니다.
   4. 500μL의 형광 활성 세포 선별(FACS) 버퍼(PBS 0.5% 소 세럼 알부민 및 0.1% 나트륨 아지드)로 펠릿을 일시 중단하여 구슬과 멤브레인 불투과성 또는 생존성 염료(1.75 μg/mL)를 계산합니다.
   5. 미리 식 샘플에서 구슬계로 정규화된 실행 가능한 셀의 비율을 정적 샘플과 비교하여 생존가능성을 결정합니다.
4. 클로노제닉 분석
   1. 정적 샘플의 100 μL을 취하고 성장 배지 900 μL을 추가하여 1:10 희석을 합니다.
   2. 1:10 희석된 시료의 100 μL을 취하고, 900 μL의 성장 매체를 추가하여 최종 1:100 희석을 합니다.
   3. 1:100 희석 샘플의 100 μL을 2mL의 성장 매체를 포함하는 6웰 접시 3개의 우물에 넣습니다.
   4. FSS의 10 펄스를 실시한 샘플과 함께 3.4.1-3.4.3 단계를 반복합니다.
   5. 세포를 배지를 변경하지 않고 7-10 일 동안 성장하고 식민지 형성을 확인하십시오. 일단 ≥50 세포의 식민지가 형성되면, 성장 배지를 흡인하고, PBS의 1mL로 각각 잘 헹구고, PBS를 흡인하고, 얼음 감기 70% 에탄올(EtOH)의 1mL를 사용하여 5분 동안 수정한다. 중요한 것은, 동시에 전단 및 정적 샘플을 모두 수정합니다.
   6. 시료를 고정한 후 EtOH를 흡인하고, 크리스탈 바이올렛 용액 1~2mL(90% H₂O, 10% EtOH)를 5분 동안 첨가한다.
   7. 물을 과도하게 헹구고 접시를 건조시키십시오.
   8. 정적 및 전단 시료 모두에 대한 콜로니(≥50 셀 의 클러스터)를 계산합니다. 전단 시료의 평균 식민지 수의 비율을 정적 샘플의 평균 콜로니 수와 비교하여 생존 가능성을 결정합니다.

결과

FSS 유도 된 기계적 파괴에 대한 높은 저항은 이전에 비 변형 상피 세포 비교기^(15,24)에비해 종양으로부터 갓 분리 된 다중 암 세포 주 및 암 세포에 걸쳐 보존 된 표현형으로 나타났다. 여기서, 다양한 조직 기원으로부터의 추가 암 세포주(표2)는이들 세포의 대부분이 250 μL/s에서 FSS의 10펄스 후 20%≥ 표시한다는 것을 입증하기 위해 시험되었?...

토론

이 논문은 주사기와 바늘을 사용하여 현탁액의 암세포에 FSS의 적용을 보여줍니다. 이 모델을 사용하여, 암세포는 비변형 상피^{세포(15,22,24)에}비해 높은 수준의 FSS의 짧은 펄스에 더 저항하는 것으로 나타났다. 더욱이, 본 모델을 이용한 금감원에 노출되면 세포 강성, RhoA의 활성화, 피질 F-액틴 및 미오신 II 기반 수축도

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005